林小聰 ，李寧 ，符偉玉 ，蘭柳波 ，張海濤 ，張宇明

（1.廣東醫(yī)科大學(xué) 生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究所，廣東 湛江 524023；2.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 血液科，廣東 湛江 524001）

急性單核細(xì)胞白血病全基因組微小RNA的表達(dá)譜分析*

林小聰1，李寧2，符偉玉1，蘭柳波1，張海濤1，張宇明2

（1.廣東醫(yī)科大學(xué) 生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究所，廣東 湛江 524023；2.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 血液科，廣東 湛江 524001）

目的研究急性單核細(xì)胞白血?。ˋMoL）全基因組的微小RNA（miRNA）表達(dá)譜。方法應(yīng)用Illumina高通量測序技術(shù)對10例AMoL患者和10例非惡性血液病患者骨髓樣本的miRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測，分析兩者的表達(dá)差異，并通過莖環(huán)引物實(shí)時熒光定量 PCR（Stem-loop qPCR）技術(shù)對部分Illumina測序結(jié)果進(jìn)行驗證。結(jié)果兩組樣本共發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的miRNA 285個，其中，199個miRNA在AMoL組呈表達(dá)上調(diào)，86個miRNA呈表達(dá)下調(diào)。6個miRNA的Stem-loop qPCR驗證結(jié)果與其測序結(jié)果具有相同的變化趨勢。結(jié)論miR-126-3p和miR-29b-3p可作為潛在的分子靶點(diǎn)用于AMoL發(fā)病機(jī)制的進(jìn)一步研究。

急性單核細(xì)胞白血??；微小RNA；測序

急性單核細(xì)胞白血?。╝cutemonocytic leukemia，AMoL）為急性髓性白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）最常見的亞型之一；其病例數(shù)約占AML 20%～30%，在各種AML亞型中居第2位[1]。相比于其他的AML亞型，AMoL高白細(xì)胞血癥、髓外浸潤以及不良染色體核型的發(fā)生率更高，常規(guī)化療完全緩解率低、容易復(fù)發(fā)及預(yù)后不佳[1-2]。目前，AMoL的發(fā)病機(jī)制仍未完全明確，可能與電離輻射、染色體異常及基因突變等多種因素有關(guān)[3]。為尋找新的治療靶點(diǎn)，迫切需要對AMoL的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步研究。微小 RNA（micro ribonucleic acid，miRNA）是一類內(nèi)源性、具有基因表達(dá)調(diào)控功能的小分子單鏈非編碼RNA，長度約為 18～25 個核苷酸（nt）[4]。研究表明，miRNA與白血病發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，可能成為白血病潛在的治療靶點(diǎn)[5]。為闡明AMoL的miRNA表達(dá)譜，本研究應(yīng)用Illumina高通量測序技術(shù)對AMoL與對照組骨髓樣本的miRNA表達(dá)水平進(jìn)行對比分析，為研究AMoL相關(guān)發(fā)病機(jī)制和尋找新型的分子靶點(diǎn)提供新的線索。

1 資料與方法

1.1 研究對象

收集來自于廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院血液科10例AMoL患者（男性6例，女性4例；年齡14～64歲，平均41.2歲）和10例非惡性血液病對照者（骨髓象正常的貧血或發(fā)熱查因患者，男性6例，女性4例；年齡10～73歲，平均39.0歲）的骨髓樣本。所有AMoL患者均為初發(fā)病例，在采樣前均未接受放療或化療，且符合AMoL的診斷標(biāo)準(zhǔn)。本研究已獲得廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理學(xué)委員會審核批準(zhǔn)，并取得所有患者的知情同意。

1.2 主要試劑

無RNase的DnaseⅠ（購自美國Promega公司），Trizol試劑（購自美國Invitrogen公司），Small RNA測序接頭、TruSeq Rapid SR cluster試劑盒以及Tru Seq Rapid SBS試劑盒（美國Illumina公司產(chǎn)品），SuperscriptTMⅢ逆轉(zhuǎn)錄酶（購自美國Invitrogen公司），2×SYBR Green PCR混合液（美國 Applied Biosystems公司）。

1.3 方法

1.3.1 總RNA樣品的提取 根據(jù)Trizol試劑說明書抽提組織總RNA，以無RNase的DnaseⅠ消化以去除基因組DNA污染。20例RNA樣品分別以AMoL組和對照組為組單位等質(zhì)量混合，在230、260及280 nm波長以Nano Drop ND-1000型分光光度計測定其吸光度（A）值，計算RNA樣品的濃度并分析其純度，通過瓊脂糖凝膠電泳評估RNA的完整性。

1.3.2 Small RNAs文庫構(gòu)建和Illumina測序RNA樣品在T4RNA連接酶的催化下加上3’、5’small RNA測序接頭，所得產(chǎn)物經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增及聚丙烯胺凝膠電泳純化生成Small RNAs文庫。以Agilent 2100型生物分析儀對Small RNAs文庫進(jìn)行定量分析。應(yīng)用Illumina cBot簇生成系統(tǒng)，按照TruSeq Rapid SR cluster試劑盒說明書，對文庫進(jìn)行克隆擴(kuò)增；然后根據(jù)TruSeq Rapid SBS試劑盒說明書，在Illumina HiSeq 2000測序系統(tǒng)上行高通量深度測序。

1.3.3 測序數(shù)據(jù)的處理和注釋 以O(shè)ff-Line Basecaller軟件對高通量測序所生成的原始圖像進(jìn)行分析，讀取堿基序列信息并轉(zhuǎn)換為相應(yīng)的數(shù)據(jù)。然后，經(jīng)去接頭、去冗余、去低質(zhì)量以及去污染等處理，獲得16～30 nt長度的高質(zhì)量干凈序列并進(jìn)行序列長度分布分析。將干凈序列分別與RefSeq數(shù)據(jù)庫、Rfam數(shù)據(jù)庫以及RepBase數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列比對和分類注釋，去除mRNA、重復(fù)序列、tRNA、rRNA、snRNA以及sRNA等序列；余下序列再與miRBase數(shù)據(jù)庫中已知的人類pre-miRNA進(jìn)行序列比對和注釋，獲取兩樣本miRNA的表達(dá)豐度和染色體分布等信息。

1.3.4 miRNA的差異表達(dá)分析 首先對兩樣本miRNA的表達(dá)豐度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理 [公式：miRNA的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)豐度（normalization of the calculation of transcript parts per million，TPM）=miRNA 的表達(dá)豐度/樣本miRNA的總表達(dá)豐度×106]，然后再計算兩樣本的miRNA差異表達(dá)比值 [公式：miRNA的差異表達(dá)比值=（AMoL組miRNA標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)豐度值+10TPM）/（對照組miRNA標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)豐度值+10TPM）]。如果差異表達(dá)比值≤0.5或≥2.0，則為差異有統(tǒng)計學(xué)意義；如果0.5＜比值＜2.0則為差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

1.3.5 莖環(huán)引物實(shí)時熒光定量PCR（stem-loop primer-based quantitative real-time polymerase chain reaction，Stem-loop，qRT-PCR）利用 miRNA 的莖環(huán)（Stem-loop）逆轉(zhuǎn)錄引物，根據(jù)SuperscriptTMⅢ反轉(zhuǎn)錄酶說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。應(yīng)用ABI公司Prism7500型qRT-PCR儀，參照2×SYBR Green PCR混合液說明書，以U6 snRNA作為內(nèi)參照進(jìn)行qRT-PCR。反應(yīng)參數(shù)為：95℃預(yù)反應(yīng)10 min，使模板完全解鏈。然后95℃變性10s，60℃退火及延伸60s，重復(fù)40個循環(huán)。檢測結(jié)果計算采用常規(guī)的2-△△Ct法。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表達(dá)，比較用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 總RNA的質(zhì)量分析

提取的組織RNA樣品分別以AMoL組和對照組為組單位等量混合后，對其進(jìn)行純度分析（見表1）和RNA完整性分析（見圖1）。結(jié)果表明，其A260/A280比值都在1.8～2.0，且A260/A230比值都＞1.8，提示樣本RNA的純度較高、質(zhì)量良好。電泳結(jié)果顯示兩組總RNA均可見18和28 S 2條清晰的條帶，而5 S的條帶則比較模糊（見圖1）；提示RNA的完整性好。上述結(jié)果表明，總RNA的質(zhì)量符合實(shí)驗要求，可用于后續(xù)Small RNAs文庫的構(gòu)建。

2.2 Small RNAs文庫的質(zhì)量評估

以Agilent 2100型生物分析儀對Small RNAs文庫進(jìn)行質(zhì)量分析（見表2）。結(jié)果表明，兩樣本Small RNAs文庫的片段長度峰值均在130～155 nt且其摩爾數(shù)＞1 fmol，提示Small RNAs文庫的質(zhì)量良好，可用于后續(xù)的克隆擴(kuò)增和測序分析。

2.3 Small RNA干凈序列的長度分布和分類注釋

Small RNA干凈序列（16～30 nt）的長度分布分析表明，對照組及AMoL組的干凈序列均大致呈正態(tài)分布在22 nt序列兩側(cè)（見圖2）。其中，符合miRNA片段長度（18～25 nt）的干凈序列所占的比例最高，其在對照組與AMoL組分別占93.70%和82.31%。干凈序列的序列比對和分類注釋表明，miRNA在對照組（占80.05%）及AMoL組（占54.44%）所占的比例最高，兩者均＞50%（見圖3）。上述數(shù)據(jù)初步驗證Illumina測序結(jié)果的有效性。

表1 總RNA的純度分析

圖1 總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖

表2 Small RNAs文庫的定量分析

2.4 miRNA的差異表達(dá)譜分析

兩組樣本發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的miRNA 285個。其中，199個miRNA在 AMoL組呈表達(dá)上調(diào)，86個miRNA呈表達(dá)下調(diào)。hsa-miR-122-5p在AMoL組表達(dá)上調(diào)最顯著，而hsa-miR-941則表達(dá)下調(diào)最明顯。見表3。

圖2 Small RNA干凈序列的長度分布

圖3 匹配的干凈序列的分類注釋

表3 前10個表達(dá)上調(diào)和下調(diào)miRNA的差異

2.5 Stem-loop qRT-PCR驗證結(jié)果

為驗證Illumina測序結(jié)果的可靠性，筆者選擇2個表達(dá)上調(diào)（miRNA-155-5p和miRNA-221-3p）、2個表達(dá)下調(diào)（miRNA-106b-5p和miRNA-142-3p）以及2個表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義miRNA（miRNA-532-5p和miRNA-423-5p）進(jìn)行Stem-loop qRT-PCR驗證。結(jié)果表明，上述6個miRNA在兩組樣本中的變化趨勢與Illumina測序結(jié)果一致（見表4），說明Illumina測序結(jié)果可靠、有效。

表4 Illumina測序結(jié)果的Stem-loop qRT-PCR驗證

3 討論

作為一種具有基因表達(dá)調(diào)控功能的內(nèi)源性小片段單鏈RNA，miRNA與白血病關(guān)系密切。研究表明，＞60%的miRNA基因存在于白血病相關(guān)的染色體易位區(qū)，多種miRNA可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化及凋亡與耐藥等相關(guān)基因的表達(dá)在白血病發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，可能成為白血病潛在的診斷標(biāo)志物和分子靶點(diǎn)[6-7]。但目前尚無通過Illumina高通量測序技術(shù)在AMoL患者臨床樣本中系統(tǒng)性研究miRNA表達(dá)譜的報道。本結(jié)果表明，兩者的miRNA表達(dá)譜存在較大的差異，兩組樣本共鑒定差異表達(dá)的miRNA 285個，其中，199個miRNA在AMoL組呈表達(dá)上調(diào)，86個miRNA呈表達(dá)下調(diào)。筆者隨后選取6個miRNA，應(yīng)用Stem-loop qRT-PCR技術(shù)證實(shí)Illumina測序結(jié)果的可靠性。

miRNA-29b-3p是一種基因定位于染色體7q32和1q32的miRNA分子，在胃癌、前列腺癌及肺癌等多種實(shí)體瘤以及AML中呈低表達(dá)；在AML中，染色體7q缺失或CEBPA基因功能障礙可導(dǎo)致miRNA-29b-3p 表達(dá)下調(diào)[8]。GONG 等[9]報道，miRNA-29b-3p可通過作用于其靶基因CCND2和AKT2，抑制AMoL細(xì)胞系THP1增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究表明，miRNA-29b-3p在AMoL患者骨髓樣本中表達(dá)呈下調(diào)，與文獻(xiàn)報道基本相符，提示miRNA-29b-3p在AMoL發(fā)病機(jī)制中可能起一定的作用。相比于其他的AML亞型，miRNA-199b-5p在AMoL臨床樣本中呈異常低表達(dá)，并與AMoL患者預(yù)后呈正相關(guān)；組蛋白脫乙酰基酶抑制劑AR-42和Panobinostat可通過上調(diào)hsa-miRNA-199b-5p表達(dá)誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞凋亡[10]。筆者研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-199b-5p在AMoL樣本中也呈低表達(dá)，與文獻(xiàn)報道一致，提示miRNA-199b-5p可能與AMoL發(fā)病機(jī)制相關(guān)。

miRNA-126基因在染色體上定位于9q34.3，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為miRNA-126-5p和miRNA-126-3p。研究表明，miRNA-126-5p和miRNA-126-3p在AML中均呈高表達(dá)并與患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)[11]。LEEUW等[12]發(fā)現(xiàn)，沉默miRNA-126-3p表達(dá)可抑制THP1細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并抑制NOD/SCID小鼠移植瘤的生長。提示miRNA-126-3p在AMoL中可能具有潛在的癌基因活性。本組miRNA-126基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物miRNA-126-5p和miRNA-126-3p在AMoL中均呈表達(dá)上調(diào)，與文獻(xiàn)報道基本相符。HO等[13]報道，miRNA-135b-5p在依托泊甙以及替尼泊苷耐藥的白血病細(xì)胞中呈表達(dá)上調(diào)，其過表達(dá)可誘導(dǎo)白血病細(xì)胞對依托泊甙以及替尼泊苷產(chǎn)生耐藥性。此外，miRNA-135b-5p在AMoL細(xì)胞系U937以及THP-1中過表達(dá)均可下調(diào)Ppm1e并激活A(yù)MPK[14]。研究表明，AMPK激活在AMoL細(xì)胞凋亡過程中起重要作用；骨髓脂肪細(xì)胞β-氧化所介導(dǎo)AMPK的激活可抑制AMoL細(xì)胞凋亡并促進(jìn)細(xì)胞增殖[15]。本組miRNA-135b-5p在AMoL樣本中也呈高表達(dá)，與文獻(xiàn)報道基本相符，提示miRNA-135b-5p在AMoL細(xì)胞凋亡過程中可能起一定的抑制作用，具有潛在的研究價值。

綜上所述，AMoL患者與非惡性血液病對照者骨髓樣本的miRNA表達(dá)譜存在較大的差異。根據(jù)其差異表達(dá)趨勢與文獻(xiàn)報道的符合程度，筆者得到5個與AMoL發(fā)病機(jī)制有密切關(guān)系的miRNA（包括miRNA-29b-3p、miRNA-199b-5p、miRNA-126-3p、miRNA-126-5p 及 miRNA-135b-5p）。其中，miRNA-126-3p的差異表達(dá)比值最大，呈明顯的表達(dá)上調(diào)；而miRNA-29b-3p的差異表達(dá)比值最小，呈明顯的表達(dá)下調(diào)；再加上已有文獻(xiàn)證實(shí)兩者在AMoL細(xì)胞增殖和凋亡過程中具有重要作用。因此，miRNA-126-3p和miRNA-29b-3p可作為潛在的分子靶點(diǎn)用于AMoL發(fā)病機(jī)制的進(jìn)一步研究。

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（王榮兵 編輯）

Whole-genome analysis profile of MicroRNA in acute monocytic leukemia*

Xiao-cong Lin1,Ning Li2,Wei-yu Fu1,Liu-bo Lan1,Hai-tao Zhang1,Yu-ming Zhang2
(1.Institute of Biochemistry and Molecular Biology,Guangdong Medical University,Zhanjiang,Guangdong 524023,China;2.Department of Hematology,Affiliated Hospital of Guangdong Medical University,Zhanjiang,Guangdong 524001,China)

ObjectiveTo investigate the whole-genome MicroRNA (miRNA)profile in acute monocytic leukemia (AMoL).MethodsIllumina high-throughput sequencing technology was utilized to screen differentially expressed miRNA in bone marrow samples of 10 AMoL patients as well as 10 patients with non-malignant hematologic diseases.Stem-loop primer-based real-time quantitative polymerase chain reaction(Stem-loop qPCR)was carried out to validate the sequencing data.ResultsIn total of 285 differentially expressed miRNAs,199 up-regulated and 86 down-regulated miRNAs were identified in AMoL patients compared with the control group.Further stem-loop qPCR results confirmed similar expression of 6 miRNAs identified by sequencing.ConclusionsMiR-126-3p and miR-29b-3p can be potential targets for further study of AMoL.

acute monocytic leukemia;micro ribonucleic acid;sequencing

R394.3

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.27.007

1005-8982（2017）27-0032-05

2017-05-21

廣東省自然科學(xué)基金（No：2016A030313677）；廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)研究基金（No：A2016193）

張宇明，E-mail：13670982222@163.com