趙乃闊，胡慶軍，史朝暉

（1.河南省焦作市人民醫(yī)院 消化內(nèi)科，河南 焦作 454000；2.河南大學淮海醫(yī)院，河南 開封 475000）

下調(diào)α-catulin基因表達對胃癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響*

趙乃闊1，胡慶軍1，史朝暉2

（1.河南省焦作市人民醫(yī)院 消化內(nèi)科，河南 焦作 454000；2.河南大學淮海醫(yī)院，河南 開封 475000）

目的探討抑制α-catulin基因表達對胃癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響，以及可能的機制。方法培養(yǎng)人胃癌細胞SGC-7901，根據(jù)轉(zhuǎn)染物不同將細胞分為siRNA-α-catulin組、siRNA-對照序列組和空白對照組，MTT法檢測細胞增殖能力，Transwell法檢測細胞遷移和侵襲能力，Western blot檢測細胞中α-catulin、N-鈣粘蛋白（N-cadherin）、E-鈣粘蛋白（E-cadherin）和波形蛋白（Vimentin）表達。結(jié)果siRNA-α-catulin組細胞24、48、72及96 h時吸光度A值均低于siRNA-對照序列組和空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與siRNA-對照序列組和空白對照組比較，siRNA-α-catulin組遷移細胞數(shù)和侵襲細胞數(shù)均降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與siRNA-對照序列組和空白對照組比較，siRNA-α-catulin組細胞中α-catulin、N-cadherin及Vimentin蛋白相對表達量均降低，而E-cadherin蛋白相對表達量增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結(jié)論特異性沉默人胃癌細胞SGC-7901中α-catulin基因表達可有效抑制細胞增殖、遷移和侵襲能力，其機制可能與抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程有關(guān)。

胃癌；α-catulin；細胞增殖；細胞侵襲；上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化

R735.2

A

胃癌作為發(fā)病率高、致死率高的消化道惡性腫瘤，由于發(fā)病隱匿，早期癥狀不明顯且缺乏有效的篩查方法，多數(shù)患者臨床確診時已進展至中晚期，錯失最佳的治療時機[1]，即使患者接受手術(shù)切除治療，由于腫瘤復發(fā)、轉(zhuǎn)移率高，5年生存率僅20%左右[2]。目前，影響胃癌復發(fā)、轉(zhuǎn)移相關(guān)機制尚未完全清楚，因此，從分子生物學方面積極探討相關(guān)機制以指導治療，對延長患者生命，改善預后具有重要意義。αcatulin作為一種細胞骨架連接蛋白，在Rho信號通路中發(fā)揮重要作用，與炎癥反應、細胞凋亡、骨架重建、細胞遷移與侵襲以及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化等過程密切相關(guān)[3]，有研究指出[4]，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化在胃癌細胞轉(zhuǎn)移、侵襲、抗凋亡和耐藥中發(fā)揮重要作用。本研究擬利用小分子干擾RNA技術(shù)（small interference RNA，siRNA）特異性下調(diào)人胃癌細胞SGC-7901中α-catulin基因表達，探討其對細胞增殖、遷移及侵襲能力的影響，以及可能的機制，以期為胃癌機制研究提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和設備

人胃癌細胞SGC-7901（購自美國ATCC），RPMI 1640細胞培養(yǎng)基、優(yōu)質(zhì)胎牛血清及胰蛋白酶（購自美國Gibco公司），Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒（購自美國 Invitrogen公司），siRNA-α-catulin和siRNA-對照序列（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設計合成），MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒、ECL顯色試劑盒（購自碧云天生物技術(shù)公司），二甲基亞砜（DMSO）（購自北京索萊寶科技公司），Transwell小室（購自美國Corning公司），兔抗人α-catulin多克隆抗體（購自上海萬疆生物公司），兔抗人N-鈣粘蛋白（N-cadherin）多克隆抗體、鼠抗人E-鈣粘蛋白（E-cadherin）多克隆抗體（購自美國Santa Cruz公司），兔抗人波形蛋白（Vimentin）單克隆抗體（購自美國Cell Signaling公司），實時熒光定量PCR儀（購自ABI公司），凝膠電泳分析系統(tǒng)（購自美國Biorad公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和分組處理 將人胃癌細胞SGC-7901置于含10%胎牛血清的RPMI 1640細胞培養(yǎng)基中，于含5%二氧化碳CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞融合度達85%時，用胰酶消化后，傳代培養(yǎng)，取3～5代細胞進行實驗。按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書對細胞進行轉(zhuǎn)染，根據(jù)轉(zhuǎn)染物不同將細胞分為3組：①siRNA-α-catulin組。轉(zhuǎn)染α-catulin干擾序列：正向5'-CCAUUAACAUCAC CAACAATT-3'，反向 5'-UUGUUGGUGAUGUUAAU GGTT-3'；②siRNA-對照序列組。轉(zhuǎn)染陰性對照序列：正向 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'，反向 5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'；③空白對照組。不做任何處理。轉(zhuǎn)染后于含5%CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，完成后續(xù)實驗。

1.2.2 不同轉(zhuǎn)染組細胞增殖能力檢測 取各轉(zhuǎn)染組細胞，胰酶消化后，調(diào)整細胞密度為1.5×106個/ml，接種于96孔板，每孔100μl，于含5%CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)24、48、72和96 h時，向各孔加入 MTT 液（濃度 5 g/L）20 μl，37℃孵育6 h，去除上清液，再加入200 μl的DMSO，于搖床上振蕩15 min，使沉淀溶解充分，利用全自動酶標儀取490 nm波長處對各孔吸光度A值進行檢測。

1.2.3 Transwell法檢測細胞遷移能力 取各轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h細胞，調(diào)整細胞密度為1.5×106個/ml，取細胞懸液200μl加入Transwell小室上室，將600 μl含20%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液加入下室，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取出小室，用棉簽將上室中散落的細胞輕輕擦去，甲醇固定，結(jié)晶紫染色后，用倒置顯微鏡進行觀察，隨機選取5個高倍視野計數(shù)穿膜細胞數(shù)，取均值作為遷移細胞數(shù)[5]。

1.2.4 Transwell法檢測細胞侵襲能力 取Matrigel膠鋪于Transwell小室中，風干備用。其余步驟同1.2.3。

1.2.5 Western blot檢測各轉(zhuǎn)染組細胞中α-catulin、N-cadherin、E-cadherin和Vimentin蛋白表達 取各轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h細胞，加入細胞裂解液，用總蛋白提取試劑盒對細胞中總蛋白提取，利用BCA蛋白定量檢測試劑盒檢測蛋白純度并定量。取50μg總蛋白，進行SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用5%脫脂奶粉4℃封閉5 h，用TBST液漂洗3次，加入一抗兔抗人α-catulin多克隆抗體、兔抗人N-cadherin多克隆抗體、鼠抗人E-cadherin多克隆抗體、兔抗人Vimentin單克隆抗體（稀釋比例分別為1∶800、1∶500、1∶1 200 及 1∶1 000），4℃過夜孵育，TBST液漂洗3次，加入二抗，室溫下孵育4 h，利用ECL顯色試劑盒避光反應15min，拍照，利用Image J圖像分析軟件分析細胞中α-catulin、N-cadherin、E-cadherin和Vimentin蛋白相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較采用方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細胞增殖能力比較

siRNA-α-catulin組細胞 24、48、72和 96 h時吸光度A值均低于siRNA-對照序列組和空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），提示siRNA-αcatulin組細胞增殖能力被抑制，見圖1。

2.2 各轉(zhuǎn)染組細胞遷移和侵襲能力比較

3組轉(zhuǎn)染組遷移細胞數(shù)和侵襲細胞數(shù)差異有統(tǒng)計學意義（F=72.505和 99.266，均P=0.000），其中，與siRNA-對照序列組和空白對照組比較，siRNA-α-catulin組遷移細胞數(shù)和侵襲細胞數(shù)均降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表 1和圖 2、3。

2.3 各轉(zhuǎn)染組細胞中 α-catulin、N-cadherin、E-cadherin和Vimentin蛋白表達比較

3 組細胞中 α-catulin、N-cadherin、E-cadherin和Vimentin蛋白相對表達量差異有統(tǒng)計學意義（F=33.134、8.486、19.664 和 17.414，均P=0.000），其中，與siRNA-對照序列組和空白對照組比較，siRNA-α-catulin組細胞中 α-catulin、N-cadherin及 Vi-mentin蛋白相對表達量均降低，而E-cadherin蛋白相對表達量增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2和圖4。

圖1 各轉(zhuǎn)染組細胞增殖能力比較

表1 各轉(zhuǎn)染組細胞遷移和侵襲能力比較 （±s）

表1 各轉(zhuǎn)染組細胞遷移和侵襲能力比較 （±s）

注：1）與空白對照組比較，P＜0.05；2）與 siRNA-對照序列組比較，P＜0.05

組別 遷移細胞數(shù) 侵襲細胞數(shù)siRNA-α-catulin 組 117.6±8.21）2） 85.2±6.71）2）siRNA-對照序列組 179.5±10.7 144.1±10.2空白對照組 182.3±12.0 142.8±9.5 F值 72.505 99.266 P值 0.000 0.000

圖2 各轉(zhuǎn)染組細胞遷移能力比較 （結(jié)晶紫×400）

圖3 各轉(zhuǎn)染組細胞侵襲能力比較 （結(jié)晶紫×400）

表2 各轉(zhuǎn)染組細胞中α-catulin、N-cadherin、E-cadherin和Vimentin蛋白表達比較 （±s）

表2 各轉(zhuǎn)染組細胞中α-catulin、N-cadherin、E-cadherin和Vimentin蛋白表達比較 （±s）

注：1）與空白對照組比較，P ＜0.05；2）與 siRNA- 對照序列組比較，P ＜0.05

組別 α-catulin蛋白 N-cadherin蛋白 E-cadherin蛋白 Vimentin蛋白siRNA-α-catulin 組 0.26±0.071）2） 0.32±0.081）2） 0.59±0.121）2） 0.43±0.141）2）siRNA-對照序列組 0.73±0.10 0.64±0.13 0.36±0.08 0.79±0.13空白對照組 0.75±0.12 0.63±0.11 0.35±0.10 0.81±0.15 F值 33.134 8.486 19.664 17.414 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

圖4 各轉(zhuǎn)染組細胞中α-catulin、N-cadherin、E-cadherin和Vimentin蛋白表達

3 討論

胃癌發(fā)病率、致死率均位居我國消化道腫瘤首位，具有發(fā)病率高、確診晚、轉(zhuǎn)移率高及預后較差等特點[6]，研究表明[7]，胃癌復發(fā)、轉(zhuǎn)移是導致患者死亡的主要因素。因此，積極探討影響胃癌侵襲、轉(zhuǎn)移的相關(guān)機制對治療和預后具有重要意義。α-catulin作為Rho信號通路中重要組件，由CTNNAL1基因編碼，其蛋白結(jié)構(gòu)中含有與α-連環(huán)蛋白（α-actinin）和黏著斑蛋白（Vinculin）結(jié)合位點，與炎癥、細胞衰老、凋亡及骨架重構(gòu)等過程密切相關(guān)[8]，有研究指出[9]，αcatulin在頭頸部鱗癌中呈高表達。CAO等[10]指出，α-actinin與鱗狀細胞癌細胞遷移和侵襲密切相關(guān)，可作為癌癥患者預后的標志物和未來的治療靶標。本研究利用siRNA技術(shù)特異性沉默人胃癌SGC-7901細胞中α-catulin基因，結(jié)果顯示，siRNA-α-catulin組細胞中α-catulin蛋白表達量低于siRNA-對照序列組和空白對照組，提示細胞中α-catulin基因表達被成功抑制。

有研究指出[11]，α-catulin可通過改變細胞周期中的關(guān)鍵性基因而抑制腫瘤細胞衰老，加速細胞增殖。本研究MTT細胞增殖結(jié)果顯示，siRNA-αcatulin組細胞24、48、72和96h時吸光度A值均低于siRNA-對照序列組和空白對照組，說明特異性沉默胃癌細胞中α-catulin基因后，細胞增殖能力被抑制，提示α-catulin可能參與胃癌細胞增殖過程。本研究顯示，與siRNA-對照序列組和空白對照組比較，siRNA-α-catulin組遷移細胞數(shù)和侵襲細胞數(shù)均降低，說明特異性沉默胃癌細胞中α-catulin基因可有效抑制細胞遷移、侵襲能力。研究表明[12]，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化與腫瘤細胞增殖、遷移、侵襲能力密切相關(guān)。N-cadherin、E-cadherin和Vimentin是上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化特異性標志物，發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化時，N-cadherin、Vimentin表達升高，而E-cadherin表達被抑制[13]。本研究結(jié)果顯示，siRNA-α-catulin組細胞中N-cadherin、Vimentin蛋白表達被抑制，而E-cadherin蛋白表達量增加，說明特異性沉默α-catulin基因上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程被抑制。

綜上所述，特異性沉默人胃癌細胞SGC-7901中α-catulin基因表達可有效抑制細胞增殖、遷移和侵襲能力，其機制可能與抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程有關(guān)。

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（王榮兵 編輯）

Genetic inhibition ofα-catulinon proliferation,migration and invasion of gastric cancer cells*

Nai-kuo Zhao1,Qing-jun Hu1,Chao-hui Shi2
(1.Department of Gastroenterology,People's Hospital of Jiaozuo City,Jiaozuo,Henan 454000,China;2.Huaihai Hospital Affiliated to Henan University,Kaifeng,Henan 475000,China)

ObjectiveTo investigate the effect of genetic inhibition ofα-catulinon proliferation,migration and invasion of gastric cancer cells.MethodsHuman gastric cancer cell line SGC-7901 were cultured and were divided into siRNA-α-catulin group,siRNA sequence control group and negative control group.MTT and Trans well assay were performed to measure cell proliferation and cell invasion,respectively.The levels of α-catulin,N-cad herin,E-cad herin and Vimentin were determined by Western blot.ResultsMTT results indicated that optical density value at 24 h,48 h,72 h and 96 h in the siRNA-α-catulin group were significantly lower than that of siRNA-control sequence group and negative control group (P＜0.05).The amount of migrating cells and invasive cells in siRNA-α-catulin group were decreased dramatically compared with siRNA-control sequence group and blank control group (P＜ 0.05).Expression levels of α-catulin,N-cadherin and Vimentin in siRNA-α-catulin group decreased while E-cadherin increased significantly when compared with siRNA-control sequence group and blank control group (P＜0.05).Conclusion Genetic knockdown ofα-catulingene in SGC-7901 cell line could prevent cell proliferation,migration and invasion by inhibition of transition of epithelial-mesenchymal.

gastric cancer;α-catulin;cell proliferation;cell invasion;epithelial-mesenchymal transit

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.27.006

1005-8982（2017）27-0027-05

2017-05-16

河南省2015年科技發(fā)展計劃（No：152300410164）