李時(shí)孟,李 威,何成彥，謝 風(fēng)

(吉林大學(xué)中日聯(lián)醫(yī)院 檢驗(yàn)科，吉林 長(zhǎng)春130033)

人布魯菌病的實(shí)驗(yàn)室診斷

李時(shí)孟,李 威,何成彥，謝 風(fēng)*

(吉林大學(xué)中日聯(lián)醫(yī)院 檢驗(yàn)科，吉林 長(zhǎng)春130033)

布魯菌病作為最常見(jiàn)的人畜共患疾病之一，在該病高發(fā)地區(qū)感染率可達(dá)到1‰[1]，其主要的傳染源為感染的動(dòng)物及未經(jīng)消毒的奶制品，此外，飲食習(xí)慣、氣候因素以及衛(wèi)生條件等也會(huì)影響疾病的傳播。布魯氏菌侵入人體后，起初表現(xiàn)為發(fā)熱、盜汗、頭痛、厭食等非典型癥狀，隨著病程進(jìn)展，出現(xiàn)菌血癥、毒血癥而引發(fā)多器官感染。近些年我國(guó)布魯菌病發(fā)病率逐年上升，越來(lái)越重視預(yù)防及早期診斷。隨著近代實(shí)驗(yàn)室技術(shù)的不斷發(fā)展，已有多種針對(duì)布魯氏菌的檢驗(yàn)方法，現(xiàn)就各種實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)作一綜述。

1 分離培養(yǎng)

布魯氏菌的細(xì)菌培養(yǎng)，采集的標(biāo)本通常為患者的血液、骨髓或其他體液，培養(yǎng)出致病菌是診斷布魯菌病的金標(biāo)準(zhǔn)。然而該法陽(yáng)性率較低，易受布魯氏菌種屬、疾病分期等多種因素影響[2]。同時(shí)，布魯氏菌為緩慢生長(zhǎng)型微生物，培養(yǎng)周期長(zhǎng)，至少需培養(yǎng)45天無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)才可確認(rèn)為陰性[3]。此外，布魯氏菌是實(shí)驗(yàn)室感染的主要病原菌之一，故血液培養(yǎng)過(guò)程嚴(yán)重威脅著實(shí)驗(yàn)室人員的健康[4,5]。近年來(lái)隨著全自動(dòng)血液分析系統(tǒng)的建立，布魯氏菌的培養(yǎng)時(shí)間可縮短至一周，但無(wú)法對(duì)培養(yǎng)出的細(xì)菌進(jìn)行分離仍為一個(gè)亟待解決的問(wèn)題。Fatolahzadeh[6]等人研制出的TUMS培養(yǎng)基解決了這一難題，該培養(yǎng)基為布魯菌病的診斷提供了幫助，在布魯菌病高發(fā)地區(qū)得以廣泛應(yīng)用。

2 血清學(xué)診斷

由于分離培養(yǎng)技術(shù)耗時(shí)長(zhǎng)、危險(xiǎn)性高、敏感性差，現(xiàn)今布魯菌病的診斷多依賴于血清學(xué)的間接診斷技術(shù)。布魯氏菌的主要致病物質(zhì)為光滑脂多糖(smooth lipopolysaccharides，s-LPS)，大部分傳統(tǒng)的血清學(xué)試驗(yàn)就是應(yīng)用從細(xì)菌中提取出的高濃度的光滑脂多糖去檢測(cè)人體中的可凝集或非凝集的抗體[7]。但布魯氏菌脂多糖O型側(cè)鏈的免疫表位與多種致病菌相似，如耶爾森氏鼠疫桿菌O：9、沙門菌屬N抗原、霍亂弧菌、弗朗西斯氏菌屬及埃希式桿菌屬O：157，均可引起交叉反應(yīng)而降低診斷的特異性[8]。目前，最常用的血清學(xué)檢驗(yàn)方法包括玻片凝集試驗(yàn)(slide agglutination test，SAT)、虎紅平板凝集試驗(yàn)(Rose Bengale plate test，RBPT)、抗人球蛋白試驗(yàn)(Coombs’test，CT)以及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzymelinked immunosorbent assay，ELISA)，上述檢驗(yàn)方法的精確度排序依次為ELISAgt;RBTgt;SATgt;CT[8]。

2.1玻片凝集試驗(yàn)及虎紅平板凝集試驗(yàn)

玻片凝集試驗(yàn)(SAT)是診斷人布魯菌病的血清學(xué)參考方法。相比于傳統(tǒng)的試管凝集試驗(yàn)(Wright test)，它具有耗時(shí)短、操作簡(jiǎn)單的優(yōu)勢(shì)。在臨床應(yīng)用過(guò)程中，診斷布魯菌病滴度參考范圍仍未達(dá)成共識(shí)，通常認(rèn)為若患者有布魯氏菌接觸史并伴有臨床癥狀，SAT滴度≥1∶160即提示與布魯氏菌感染有關(guān)，而在該病高發(fā)地區(qū)以SAT滴度≥1∶320作為診斷標(biāo)準(zhǔn)。在疾病早期及慢性感染過(guò)程中，SAT實(shí)驗(yàn)診斷敏感性較低[9,10]。

虎紅平板凝集試驗(yàn)(RBPT)是利用布魯氏菌1119-3抗原(USDA)進(jìn)行檢測(cè)的快速篩查方法。該法對(duì)未接觸過(guò)布魯氏菌的患者診斷意義大，但對(duì)有過(guò)布魯菌接觸史或曾經(jīng)感染過(guò)布魯氏菌的患者易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果[11]，針對(duì)這部分患者，將待檢血清標(biāo)本稀釋可提高診斷的準(zhǔn)確性。盡管SAT試驗(yàn)和RBPT試驗(yàn)在結(jié)果判斷上受主觀性因素影響比較大，但大量研究表明在不同實(shí)驗(yàn)室之間或應(yīng)用這兩種血清學(xué)方法檢驗(yàn)時(shí)，多數(shù)能得到相同的檢驗(yàn)結(jié)果。

2.2抗人球蛋白試驗(yàn)及免疫捕獲凝集試驗(yàn)

抗人球蛋白試驗(yàn)(CT)在布魯菌病的診斷中可作為SAT試驗(yàn)的補(bǔ)充檢測(cè)，旨在檢測(cè)不完全抗體、封閉抗體及非凝集抗體。該法可檢測(cè)到布魯氏菌抗體滴度的細(xì)微變化，多用于慢性感染或疾病復(fù)發(fā)時(shí)的診斷[12]。

免疫捕獲凝集試驗(yàn)(Brucellacapt)的靈敏性和特異性與CT試驗(yàn)相當(dāng)。相比于傳統(tǒng)血清學(xué)試驗(yàn)操作復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)的缺點(diǎn)，Brucellacapt最大的優(yōu)勢(shì)在于能通過(guò)一步法快速檢測(cè)凝集及非凝集的IgG和IgA抗體，同時(shí)也能提示疾病的預(yù)后[13]。

2.3酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)是一種標(biāo)準(zhǔn)化快速篩查方法，在臨床廣泛應(yīng)用。該法可用于進(jìn)行IgG、IgM、IgA的定量及免疫球蛋白總量的檢測(cè)。IgM滴度檢測(cè)可提示布魯菌病的早期感染，然而IgM抗體在檢測(cè)中受很多因素影響，如IgM抗體量過(guò)大時(shí)可出現(xiàn)假陰性結(jié)果。當(dāng)被檢者同時(shí)患有風(fēng)濕類疾病時(shí)，易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果[14,15]。因此，在檢測(cè)之前可應(yīng)用特異性免疫吸附劑對(duì)待檢血清標(biāo)本進(jìn)行吸附。在臨床應(yīng)用過(guò)程中，僅對(duì)一種免疫球蛋白檢測(cè)可能會(huì)出現(xiàn)假陰性結(jié)果，為了避免這種情況，至少應(yīng)對(duì)IgG、IgM兩種抗體檢測(cè)，IgG、IgM均陽(yáng)性時(shí)才可診斷為布魯菌病[16]。

隨著檢驗(yàn)技術(shù)的不斷發(fā)展，現(xiàn)已出現(xiàn)多種新型商品試劑盒，其中間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(indirect ELISA antibody detection，iELISA)試劑盒具有成本低、耗時(shí)短的優(yōu)點(diǎn)，其包被的抗原為光滑脂多糖和粗糙脂多糖的混合物，可用于大范圍篩查[17]。競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(competition ELISA antibody detection，cELISA)試劑盒靈敏性和特異性高，提高了診斷的準(zhǔn)確性[18]。此外，補(bǔ)體結(jié)合酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(complement fixation ELISA antibody detection，CF-ELISA)可檢測(cè)到0.01IU的布魯氏桿菌抗體，其檢測(cè)靈敏度與iELISA相當(dāng)，遠(yuǎn)超過(guò)SAT及RBPT。

2.4間接熒光抗體試驗(yàn)

間接熒光抗體試驗(yàn)(Indirect fluorescent antibody test，IFA)利用熒光標(biāo)記二抗來(lái)檢測(cè)IgG、IgM、IgA抗體，檢驗(yàn)過(guò)程需2-3 h。其檢驗(yàn)結(jié)果需在熒光顯微鏡下觀察，對(duì)檢驗(yàn)人員要求較高且檢驗(yàn)結(jié)果易受主觀因素影響[9,10]。

2.5側(cè)向?qū)游鲈囼?yàn)

側(cè)向?qū)游鲈囼?yàn)(lateral flow assay，LFA)是一種操作簡(jiǎn)單、可用于床旁或牧場(chǎng)直接接種的新型檢驗(yàn)方法。與其他血清學(xué)檢驗(yàn)方法不同，該法無(wú)需任何實(shí)驗(yàn)室設(shè)備，反應(yīng)試劑也不需要冷凍保存，適用于實(shí)驗(yàn)室條件較差的地縣級(jí)醫(yī)院使用。R.Shome等[19]的研究表明LFA的敏感性略低于ELISA，特異性與RBPT相近，雖不適用于人群中大范圍篩查，但可用于農(nóng)舍中動(dòng)物感染的早期診斷。

3 分子生物學(xué)診斷

聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(Polymerase chain reaction，PCR)可檢測(cè)外周血及其他組織標(biāo)本[20]，其特異性優(yōu)于血清學(xué)試驗(yàn)，靈敏性高于傳統(tǒng)的細(xì)菌分離培養(yǎng)，同時(shí)降低了實(shí)驗(yàn)室感染發(fā)生的幾率。大量研究表明PCR技術(shù)對(duì)急性、慢性及復(fù)發(fā)性布魯氏菌病的診斷均有意義[21]。1990年，F(xiàn)ekete等人首次應(yīng)用PCR技術(shù)對(duì)布魯氏菌進(jìn)行檢測(cè)，此后，隨著研究的不斷深入，已能夠?qū)Σ剪斒暇鷮龠M(jìn)行分類[22]?，F(xiàn)今，PCR技術(shù)在人布魯菌病及動(dòng)物布魯菌病的診斷中應(yīng)用廣泛[23]。

3.1標(biāo)準(zhǔn)聚合酶鏈反應(yīng)

標(biāo)準(zhǔn)聚合酶鏈反應(yīng)(Standard PCR)操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短，檢測(cè)樣本多為血液。PCR反應(yīng)的高效性主要依賴于引物的特異性，在以往的研究中已發(fā)現(xiàn)了多種布魯氏菌的引物，但針對(duì)人感染布魯氏菌的引物卻不多。Baddour MM等[24]的研究發(fā)現(xiàn)了三組引物，分別為編碼BCSP 31(B4/B5)的基因、布魯氏菌16S RNA序列以及編碼omp2(JPF/JPR)的基因，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示針對(duì)人感染布魯氏菌其敏感性差異較大，分別為98%、88.4%及53.1%。除引物因素外，待測(cè)血液標(biāo)本中高白細(xì)胞含量或存在亞鐵血紅素復(fù)合物時(shí)亦會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

此外，對(duì)待檢血液標(biāo)本的選擇也存在爭(zhēng)議，Zerva L[25]等的研究表明血清更適用于PCR技術(shù)在布魯菌病診斷中的應(yīng)用，而 Mitka S[26]等則認(rèn)為全血是更優(yōu)的實(shí)驗(yàn)標(biāo)本，主要原因在于白細(xì)胞層對(duì)布魯菌病的診斷意義更大。

3.2實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)

實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real time PCR)可對(duì)血液標(biāo)本中的核酸進(jìn)行定量檢測(cè)。目前，實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)已經(jīng)能夠區(qū)分布魯氏桿菌的不同菌屬，其檢測(cè)靶點(diǎn)分別為16S-23S內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer region ，ITS)、omp25編碼基因、omp32編碼基因、BCSP31編碼基因以及IS711編碼基因[27-29]。Surucuoglu S[30]等的研究表明實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)的敏感性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值分別為88%、100%、100%、83%。鑒于該法高效、高靈敏性、高特異性的特點(diǎn)，可用于診斷無(wú)典型臨床表現(xiàn)且微生物學(xué)檢驗(yàn)陰性的早期感染患者[31]。此外，實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)對(duì)布魯氏菌病的療效及復(fù)發(fā)也有提示作用。

3.3多重聚合酶鏈反應(yīng)

多重聚合酶鏈反應(yīng)(Multiplex PCR)可用于檢測(cè)病毒、細(xì)菌及其他病原體。其主要優(yōu)點(diǎn)為成本低、耗時(shí)短、可同時(shí)對(duì)多種病原體進(jìn)行檢測(cè)。有研究表明快速多重PCR可在一個(gè)半小時(shí)內(nèi)完成對(duì)布魯氏桿菌的診斷及分型[32,33]。并非所有種屬的布魯氏菌均對(duì)人類致病，因此檢驗(yàn)過(guò)程中對(duì)布魯氏菌的分型尤為重要。Ignacio[34]等的研究表明新型布魯氏菌多重階梯聚合酶鏈反應(yīng)(New Bruce-ladder multiplex PCR assay)可快速區(qū)分豬屬布魯氏菌和犬屬布魯氏菌的感染，既可用于實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)，也可用于動(dòng)物檢測(cè)。此外，多重PCR還可用于肺外結(jié)核病與不典型布魯菌病的鑒別[35]。由于有多組引物的存在，多重PCR易形成引物二聚體，清除非特異性PCR產(chǎn)物及保持各組份相同的擴(kuò)增效率可提高檢驗(yàn)的準(zhǔn)確性。

3.4巢式及半巢式聚合酶鏈反應(yīng)

巢式聚合酶鏈反應(yīng)(Nested PCR)是有兩次相繼進(jìn)行的聚合酶鏈反應(yīng)組成的PCR技術(shù)，其第二次PCR是在第一次PCR反應(yīng)產(chǎn)物序列范圍內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增[36]。與巢式PCR相似，半巢式PCR(semi-Nested PCR)也含兩組引物，但其第二次PCR引物與第一次的相同[37]。這兩種方法提高了PCR的成功率和分析的特異性。然而，巢式及半巢式PCR也存在一些不足，比如在反應(yīng)過(guò)程中易出現(xiàn)引物二聚體及PCR產(chǎn)物的交叉反應(yīng)。此外，該法僅能對(duì)單個(gè)布魯氏桿菌進(jìn)行檢驗(yàn)，不能鑒別不同菌屬。

綜上所述，分離培養(yǎng)仍是布魯菌病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但耗時(shí)長(zhǎng)，常錯(cuò)失抗菌藥物的最佳治療期。血清學(xué)檢驗(yàn)更高效，但缺乏國(guó)際統(tǒng)一的診斷標(biāo)準(zhǔn)，在臨床上，布魯氏菌病的確診仍很困難。有研究指出血清學(xué)檢驗(yàn)陰性的血樣，在細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)中可分離出布魯氏菌，布魯氏菌抗體效價(jià)的高低和細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)中能否分離出致病菌也無(wú)必然聯(lián)系。故有臨床癥狀的患者，建議同時(shí)行細(xì)菌學(xué)及血清學(xué)檢驗(yàn)，避免漏診。隨著檢驗(yàn)技術(shù)的不斷發(fā)展，分子生物學(xué)檢驗(yàn)方法以快捷、高靈敏度、高特異性的優(yōu)勢(shì)，有望成為布魯氏菌的常規(guī)檢驗(yàn)方法，但其費(fèi)用較高，無(wú)法用于大范圍篩查。因此，還需要更多、更有價(jià)值的研究不斷改進(jìn)現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)方法，以實(shí)現(xiàn)布魯氏菌病的早期診斷及治療。

[1]Buzgan T,Karahocagil MK,Irmak H,et al.Clinical manifestations and complications in 1028 cases of brucellosis:a retrospective evaluation and review of the literature[J].Int J Infect Dis,2010,14(6):469.

[2]Hadi Peeridogaheh,Mohammad Ghasem Golmohammadi,Farhad Pourfarzi.Evaluation of ELISA and Brucellacapt tests for diagnosis of human Brucellosis[J].IRAN J MICROBIOL,2013,5(1):14.

[3]Sapana Tiwari,a Ashu Kumar,a Duraipandian Thavaselvam,et al.Development and Comparative Evaluation of a Plate Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Based on Recombinant Outer Membrane Antigens Omp28 and Omp31 for Diagnosis of Human Brucellosis[J].CVI ASM org,2013,20(8):1217.

[4]Yagupsky P,Baron EJ.Laboratory exposures to brucellae and implications for bioterrorism[J].Emerg Infect Dis,2005,11(8):1180.

[5]Maleknejad P,Peeri-Dogaheh H,Amir Zargar AA,et al.Diagnosis of brucellosis by use of BACTEC blood culture and confirmation by PCR[J].J Vet Res,2007,62:83.

[6]Fatolahzadeh B,Maleknejad P,Hejazi MJ,et al.Development and evaluation of TUMS medium,a novel biphasic culture medium for isolation of Brucella spp.from patients[J].Iran J Microbiol,2009,1:21.

[7]Sascha Al Dahouk,Karsten N?ckler.Implications of laboratory diagnosis on brucellosis therapy[J].Expert Rev Anti Infect Ther,2011,9(7):833.

[8]Al Dahouk S,Tomaso H,N?ckler K,et al.Laboratorybased diagnosis of brucellosis- a review of the literature.Part II:serological tests for brucellosis[J].Clin Lab,2003,49(11-12),577.

[9]Araj GF.Update on laboratory diagnosis of human brucellosis[J].Int J Antimicrob Agents,2010,36:12.

[10]Franco MP,Mulder M,Gilman RH,et al.Human brucellosis[J].Lancet Infect Dis,2007,7:775.

[11]Ruiz-Mesa JD,Sánchez-Gonzalez J,Reguera JM,et al.Rose Bengal test:diagnostic yield and use for the rapid diagnosis of human brucellosis in emergency departments in endemic areas[J].Clin Microbiol Infect,2005,11(3):221.

[12]Casanova A,Ariza J,Rubio M,et al.Brucellacapt versus classical tests in the serological diagnosis and management of human brucellosis[J].Clin Vaccine Immunol,2009,16(6):844.

[13]Bosilkovski M,Katerina S,Zaklina S,et al.The role of Brucellacapt test for follow-up patients with brucellosis[J].Comp Immunol Microbiol Infect Dis,2010,33:435.

[14]Sharma R,Chisnall C,Cooke RP.Evaluation of in-house and commercial immunoassays for the sero-diagnosis of brucellosis in a non-endemic low prevalence population[J].J Infect,2008,56(2):108.

[15]Díaz R,Ariza J,Alberola I,et al.Secondary serological response of patients with chronic hepatosplenic suppurative brucellosis[J].Clin Vaccine Immunol,2006,13(11):1190.

[16]Mantur B,Parande A,Amarnath S,et al.ELISA versus conventional methods of diagnosing endemic brucellosis[J].Am J Trop Med Hyg,2010,83(2):314 .

[17]Zhang,X.Brucellosis indirect enzyme-linked immunosorbent assay antibody detection kit.2010,CN101799470.

[18]Zhang,X.New-generation brucellosis antibody competition enzyme-linked immunosorbent adsorption test detection kit.2009,CN101581726.

[19]Shome1 R,Filia G,Padmashree1 BS,et al.Evaluation of lateral flow assay as a field test for investigation of brucellosis outbreak in an organized buffalo farm:A pilot study[J].Veterinary World,2015,8(11):492.

[20]Bricker BJ.PCR as a diagnostic tool for brucellosis[J].Vet Microbiol,2002,90(1-4):435.

[21]Al Ajlan HH,Ibrahim AS,Al Salamah AA.Comparison of different PCR methods for detection of Brucella spp.in human blood samples[J].Pol J Microbiol,2011,60(1):27.

[23]Yu WL,Nielsen K.Review of detection of Brucella spp.by polymerase chain reaction[J].Croat Med J,2010,51(4):306.

[24]Baddour MM,Alkhalifa DH.Evaluation of three polymerase chain reaction techniques for detection of Brucella DNA in peripheral human blood[J].Can J Microbiol,2008,54(5):352.

[25]Zerva L,Bourantas K,Mitka S,et al.Serum is the preferred clinical specimen for diagnosis of human brucellosis by PCR[J].J Clin Microbiol,2001,39(4):1661.

[26]Mitka S,Anetakis C,Souliou E,et al.Evaluation of different PCR assays for early detection of acute and relapsing brucellosis in humans in comparison with conventional methods[J].J Clin Microbiol,2007,45(4):1211.

[27]Kattar MM,Zalloua PA,Araj GF,et al.Development and evaluation of real-time polymerase chain reaction assays on whole blood and paraffin-embedded tissues for rapid diagnosis of human brucellosis[J].Diagn Microbiol Infect Dis,2007,59(1):23.

[28]Queipo-Ortuo MI,Colmenero JD,Bravo MJ,et al.Usefulness of a quantitative real-time PCR assay using serum samples to discriminate between inactive,serologically positive and active human brucellosis[J].Clin Microbiol Infect,2008,14(12):1128.

[29]Zhang B,Wear DJ,Stojadinovic A,et al.Sequential real-time PCR assays applied to identification of genomic signatures in formalin-fixed paraffin-embedded tissues:a case report aboutbrucella-induced osteomyelitis[J].Mil Med,2013,178(1):88.

[30]Surucuoglu S,El S,Ural S,et al.Evaluation of real-time PCR method for rapid diagnosis of brucellosis with different clinical manifestations[J].Pol J Microbiol,2009,58(1):15.

[32]Garofolo G,Ancora M,Di Giannatale E.MLVA-16 loci panel on Brucella spp.using multiplex PCR and multicolor capillary electrophoresis[J].J Microbiol Methods，2013,92(2):103.

[33]Mirnejad R,Mohamadi M,Piranfar V,et al.A duplex PCR for rapid and simultaneous detection of Brucella spp.in human blood samples[J].Asian Pac J Trop Med,2013,6(6):453.

[34]Ignacio Lopez-Goni ,David Garcia-Yoldi,Clara M.Marnb,et al.New Bruce-ladder multiplex PCR assay for the biovar typing of Brucella suis and the discrimination of Brucella suis and Brucella canis[J].Veterinary Microbiology,2011,154:152.

[35]Colmenero JD,Morata P,Ruiz Mesa JD,et al.Multiplex real-time polymerase chain reaction:a practical approach for rapid diagnosis of tuberculous and brucellar vertebral osteomyelitis[J].Spine (Phila Pa 1976),2010,35(24):1392.

[36]Porter-Jordan K,Rosenberg EI,Keiser JF,et al.Nested polymerase chain reaction assay for the detection of cytomegalovirus overcomes false positives caused by contamination with fragmented DNA[J].J Med Virol,1990,30(2):85.

[37]Seah CL,Chow VT,Chan YC.Semi-nested PCR using NS3 primers for the detection and typing of dengue viruses in clinical serum specimens[J].Clin Diagn Virol, 1995,4(2):113.

吉林省產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究與開(kāi)發(fā)專項(xiàng)項(xiàng)目(2015Y033-1)

*通訊作者

1007-4287(2017)11-2033-04

2016-12-18)