趙 虹，田振華，趙曉紅

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林 長春130033)

多腫瘤標(biāo)記物檢測(cè)試劑盒的方法學(xué)評(píng)估

趙 虹，田振華*，趙曉紅

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林 長春130033)

腫瘤標(biāo)記物(Tumor marker,TM)是存在于腫瘤組織和細(xì)胞的特異性物質(zhì)，其性質(zhì)與正常組織和細(xì)胞所表達(dá)的物質(zhì)和抗原有區(qū)別，在正常組織或良性疾病不產(chǎn)生或產(chǎn)生甚微，主要是在腫瘤細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生并分泌到體液中的物質(zhì)[1]。常用血清作為樣品。腫瘤標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)，為腫瘤的早期診斷、反映病程、指導(dǎo)治療、評(píng)估療效、監(jiān)測(cè)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移以及提示預(yù)后等方面，提供了有價(jià)值的參考指標(biāo)。

現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的腫瘤標(biāo)記物有：腫瘤特異性及相關(guān)抗原、激素、受體、酶和同工酶、癌基因及其產(chǎn)物等數(shù)十種。(1)蛋白質(zhì)類：AFP(肝細(xì)胞癌和生殖細(xì)胞腫瘤)、CEA(廣譜腫瘤)；(2)糖類抗原：CA125(卵巢癌)、CA15-3(乳腺癌)、CA19-9(胰腺癌和結(jié)、直腸癌)、CA24-2(胰腺癌、膽道癌)、Cyfra21-1(乳腺癌)、F-PSA；T-PSA(前列腺癌)和SCCA(鱗狀細(xì)胞癌)；(3)酶類：NSE(小細(xì)胞肺癌)；(4)激素類：free-β-HCG(婦科腫瘤和非精原性睪丸癌)。

腫瘤標(biāo)志物不能作為腫瘤診斷的主要依據(jù)，只能用于腫瘤輔助診斷。因此腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)要注意假陽性和假陰性的問題，為了提高腫瘤標(biāo)志物的輔助診斷的價(jià)值和確定何種標(biāo)志物可作為治療后的隨訪監(jiān)測(cè)指標(biāo)可進(jìn)行腫瘤標(biāo)志物的聯(lián)合檢測(cè)，合理正確地選擇幾種標(biāo)記物聯(lián)合檢測(cè)是十分重要的[2,3]。

臨床上應(yīng)用的多腫瘤標(biāo)志物蛋白芯片檢測(cè)系統(tǒng)是基于雙抗體夾心法的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法，在固相基質(zhì)上包被 12 種腫瘤標(biāo)志物的抗體，捕捉被檢者血清中對(duì)應(yīng)的腫瘤標(biāo)志物，結(jié)合第二抗體，然后催化化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生光信號(hào)，用專門的芯片閱讀儀讀取光信號(hào)[4,5]。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑

本實(shí)驗(yàn)用的實(shí)驗(yàn)儀器包括：自動(dòng)平衡離心機(jī)(型號(hào)：DT5-2)；透景QiHand(嘉興凱實(shí)生物科技有限公司)；Luminex200多功能流式點(diǎn)陣儀(上海透景生命科技有限公司)；全自動(dòng)流式熒光發(fā)光免疫分析儀(型號(hào)：TesmiF4000)；1 ml、200 μl、50 μl移液槍(sartorius)。

本實(shí)驗(yàn)用的實(shí)驗(yàn)試劑包括：多腫瘤標(biāo)記物(7種)檢測(cè)試劑盒；糖類抗原15-3定量檢測(cè)試劑盒；多腫瘤標(biāo)記物(4種)檢測(cè)試劑盒，以上試劑均在上海透景生命科技股份有限公司購買。

血清標(biāo)本來自吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院的臨床樣品100例，男性占56%，平均年齡62歲，女性占44%，平均年齡65歲，其中體檢39例，病房患者34例，門診27例。

1.2檢驗(yàn)原理

本試劑盒使用Luminex200多功能流式點(diǎn)陣儀檢測(cè)血清中的男性12項(xiàng)，女性10項(xiàng)的腫瘤標(biāo)記物。針對(duì)多腫瘤標(biāo)記物抗原的捕獲抗體通過共價(jià)交聯(lián)在熒光編碼的微球上，并以一定數(shù)量制備成懸液即B液，與標(biāo)準(zhǔn)品或是血清樣本經(jīng)37℃孵育5 min后，加入藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的針對(duì)抗原檢測(cè)抗體溶液即C液，37℃孵育1 h反應(yīng)。這樣，在各熒光編碼的微球上就形成了與微球體交聯(lián)的抗體-腫瘤標(biāo)記物抗原-檢測(cè)抗體PE的復(fù)合物。

在多功能流式點(diǎn)陣儀上，這些熒光編碼的微球被微量液體傳送系統(tǒng)排成單列，通過兩束激光，一束判定微球的編碼從而確定被測(cè)腫瘤標(biāo)記物的種類，另外一束激發(fā)微球上的PE而發(fā)熒光。微球上PE的熒光強(qiáng)度與血清中的多腫瘤標(biāo)記物的濃度正相關(guān)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別對(duì)其熒光信號(hào)可擬合成劑量-反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線。從曲線方程即可計(jì)算出血清中的各種腫瘤標(biāo)記物抗原濃度。

1.3檢驗(yàn)方法

1.3.1準(zhǔn)備工作：從4度冰箱中取出7項(xiàng)(AFP、CA125、CYFRA21-1、CA24-2、CEA、free-β-hCG、NSE)，4項(xiàng)(CA19-9、SCCA、F-PSA、T-PSA)和CA15-3定量檢測(cè)試劑盒置于室溫平衡30 min。加純凈水200 μl復(fù)溶7項(xiàng)和4項(xiàng)的標(biāo)準(zhǔn)品，混勻后備用，CA153標(biāo)準(zhǔn)品可直接使用。用移液槍吹打3個(gè)試劑盒的B液20次，吹打C液50次。

1.3.2加樣：在透景QiHand儀器的試劑架中第一排放7項(xiàng)的A液、B液和C液，第二排放4項(xiàng)的A、B、C液，第三排放CA15-3的A、B、C液。 在樣品架中，放入7項(xiàng)、4項(xiàng)、CA15-3的標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品。點(diǎn)擊運(yùn)行開始加樣，儀器在96孔板上依次加入：反應(yīng)緩沖液A25 μl/孔，血清樣本10 μl/孔(CA15-3要先將血清用稀釋E液稀釋20倍)，微球B液25 μl/孔，板子震蕩20 s，置于37度孵箱內(nèi)避光反應(yīng)5 min，加入PE標(biāo)記二抗C液25 μl/孔，板子震蕩20 s，置于37度孵箱內(nèi)避光反應(yīng)1 h，反應(yīng)結(jié)束后，加終止反應(yīng)D液100 μl/孔。

1.3.3讀板：Luminex200多功能點(diǎn)陣儀在使用前需開機(jī)預(yù)熱30 min，點(diǎn)擊shut up清洗管路。讀板時(shí)先設(shè)置項(xiàng)目批號(hào)，開始讀板，檢測(cè)時(shí)間7項(xiàng)大約45 s/孔，4項(xiàng)大約40 s/孔，CA15-3大約35 s/孔。讀板結(jié)束后shut off清洗管路。

1.3.4測(cè)定結(jié)果計(jì)算：在Luminex200多功能流式點(diǎn)陣儀上可讀出的標(biāo)準(zhǔn)品及樣本熒光信號(hào)數(shù)值，輸入標(biāo)準(zhǔn)品濃度后用儀器內(nèi)置配套軟件可自動(dòng)計(jì)算出對(duì)應(yīng)的血清樣本中多腫瘤標(biāo)記物的濃度。

為保證吊運(yùn)材料安全，需用鋼筋做1個(gè)籠子。籠子的底面制作為可拆裝式，便于裝卸材料。最大起吊質(zhì)量200 kg，卷揚(yáng)機(jī)選用3 t的，鋼絲繩選用左交互捻Ф 10(6×19)纖維芯，公稱抗拉強(qiáng)度1 570 MPa。

1.4方法學(xué)評(píng)估

對(duì)流式熒光發(fā)光法進(jìn)行了準(zhǔn)確度、批間和批內(nèi)精密度、線性范圍、穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)和干擾試驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1準(zhǔn)確度

用衛(wèi)生部質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品高、中、低三個(gè)批號(hào)的樣品進(jìn)行檢測(cè)，比較實(shí)測(cè)濃度與參考值的大小，如表2。%偏倚=(檢測(cè)平均值-參考值)/參考值，檢測(cè)值均在允許的范圍內(nèi)。

表2 準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果表

2.2精密度

三種批號(hào)的試劑盒重復(fù)5孔持續(xù)測(cè)定同一個(gè)樣品，進(jìn)行精密度分析。計(jì)算批內(nèi)變異系數(shù)和3個(gè)批號(hào)試劑盒的批間變異系數(shù)，測(cè)得批內(nèi)CV值小于10%，批間CV值小于15%。

2.3線性范圍

本試劑盒各項(xiàng)指標(biāo)的線性范圍如表4，在線性范圍內(nèi)，試劑盒的相關(guān)系數(shù)R2≥0.99。

2.4穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取試劑盒分別放置于37℃7天或者4℃一年，觀察各階段試劑的物理外觀，鑒定保存期間標(biāo)準(zhǔn)品活性變化，評(píng)價(jià)其線性范圍、準(zhǔn)確度、精密度等指標(biāo)。確定試劑盒有效期為12個(gè)月。

2.5干擾試驗(yàn)

可以產(chǎn)生對(duì)血清學(xué)檢測(cè)干擾的常見原因有室內(nèi)溫度，試劑污染，標(biāo)本嚴(yán)重脂血和樣品溶血。

2.5.1溫度因素：溫度會(huì)使激光產(chǎn)生偏移，在22℃-26℃范圍內(nèi)可以調(diào)節(jié)，溫度變化超過±7℃時(shí)，會(huì)影響結(jié)果的準(zhǔn)確性，因此要保證操作溫度在一定的室溫下，不可以溫度過高或是過低。

2.5.2試劑污染如汗液、唾液、微生物等引起的污染：可能會(huì)引起SCCA的假陽性，如果檢測(cè)患者的SCCA結(jié)果均大于正常值，應(yīng)考慮是不是試劑污染，需要重新?lián)Q新試劑進(jìn)行SCCA的測(cè)定，要注意在打開SCCA試劑盒后，用移液槍吹打試劑時(shí)應(yīng)避免污染性操作。

表4 線性范圍

2.5.3標(biāo)本嚴(yán)重脂血(血清呈現(xiàn)乳白色)：在運(yùn)行時(shí)，會(huì)導(dǎo)致儀器管路堵塞，從而影響儀器的正常使用，遇到這種情況，血清應(yīng)稀釋5倍后進(jìn)行測(cè)量。

2.5.4樣品溶血：紅細(xì)胞膜破裂，膜上的NSE釋放會(huì)干擾血清中NSE的測(cè)定，會(huì)出現(xiàn)一些假陽性。

3 討論

臨床上用于檢測(cè)腫瘤標(biāo)記物的定量檢測(cè)試劑盒有很多，本文基于流式熒光發(fā)光法，利用Lumine X200儀器檢測(cè)腫瘤標(biāo)記物，對(duì)此方法進(jìn)行方法學(xué)評(píng)估。

該方法準(zhǔn)確度高，該方法的批間CV值小于15%，批內(nèi)CV值小于10%，精密度符合國家標(biāo)準(zhǔn)；在線性范圍內(nèi)，試劑盒的相關(guān)系數(shù)R2≥0.99，線性關(guān)系良好；試劑盒的穩(wěn)定性好，可保存1年；該檢測(cè)方法需要保持室內(nèi)溫度相對(duì)恒定；試劑污染會(huì)出現(xiàn)SCCA的假陽性；當(dāng)標(biāo)本嚴(yán)重脂血時(shí)，應(yīng)稀釋進(jìn)行測(cè)定；樣品溶血會(huì)出現(xiàn)NSE的假陽性，因此結(jié)果不能單獨(dú)作為各種腫瘤疾病或臨床良性疾病存在與否的判斷依據(jù)，必須與物理化學(xué)臨床診斷相結(jié)合后作出相應(yīng)確診。該檢測(cè)方法仍存在一些局限性，有望進(jìn)一步提升與改進(jìn)。

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[2]潘繼文,李京南.腫瘤標(biāo)記物聯(lián)合檢測(cè)的臨床應(yīng)用[J].醫(yī)學(xué)理論與實(shí)踐,2005,18(2):125.

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*通訊作者

1007-4287(2017)11-1945-03

2017-01-15)