胡艷萍,吳林林,楊建杰

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京潞河醫(yī)院 病理科,北京101149)

Cortactin及CyclinD1在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中的差異表達(dá)及臨床病理相關(guān)性分析

胡艷萍*,吳林林,楊建杰

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京潞河醫(yī)院 病理科,北京101149)

目的探討Cortactin及CyclinD1在食管鱗狀細(xì)胞癌(Esophageal Squamous Cell Carcinoma ESCC)組織中差異表達(dá)，并結(jié)合臨床因素進(jìn)行臨床病理相關(guān)分析。方法運(yùn)用免疫組織化學(xué)(Immunohistochemistry IHC)方法檢測(cè)Cortactin及CyclinD1在116例ESCC組織中的差異表達(dá)情況，并分析Cortactin及CyclinD1與ESCC各項(xiàng)臨床因素的相關(guān)性。結(jié)果Cortactin及CyclinD1的高表達(dá)率在正常食管粘膜標(biāo)本(Normal Squamous Cell，NS)組(41.9%，0%)與ESCC組(58.6%，43.9%)間相比明顯升高，具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Plt;0.05)，且在不同分化ESCC組間亦存在明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Plt;0.05)；Kaplan-Meier生存分析顯示：隨著Cortactin及CyclinD1的高表達(dá)的升高,ESCC患者死亡率亦呈升高趨勢(shì)，且CyclinD1的高表達(dá)與ESCC患者的生存率具有相關(guān)性(P=0.01)。結(jié)論Cortactin及CyclinD1在ESCC組中上調(diào)表達(dá)，可為ESCC指導(dǎo)預(yù)后及臨床管理提供輔助參考；生存分析結(jié)果對(duì)于指導(dǎo)ESCC患者的術(shù)后管理，從病因?qū)W角度防控ESCC的發(fā)生發(fā)展以及早期食管癌的進(jìn)展、減少晚期ESCC的發(fā)生可能具有重要分子病理學(xué)價(jià)值。

食管；免疫組化；鱗狀細(xì)胞癌；Cortactin；CyclinD1；病理學(xué)

(ChinJLabDiagn,2017,21:1915)

食管癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，發(fā)生率位于全球惡性腫瘤的第七位，病死率居第六位[1]。 盡管消化內(nèi)鏡檢查提高了部分早期食管癌病變的發(fā)現(xiàn)，然而大部分病例直到疾病的晚期癥狀都不明顯，確診已是ESCC中晚期，預(yù)后差，病死率高。ESCC治療現(xiàn)狀尚不十分樂(lè)觀，術(shù)前新輔助放化療不能明顯降低術(shù)后局部復(fù)發(fā)率，5年生存率仍徘徊在5%和20%之間[2]。Cortactin基因存在于與基底膜連接處的上皮細(xì)胞漿內(nèi)，主要調(diào)節(jié)黏附與連接成分之間的相互作用。Cortactin可參與組成癌細(xì)胞骨架和黏附結(jié)構(gòu)，在調(diào)節(jié)膜動(dòng)力學(xué)、肌動(dòng)蛋白網(wǎng)絡(luò)構(gòu)成、細(xì)胞黏附和侵襲以及基質(zhì)降解等方面發(fā)揮作用[3]。CyclinD1在多種惡性腫瘤(頭頸部SCC、乳腺癌、食管癌和肝細(xì)胞癌)中存在過(guò)度表達(dá)，對(duì)于指導(dǎo)腫瘤的臨床治療和預(yù)后判斷具有重要臨床意義[4]。

本研究通過(guò)IHC檢測(cè)Cortactin及CyclinD1 蛋白標(biāo)記物在不同分化級(jí)別的ESCC組織中的差異表達(dá)情況，分析Cortactin及CyclinD1對(duì)于深入理解ESCC的分子生物學(xué)變化機(jī)制及特性的潛在應(yīng)用價(jià)值，并且結(jié)合ESCC的各項(xiàng)臨床指標(biāo)進(jìn)行臨床病理綜合分析，以期探討Cortactin或CyclinD1可能對(duì)于輔助ESCC的早期病理診斷、合理的臨床預(yù)后評(píng)估及指導(dǎo)臨床實(shí)施恰當(dāng)有效的治療都具有非常重要的作用，從而期望能夠在根本上降低ESCC的發(fā)病率和死亡率。

1 材料與方法

1.1材料

收集2005-2015年間就診于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京潞河醫(yī)院的ESCC病例116例進(jìn)行Cortactin及CyclinD1的IHC檢測(cè)，所有病例診斷標(biāo)準(zhǔn)參考WHO頭頸部腫瘤病理學(xué)和遺傳學(xué)(2005)分類系統(tǒng)[5]，被劃分為高分化(High Differentiation HD)、中分化(Moderate Differentiation MD)、低分化(Low Differentiation LD)三個(gè)分化級(jí)別組，如果病理診斷涵蓋2種分化級(jí)別，如“HD-MD”，將以較高分化級(jí)別作為病理診斷結(jié)果[6]。入組病例條件包括：(1)無(wú)既往ESCC病史的初診病例；(2)所收集ESCC病例包括內(nèi)窺鏡活檢和/或根治標(biāo)本，病理切片行蘇木素-伊紅染色(Hematoxylin and Eosin HE)染色；(3)所有病例經(jīng)3位病理醫(yī)師聯(lián)合會(huì)診，病理分級(jí)診斷意見一致；(4)所有病例具有完整的臨床及隨訪資料；(5)最短隨訪時(shí)間為2.5年，或截止于患者去世。另外，按照2005年WHO病理診斷標(biāo)準(zhǔn),選取3位病理醫(yī)師診斷意見一致的，被覆正常鱗狀上皮的食管粘膜標(biāo)本(Normal Squamous Cell，NS)112例設(shè)為陰性對(duì)照組。

1.2主要試劑及方法

1.2.1主要試劑

所有組織均經(jīng)10%中性福爾馬林固定、石蠟包埋，切片厚度為4 μm，免疫組化膠片貼附。Cortactin兔抗人多克隆抗體購(gòu)自GeneTex公司，CyclinD1鼠抗人單克隆抗體及IHC染色試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。所有116例ESCC標(biāo)本及112例陰性對(duì)照組標(biāo)本均進(jìn)行Cortactin及CyclinD1的IHC染色，EnVision二步法IHC染色參照試劑盒使用說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.2IHC染色結(jié)果判定

抗體陽(yáng)性的判定標(biāo)準(zhǔn)為在背景清晰的情況下，特定部位呈均勻的棕黃色顆粒狀著色，Cortactin定位于細(xì)胞漿/膜，CyclinD1定位于細(xì)胞核。在10×40 倍光鏡下隨機(jī)選取10 個(gè)視野進(jìn)行觀察，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100 個(gè)細(xì)胞，共計(jì)1000個(gè)細(xì)胞，結(jié)合染色強(qiáng)度和范圍進(jìn)行結(jié)果判定。所有IHC結(jié)果判定由2位病理醫(yī)師共同閱片完成，為了便于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析Cortactin及CyclinD1的表達(dá)與臨床因素的相關(guān)性，所有病例的IHC染色結(jié)果評(píng)分如下：0-10% —0；11-25%—1+；26-50%—2+；51-75%—3+；gt;51%強(qiáng)陽(yáng)性或gt;75%—4+。而后按照評(píng)分設(shè)為兩組，即低表達(dá)組(0+1+2)和高表達(dá)組(3+4)。

1.2.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。Cortactin及CyclinD1在ESCC各分化組與NS組間的差異表達(dá)，以及Cortactin及CyclinD1表達(dá)與ESCC臨床因素的相關(guān)分析采用χ2檢驗(yàn)分析； Cortactin及CyclinD1的差異表達(dá)與ESCC患者生存率采用Kaplan-Meier生存分析。Plt;0.05表示存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1ESCC患者的臨床病理特征

116例ESCC患者年齡范圍43-88歲，中位年齡62.5歲，其中男性100例(86.2%)，女性16例(13.8%)；90.52%的患者主訴為哽噎癥狀(105/116)，哽噎時(shí)間0.3-15個(gè)月，平均3.3個(gè)月；截止目前隨訪結(jié)果顯示29例ESCC患者死亡。(表1)

表1 116例ESCC患者的臨床病理特征分布

吸煙指數(shù)：吸煙年數(shù)×平均吸煙包數(shù)

2.2Cortactin及CyclinD1在ESCC組織中的表達(dá)情況

以112例NS組織作為陰性對(duì)照，Cortactin在116例ESCC組織的表達(dá)率明顯升高(圖1)，Cortactin的高表達(dá)率由42.0%升高到58.6%(68/116)，具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.01)；另外，Cortactin的高表達(dá)率在HD組(37.2%)、MD組(73.6%)及LD組(65.0%)三組間具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.00)，三組內(nèi)兩兩比較時(shí)，HD組分別與MD組(P=0.00)及LD組(P=0.04)均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且盡管Cortactin的高表達(dá)率從MD組(73.6%)到LD組(65.0%)，呈現(xiàn)小幅度逆降趨勢(shì)，但未顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.05)。

CyclinD1的高表達(dá)率從NS組到ESCC組表達(dá)率明顯升高(圖2)，自NS組的0%升高至ESCC組的44.0%(51/116)，具有顯著差異(P=0.00)，不僅如此，CyclinD1的高表達(dá)率在HD組(30.2%)、MD組(47.2%)及LD組(65.0%)三組間亦呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.03)，三組內(nèi)兩兩比較時(shí)，僅在HD組與LD組間顯示出明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.01)，其余各組間均未顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Pgt;0.05)。

Cortactin及CyclinD1在ESCC組織及NS對(duì)照組織中的差異表達(dá)結(jié)果見表2。

圖1(A) Cortactin在NS組織細(xì)胞中陰性表達(dá) 圖1(B) Cortactin在ESCC組織細(xì)胞中呈彌漫強(qiáng)胞漿陽(yáng)性表達(dá)

圖1Cortactin在NS及ESCC組織中的差異表達(dá)(EnVision法中倍放大)

圖2(A)CyclinD1在NS組織的基底層細(xì)胞中陽(yáng)性表達(dá) 圖2(B)CyclinD1在ESCC組織中呈胞核陽(yáng)性表達(dá)

圖2 CyclinD1在NS及ESCC組織中的差異表達(dá)( EnVision法 中倍放大) 表2 Cortactin及CyclinD1在ESCC組織及NS對(duì)照組織中表達(dá)情況

*Plt;0.05： NS vs.ESCC，HD vs.MD vs.LD，HD vs.LD(Cortactin/CyclinD1)；HD vs.MD(Cortactin)

2.3Cortactin及CyclinD1與ESCC臨床病理因素分析及生存分析

116例ESCC病例的臨床病理因素，包括：吸煙、飲酒、脈管內(nèi)癌栓、神經(jīng)侵犯等各項(xiàng)指標(biāo)與Cortactin及CyclinD1的相關(guān)性分析結(jié)果顯示：Cortactin及CyclinD1的表達(dá)與ESCC病例的各項(xiàng)臨床病理因素未顯示出相關(guān)性。Cortactin及CyclinD1與ESCC的生存分析顯示：隨著Cortactin的高表達(dá)，ESCC病例的死亡率逐漸升高，由18.8%升為29.4%，但未顯示出明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.19)；隨著CyclinD1的高表達(dá)，ESCC病例的死亡率逐漸升高，由15.4%升為37.3%，具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.01)。Cortactin及CyclinD1與ESCC病例臨床病理因素分析結(jié)果(表3)。

表3 Cortactin及CyclinD1與ESCC臨床病理因素分析

*Plt;0.05

3 討論

ESCC的形成是一個(gè)多因素相互作用、多階段發(fā)展、多基因變異的復(fù)雜過(guò)程，病因尚不十分清楚，一般認(rèn)為與致癌因素(煙草和酒精等等)的存在、食管損傷或食物刺激作用(如熱飲料等)、營(yíng)養(yǎng)不良和微量元素缺乏以及人乳頭狀瘤病毒感染等多方面因素有關(guān)。食管癌組織學(xué)類型主要包括ESCC和腺癌，兩種類型的分布具有一定的地域性，歐美發(fā)達(dá)國(guó)家約70%為Barrett食管相關(guān)的腺癌，以男性白色人種為主，我國(guó)則主要以鱗狀細(xì)胞癌為主，約占95%[7]。中國(guó)是食管癌高發(fā)區(qū)，每年全球50%的食管癌發(fā)生在中國(guó)，因食管癌死亡的人數(shù)約占我國(guó)全部惡性腫瘤死亡總數(shù)1/4。近年來(lái)對(duì)食管癌的病因進(jìn)行了廣泛的研究，但其發(fā)病機(jī)制尚不完全明確，而且，大多數(shù)食管癌發(fā)現(xiàn)已是進(jìn)展期，預(yù)后較差，食管黏膜內(nèi)癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為1-5%，黏膜下癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率則上升到30-50%[8,9]。因此對(duì)于ESCC的早期診斷和治療是提高患者生存率的有效途徑之一，尋找有價(jià)值的、可進(jìn)行ESCC早期預(yù)警或提示靶向治療的分子標(biāo)志物成為ESCC研究中亟待解決的問(wèn)題[10]，特異性識(shí)別的分子標(biāo)志物的認(rèn)識(shí)和發(fā)現(xiàn)可有助于深入理解ESCC的分子生物學(xué)變化機(jī)制及特性，進(jìn)而可能對(duì)ESCC進(jìn)行明確的病理診斷、合理的預(yù)后評(píng)估及指導(dǎo)臨床實(shí)施有效的靶向治療都具有非常重要的作用。

Cortactin基因在乳腺癌、頭頸部SCC中都存在異常表達(dá)，對(duì)于促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移具有重要作用[3,11]，提示Cortactin基因可作為有價(jià)值的潛在分子標(biāo)志物，用于輔助判斷頭頸部SCC復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移以及評(píng)估癌前病變的預(yù)后等。Cyclin D1與CDKs (Cyclin-dependent Kinases，周期素依賴性激酶)和CKIs (Cyclin-dependent Kinases Inhibitors，周期素依賴性激酶抑制因子)一起對(duì)細(xì)胞周期起調(diào)控作用。Cyclin D1含295個(gè)氨基酸，由11q13染色體的CCND1基因編碼，是細(xì)胞周期中短暫出現(xiàn)的基因表達(dá)產(chǎn)物，具有嚴(yán)格的周期順序性，可在G1/S 交界處將信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑與細(xì)胞周期調(diào)控聯(lián)系起來(lái)，完成細(xì)胞分裂和增殖過(guò)程中各個(gè)時(shí)期的轉(zhuǎn)換而后降解，對(duì)于腫瘤細(xì)胞的增殖和分化具有重要作用[12]。Gibcus[13]等研究顯示喉癌的核心擴(kuò)增區(qū)域是在11q13中一段約1.7Mb的序列，包含13種擴(kuò)增基因，其中包括 CCND1、Cortactin、FLJ42258、ORAOV1、FGF19、FADD、PPFIA1等，較為重要的是Cortactin 及Cyclin D1，對(duì)于11q13序列的擴(kuò)增起關(guān)鍵性作用。11q13染色體區(qū)域序列在多種惡性腫瘤組織中存在擴(kuò)增表達(dá)，包括頭頸部SCC、乳腺癌、食道癌、肺癌、卵巢癌以及膀胱癌等，且Cortactin的擴(kuò)增表達(dá)與頭頸部SCC患者的進(jìn)展及預(yù)后不良相關(guān)[14,15]。

與正常鱗狀上皮組織相比，Cortactin及CyclinD1在116例ESCC組織的表達(dá)率明顯升高，均具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Plt;0.05)，且在HD、MD及LD三組不同分化組間具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Plt;0.05)。Cortactin及CyclinD1在ESCC組織中的上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)，提示Cortactin與CyclinD1的表達(dá)調(diào)控在ESCC的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制中可能起到了一定的促進(jìn)作用，因此，對(duì)于ESCC早期發(fā)現(xiàn)并提早進(jìn)行臨床干預(yù)管理，進(jìn)而提高患者的生存率，減少死亡率具有重要意義。Cortactin及CyclinD1與ESCC的生存分析顯示，隨著Cortactin及CyclinD1的高表達(dá)，ESCC病例的死亡率均逐漸升高，且CyclinD1的高表達(dá)與ESCC的生存率之間存在著明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，研究結(jié)果對(duì)于指導(dǎo)臨床進(jìn)行ESCC病例的術(shù)后管理、減少晚期ESCC的發(fā)生率可能具有一定的意義，進(jìn)而幫助臨床醫(yī)師從病因?qū)W角度防控ESCC的發(fā)生發(fā)展以及早期食管癌的進(jìn)展可能提供了重要的線索。另外，Cortactin及CyclinD1兩種蛋白均位于microRNA-34c-5p的靶基因通路中，為其下游調(diào)控基因，本研究結(jié)果為進(jìn)一步探尋microRNA在ESCC組織中的差異變化情況提供了線索，盡管相應(yīng)的具體作用機(jī)制和調(diào)控途徑仍不明確，有待于進(jìn)一步擴(kuò)大樣本的深入研究以及更多臨床資料和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)加以證實(shí)。

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TheDys-expressionofCortactinandCyclinD1inEsophagealSquamousCellCarcinomaandclinicopathologicalcorrelationanalysis

HUYan-ping,WULin-lin,YANGJian-jie.

(DepartmentofPathology,BeijingLuHeHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing101149,China)

ObjectiveTo investigate the dys-expression of Cortactin and CyclinD1 in Esophageal Squamous Cell Carcinoma(ESCC) and to analyze the correlations between its dys-regulation with clinicopathological parameters of ESCC.MethodsThe expression of Cortactin and CyclinD1 in 116 cases of ESCC was detected by Immunohistochemistry,and the clinicopathological correlations was analyzed with the clinical and follow-up data of all ESCC.ResultsThe high-expression of Cortactin and CyclinD1 was detected in ESCC group(58.6%，43.9%) combined with NS group(41.9%，0%),which showed significant statistical difference(Plt;0.05),however there also showed significant statistical difference among three differentiated group of ESCC(Plt;0.05);The Kaplan-Meier analysis showed that with the up-regulation expression of Cortactin and CyclinD1,the death rate of ESCC was aslo increased,and the over-expression of CyclinD1 was correlated with the survival rate of patients(P=0.01).ConclusionUp-regulation of Cortactin and CyclinD1 may provide important role for guiding clinical management of ESCC and show potential valuable molecular pathological biomarker for prevention and control of early ESCC progress and reduction of advanced ESCC.

Esophagus;Immunohistochemistry;Squamous Cell Carcinoma;Cortactin;CyclinD1；Pathology

北京市通州區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目基金(KJ2016CX037) 北京市通州區(qū)衛(wèi)計(jì)委項(xiàng)目基金(TWKY-2016-PT-01-13)

*通訊作者

1007-4287(2017)11-1915-05

R735.1

A

2017-07-13)