安仲武，王 波*，戴善梅，蔣 玲，閆朝春

(1.連云港市東方醫(yī)院 檢驗科；2.連云港市東方醫(yī)院 感染科,江蘇 連云港222042)

不同狀態(tài)的乙肝病毒感染者血清Tim-3水平與疾病進(jìn)展關(guān)系研究

安仲武1，王 波1*，戴善梅2，蔣 玲1，閆朝春1

(1.連云港市東方醫(yī)院 檢驗科；2.連云港市東方醫(yī)院 感染科,江蘇 連云港222042)

目的對不同狀態(tài)的HBV感染者血清Tim-3水平變化與疾病進(jìn)程關(guān)系的初步探討。方法檢測39例慢性乙肝患者(CHB組)、42例乙肝病毒攜帶者(AsC組)、31例慢性乙肝急性發(fā)作患者及40例健康體檢者血清Tim-3水平，并同時檢測血清ALT、TBIL、HBV-DNA、HBc-Ab水平，并做統(tǒng)計學(xué)處理。結(jié)果慢性HBV感染者血清Tim-3水平較健康組升高，急性發(fā)作組Tim-3、ALT、HBcAb水平顯著高于CHB組及AsC組，Tim-3水平與ALT、HBcAb成正相關(guān)。相關(guān)性分析顯示當(dāng)2×ULNlt;ALTlt;10×ULN(正常范圍上限)與Tim-3相關(guān)性更加明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.01)；所有患者Tim-3水平與HBV-DNA載量無明顯相關(guān)。結(jié)論慢性HBV感染者有較高的Tim-3水平，且急性發(fā)作時Tim-3升高更明顯，與ALT明顯相關(guān)，可以作為慢性HBV感染者病情變化的監(jiān)測指標(biāo)之一。

慢性乙型病毒感染；慢性乙肝急性發(fā)作；Tim-3；谷丙轉(zhuǎn)氨酶

(ChinJLabDiagn,2017,21:1901)

慢性乙型肝炎是目前我國廣泛流行、危害較嚴(yán)重的傳染病，大多肝硬化、肝癌患者均伴有乙肝病毒感染，因此及時了解慢性乙肝患者的病情變化十分必要。研究表明，機體的細(xì)胞免疫功能水平在慢性乙肝患者病情變化過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[1]。Tim-3(T cell immunoglobulin-and mucin-domain-containing molecule-3，Tim-3)屬于T細(xì)胞免疫球蛋白粘蛋白基因家族，主要表達(dá)在Th1細(xì)胞上的免疫調(diào)節(jié)分子，具有導(dǎo)致Th1細(xì)胞凋亡和負(fù)性調(diào)節(jié)Th1型免疫功能的作用[2]。研究發(fā)現(xiàn)，在HBV感染的過程中，Th1細(xì)胞通過分泌細(xì)胞因子促進(jìn)細(xì)胞免疫反應(yīng)，利于清除病毒[3]。另有研究發(fā)現(xiàn)慢性乙肝患者單核細(xì)胞表面Tim-3的mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)顯著升高[4]。這些均提示Tim-3在乙肝病毒感染過程中發(fā)揮著重要的作用。本文分析不同狀態(tài)的慢性HBV感染者血清Tim-3水平，及其與其他指標(biāo)的關(guān)系，進(jìn)一步探討Tim-3在慢性乙肝病情變化過程中的監(jiān)控作用。

1 資料與方法

1.1病例標(biāo)本收集收集2015年7月至2016年12月在我院門診及住院慢性乙肝病毒感染者共112例，男59例，女53例，平均年齡45.4歲。按2015年版《慢性乙肝防治指南》[5]分為：慢性乙肝患者39例，男21例，女18例；慢性乙肝病毒攜帶者42例，男22例，女20例，慢性乙肝急性發(fā)作患者31例，男17例，女14例。所有患者其他肝炎標(biāo)志物檢查為陰性，排除柯薩奇病毒、艾滋病病毒等其他病毒感染，排除藥物、飲酒等對肝臟的損害。另選同期40例健康體檢者作為對照組，男21例、女19例，平均年齡48.3歲，肝、腎功能檢查正常，各項病毒標(biāo)志物檢查為陰性。所有入選對象清晨抽取兩管靜脈血，待凝固后4 000 r/min離心10 min分離血清備用。

1.2儀器與方法

1.2.1生化免疫指標(biāo)檢測 德靈生化分析儀及配套試劑檢測ALT、TBIL水平，索林化學(xué)發(fā)光分析儀及配套試劑檢測HBc-Ab含量，羅氏PCR分析儀及配套試劑檢測HBV-DNA拷貝數(shù)。

1.2.2Tim-3檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測，試劑購自上海瓦蘭生物科技有限公司，用北京普朗新技術(shù)有限公司NDM-9602G酶標(biāo)儀讀取數(shù)值。

2 結(jié)果

2.1CHB組和CHB急性發(fā)作組Tim-3、ALT水平較AsC組及對照組顯著升高；且急性發(fā)作組顯著高于其他各組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.05)。見表1。

表1 4個組別檢測指標(biāo)比較

注：a與對照組比較，b與AsC組比較，c與CHB組比較：Plt;0.05.

2.2Tim-3與不同ALT水平及其他指標(biāo)的相關(guān)性分析

Tim-3水平隨ALT升高而上升，當(dāng)2×ULNlt;ALTlt;10×ULN的患者血清Tim-3水平與ALT顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r值為0.67。Tim-3水平與HBcAb成正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r值為0.52，與TBIL的相關(guān)系數(shù)r值為0.23，無明顯相關(guān)，與HBV-DNA拷貝數(shù)無相關(guān)性。見表2。

表2 不同ALT水平與其他指標(biāo)水平比較

注：a與ALTlt;2×ULN比較：Plt;0.05.b與 5～10×ULN組比較：Pgt;0.05.

3 討論

HBV感染機體后可有多種臨床狀態(tài)，目前關(guān)于感染進(jìn)展的原因仍不明確。研究表明，HBV不直接殺傷肝細(xì)胞，而是誘導(dǎo)機體免疫應(yīng)答造成肝細(xì)胞損傷及炎癥反應(yīng)，而免疫應(yīng)答的持續(xù)存在是CHB發(fā)展為肝硬化、肝癌的重要因素[6]。因此，HBV感染機體后機體的免疫應(yīng)答水平強弱及細(xì)胞免疫功能是影響病情的轉(zhuǎn)歸和臨床表現(xiàn)狀態(tài)的重要因素。眾所周知，Th細(xì)胞在調(diào)節(jié)機體細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答水平的動態(tài)平衡中其關(guān)鍵作用。既往研究發(fā)現(xiàn)，Th1細(xì)胞在機體HBV感染過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，可分泌多種細(xì)胞因子，增加CD8+細(xì)胞活性，促進(jìn)細(xì)胞免疫應(yīng)答，提高了機體清除病毒的能力，但同時加重肝細(xì)胞損傷，使ALT、AST等反應(yīng)肝損傷的指標(biāo)升高[7]。Th2細(xì)胞誘發(fā)機體體液免疫反應(yīng)以清除細(xì)胞外病原體，防止感染源的擴散，同時抑制細(xì)胞免疫應(yīng)答水平，降低肝臟損傷[8]。因此，Th1及Th2細(xì)胞亞群動態(tài)平衡的建立，對HBV感染者的治療有重要意義。

Tim-3是T細(xì)胞免疫球蛋白粘蛋白基因家族成員之一，主要表達(dá)在分化終末期的Th1細(xì)胞上，另在多種其他免疫細(xì)胞如NK細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞等表面也有表達(dá)[9]。在機體病毒感染過程中Tim-3與其配體galectin-9信號傳導(dǎo)通路參與Th1細(xì)胞凋亡及免疫耐受的形成。研究發(fā)現(xiàn)在HIV、HCV等病毒慢性感染過程中，阻斷Tim-3/ galectin-9通路可恢復(fù)部分特異性T細(xì)胞的增殖及細(xì)胞因子分泌水平[10]，另有研究發(fā)現(xiàn)，阻斷CHB患者Tim-3/ galectin-9通路可以促進(jìn)表達(dá)IFN-γ的HBV特異性CTL增殖，增強抗病毒效應(yīng)[11]。這些均表明在病毒感染過程中Tim-3可負(fù)向調(diào)節(jié)Th1細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫水平，參與病毒感染疾病進(jìn)程。本文從HBV感染后患者的不同臨床表現(xiàn)狀態(tài)，分析Tim-3在HBV感染的不同臨床狀態(tài)的表達(dá)水平變化，進(jìn)一步探討其在乙肝發(fā)生、發(fā)展中的作用。

本實驗發(fā)現(xiàn)，慢性HBV感染者有較高的Tim-3水平，且與肝功指標(biāo)關(guān)系密切。慢性乙肝病毒攜帶者ALT正常但Tim-3水平較對照組有升高。分析原因可能為，乙肝病毒攜帶者機體對感染乙肝病毒的肝細(xì)胞處于免疫耐受狀態(tài)，具有免疫應(yīng)答作用的T細(xì)胞處于較低水平，免疫系統(tǒng)不能有效識別HBV，不能HBV產(chǎn)生有效免疫應(yīng)答[12]，而Tim-3/ galectin-9通路持續(xù)活動可能是造成機體抗病毒免疫應(yīng)答低下的因素之一。根據(jù)ALT水平分類比較顯示，當(dāng)ALTgt;2×ULN，Tim-3水平有明顯的上升，與HBV病毒載量無明顯相關(guān)。2015年版《慢性乙肝防治指南》中指出ALTgt;2×ULN為接受抗病毒治療人群的標(biāo)準(zhǔn)，提示當(dāng)ALTgt;2×ULN時，肝臟炎癥活動較重，此時機體免疫細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子可能處于較高水平[5]，從而刺激Tim-3水平的升高來負(fù)向調(diào)控機體Th1細(xì)胞水平，降低細(xì)胞因子的分泌，ALT水平的越高，Tim-3水平的升高越明顯。當(dāng)ALTgt;10×ULN后，對比5×ULNlt;ALTlt;10×ULN范圍，Tim-3水平變化無統(tǒng)計學(xué)意義(Pgt;0.05)，說明兩者并不是一直密切相關(guān)，Tim-3水平可能還受其他因素影響，有待進(jìn)一步研究。

總之，不同狀態(tài)的慢性乙肝病毒感染者有不同的Tim-3水平，其水平變化與疾病的進(jìn)展密切相關(guān)，本研究由于病例較少及方法學(xué)限制，具體機制有待進(jìn)一步研究，Tim-3可以作為慢性HBV感染者免疫應(yīng)答水平的監(jiān)測指標(biāo)，對慢性乙肝的急性發(fā)作有較好的監(jiān)控作用。

[1]Trepo C,Chan HL,Lok A.Hepatitis B virus infection [J].Laccet,2014.

[2]Gen C,Han GJ,Chen B,et al.Tim-3:an activation marker and activation limiter of innate immune cells [J].Frontiers in immunology,2013,4:449.

[3]Vinay,Sundaram Kris,Kowdley.Management of chronic hepatitis B Infection [J].BMJ,2015,351:h4263.

[4]高西陽，李 攙，潘修成,等.慢性乙型肝炎患者外周血單核細(xì)胞Tim-3表達(dá)的檢測及意義[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2013,29,7:739.

[5]中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會，中華醫(yī)學(xué)會感染病學(xué)分會.慢性乙型肝炎防治指南(2015年版)[J].實用肝臟病雜志,2016,19(03):389.

[6]Das A,Maini MK.Innate and adaptive immune responses in hepatitis Bvirus infection [J].Digestive diseases,2010,28(1):126.

[7]Zhu C,Anderson AC,Schubart A,et al.The Tim-3 ligand galectin-9 negatively regulates T helper type 1 immunity [J].Nat Immunol,2005,6(12):1245.

[8]Dimpu,Gogoi Biswajyoti,Borkakoty Dipankar,et al.Activation and Exhaustion of Adaptive Immune Cells inHepatitis B Infection [J].Viral Immunology ,2015,28(7):348.

[9]余真君，朱堅勝.TIM-3在慢性HBV感染中的免疫調(diào)節(jié)作用 [J].中國免疫學(xué)雜志,2016,2(2):267.

[10]Moorman JP,Wang JM,Zhang Y,et al.Tim-3 pathway controls regulatory and effector T cell balance during hepatitis C virus infection [J].J Immunol,2012,189(2):755.

[11]Nebbia G,Peppa D,Schurich A,et al.Upregulation of the Tim-3/galectin-9 pathway of T cell exhaustion in chronic hepatitis B virus infection[J].PLoS One,2012,7(10):e47648.

[12]Norihiro,Furusyo Motohiro,Shimizu Eijchi,et al.Hepatitis B Virus Infection:Current Trends and Issues [J].The Japanese Journal of Clinical Pathology,2015,63(6):755.

StudyontherelationshipbetweenserumTim-3levelandthediseaseprocessindifferentstateofhepatitisBvirusAN

Zhong-wu1,WANGBo1,DAIShan-mei2,etal.

(1.ClinicalLaboratory; 2.InfectionDepartment,TheEastHospitalofLianYungang,Lianyungang222042，China)

ObjectiveAnalysis the change of serum Tim-3 level in different state of chronic hepatitis B virus infected patients and the relationship with the disease process.MethodsDetect serum Tim-3 levels in 39 cases of chronic hepatitis B patients(CHB),42 cases of hepatitis B virus carriers(AsC),31 cases of chronic hepatitis B patients with acute exacerbation and 40 cases of healthy people,meanwhile detect the levels of serum ALT,TBIL,HBV-DNA and HBc-Ab,then make statistics processing.ResultsThe levels of serum Tim-3 were higher in HBV infected patients than healthy group,the level of serum Tim-3,ALT,HBcAb in acute exacerbation group were significantly higher than that of CHB and AsC group.There was positive correlation between Tim-3 and ALT,HBcAb .Correlation analysis showed that when the ALT levels between 2 ULN and 10 ULN(the limit of the normal range),the correlation was more obvious,the difference was statistically significant (Plt;0.05).There was no significant association between Tim-3 and HBV-DNA in all the patients.ConclusionChronic HBV infected patients have a higher level of Tim-3,and more obvious when it acute exacerbation,and was significantly related with ALT level.It can be used as one of a monitoring indicator in the chronic HBV infected patients disease progression.

Chronic hepatitis B virus infection;Chronic hepatitis B acute exacerbation;Tim-3;ALT

連云港市科技局社會發(fā)展項目(ZD1507)

*通訊作者

1007-4287(2017)11-1901-03

R575.1

A

安仲武(1983-)，男，主管檢驗師，檢驗科副主任，研究方向：臨床生化免疫標(biāo)志物的應(yīng)用。

2016-12-17)