焦婷婷，魏 巖，李建華，張水文

(陸軍總醫(yī)院 生殖醫(yī)學(xué)中心，北京100700)

不同人工周期子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備方案在冷凍囊胚移植中的應(yīng)用

焦婷婷，魏 巖，李建華，張水文*

(陸軍總醫(yī)院 生殖醫(yī)學(xué)中心，北京100700)

目的對冷凍囊胚移植的患者采用人工周期方案(E-P)、促性腺激素釋放激素激動劑(GnRH-α) +人工周期方案(GnRH-α+E-P)、口服避孕藥+人工周期方案(OC+E-P)三種方法準(zhǔn)備子宮內(nèi)膜，探討三種人工周期方案在冷凍囊胚移植中的臨床應(yīng)用。方法將我中心2016年6月至2017年3月因不孕接受冷凍囊胚移植的患者分為三組處理子宮內(nèi)膜，A組196個凍融周期采用E-P方案；B組182個凍融周期采用GnRH-α+E-P方案；C組106個凍融周期采用OC+E-P方案。比較三組患者間年齡、BMI指數(shù)、不孕年限、基礎(chǔ)FSH值、加用孕激素日雌激素水平、子宮內(nèi)膜厚度、移植囊胚數(shù)、優(yōu)質(zhì)囊胚數(shù)、生化妊娠率、臨床妊娠率和異位妊娠率之間的差異。結(jié)果3組患者的年齡、BMI指數(shù)、不孕年限、基礎(chǔ)FSH值、加用孕激素日雌激素水平、子宮內(nèi)膜厚度、移植囊胚數(shù)、移植優(yōu)質(zhì)囊胚數(shù)和優(yōu)質(zhì)囊胚率之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P≥0.05);GnRH-α+E-P方案組患者生化妊娠率和臨床妊娠率高于單純?nèi)斯ぶ芷诜桨附M，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.05)，OC+E+P組的生化妊娠率和臨床妊娠率與單純?nèi)斯ぶ芷诜桨附M相比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P≥0.05)，3組間異位妊娠率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P≥0.05)。結(jié)論GnRH-α用于冷凍囊胚移植人工周期準(zhǔn)備子宮內(nèi)膜的方案可以提高臨床妊娠率。

促性腺激素釋放激素激動劑；冷凍囊胚移植;激素替代治療

(ChinJLabDiagn,2017,21:1869)

凍融囊胚移植(FET)是指在自然周期或人工周期下的子宮內(nèi)膜著床期，將冷凍復(fù)蘇的胚胎移植入子宮腔中。FET不僅可以為新鮮周期移植的患者保存多余的胚胎，避免多次的促排卵和取卵，也可以為因子宮內(nèi)膜異常、卵巢過度刺激(OHSS)、需放化療的腫瘤等因素放棄新鮮周期移植的患者保存生育力。有研究報道FET在胚胎著床率和臨床妊娠率方面與新鮮周期相比均較高[1]。本研究通過回顧性分析我中心三種人工周期方案用于冷凍囊胚移植的臨床情況，旨在尋找提高FET成功率的最佳方案。

1 資料與方法

1.1臨床資料

2016年 6 月至 2017 年3月因不孕癥在陸軍總醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心接受人類輔助生殖助孕治療，并有冷凍囊胚保存的患者為研究對象，共計417個患者，484個周期(部分患者行2次以上冷凍囊胚移植術(shù))。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡 22至39歲，人工周期準(zhǔn)備子宮內(nèi)膜，胚胎均為受精后第5或第6天經(jīng)玻璃化冷凍保存的囊胚，排除標(biāo)準(zhǔn):(1)超聲提示子宮內(nèi)膜過薄(lt;7 mm)，子宮內(nèi)膜息肉等或?qū)m腔鏡檢查提示子宮內(nèi)膜病變的患者；(2)染色體異常；(3)贈卵周期。

1.2方法

1.2.1胚胎的玻璃化冷凍與復(fù)蘇冷凍 先利用激光破膜儀對第5天或第6天擴張較好的囊胚進行人工皺縮，等囊腔基本全部皺縮后，將囊胚移入基礎(chǔ)冷凍平衡液中處理2 min，再將皺縮的囊胚移入平衡液(ES)中處理10 min，然后移入冷凍(VS)中處理60 s，最后將囊胚裝入Cryoloop 上，液氮內(nèi)保存。復(fù)蘇：液氮中取出冷凍的囊胚，將Cryoloop中的囊胚放入37℃事先預(yù)熱30 min的1 ml含1 mol蔗糖的基礎(chǔ)培養(yǎng)液中1 min,0.5M蔗糖溶液中3 min，再放入 0.25M蔗糖溶液中3 min，觀察胚胎情況，用激光輔助儀囊胚對進行孵化，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，等待移植。

1.2.2囊胚的分級 采用Gardner評分系統(tǒng)對囊胚進行分級，評分4AA、4BB、4AB、4BA的囊胚為優(yōu)質(zhì)胚胎。

1.2.3子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備方法 三組均采用人工周期，A組(E-P方案)：于月經(jīng)周期第2天開始口服戊酸雌二醇片(補佳樂 拜耳公司)6 mg/d，7 d后加至8 mg/d，于月經(jīng)周期14天監(jiān)測雌激素水平和子宮內(nèi)膜厚度，子宮內(nèi)膜厚度≥8 mm時加用黃體酮凝膠(雪諾酮 默克雪蘭諾公司)90 mg 1次/日和地區(qū)孕酮片(達芙通，荷蘭雅培公司)40 mg/d轉(zhuǎn)化內(nèi)膜，用藥第7天晨行冷凍囊胚移植術(shù)。B組(GnRH-α+E-P方案)：月經(jīng)不規(guī)律、月經(jīng)周期第2天激素孕酮過高(超過1 ng/ml)，月經(jīng)期有卵巢囊腫或優(yōu)勢卵泡形成，或曾行移植失敗的患者于月經(jīng)第2天注射 3.75 mg長效 GnRH-a(達必佳，德國輝凌公司)預(yù)處理，30 d后給予準(zhǔn)備內(nèi)膜同A組方案。C組(OC+E-P方案)：于月經(jīng)周期第3天給予去氧孕烯炔雌醇片(媽富隆，荷蘭歐加農(nóng)公司)1片/d×21天，停藥后待月經(jīng)來潮第2天給予準(zhǔn)備內(nèi)膜方案同A組。

1.2.4黃體支持和妊娠胚胎移植后繼續(xù)給予補佳樂8 mg/d+黃體酮凝膠90 mg 1次/日+地區(qū)孕酮片40 mg/d進行黃體支持，移植14天后檢測血HCG,如血HCG升高，給予繼續(xù)用藥，移植后 28天超聲見孕囊、胚芽及原始心血管搏動者為臨床妊娠。

1.2.5觀察臨床指標(biāo) ①生化妊娠率:生化妊娠數(shù) /移植周期數(shù)；②臨床妊娠率:臨床妊娠數(shù) /移植周期數(shù)；③異位妊娠率：異位妊娠數(shù)/移植周期數(shù)。

1.2.6統(tǒng)計學(xué)分析 采用 SPSS 18.0處理數(shù)據(jù)。采用單因素方差分析比較3組患者基本資料，采用χ2檢驗3組患者的囊胚種植率、生化妊娠率、臨床妊娠率等指標(biāo)的差異，Plt;0.05差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1三種人工周期子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備方案患者基本資料的比較

統(tǒng)計結(jié)果顯示三組患者在年齡、不孕年限、BMI指數(shù)、基礎(chǔ) FSH值、加用孕激素日E2值、加用孕激素日子宮內(nèi)膜厚度、移植囊胚數(shù)、移植優(yōu)質(zhì)囊胚率和優(yōu)質(zhì)囊胚率方面差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P≥0.05)。見表1。

表1 三種人工周期子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備方案患者基本資料

2.2三種人工周期子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備方案患者臨床結(jié)局的比較

484個FET周期中，生化妊娠276例，生化妊娠率為 57.02%(276/484);臨床妊娠 258 例，臨床妊娠率為 50.41% (244/484) ;異位妊娠 1 例，異位妊娠率為 0.2%(1/484)。兩兩比較的結(jié)果得出：B組(GnRH-α+E-P)的生化妊娠率和臨床妊娠率均高于A組(E+P)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.05)。C組(OC+E-P)的生化妊娠率和臨床妊娠率較A組(E+P)高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P≥0.05)，B組的生化妊娠率和臨床妊娠率高于C組，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P≥0.05)，三組間異位妊娠率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P≥0.05)。見表2。

表2 三種人工周期子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備方案患者臨床結(jié)局

*生化妊娠率A組和B組相比較P=0.049；*臨床妊娠率A組和B組相比較P=0.020

3 討論

胚胎植入是指從胚胎著床到胎盤形成的一系列復(fù)雜的生理過程。隨著輔助生殖技術(shù)的發(fā)展，凍融胚胎移植被廣泛運用。有研究表明在促排卵過程中由于外源性Gn的大量的運用，導(dǎo)致雌激素過高，子宮內(nèi)膜的容受性降低，與胚胎發(fā)育的同步性較差，移植的成功率低于凍融胚胎移植的成功率[2,3]，因此有中心建議取消新鮮周期的移植，進行全胚冷凍[4]。

高質(zhì)量的胚胎是FET成功的重要條件之一，大量的研究證明囊胚的移植成功率高于卵裂期胚胎，胚胎在體外從卵裂期培養(yǎng)到囊胚期可以淘汰質(zhì)量較差的，篩選出具有更好發(fā)育潛能的胚胎，囊胚移植入子宮中能夠更快的著床于子宮內(nèi)膜，種植的成功率更高，同時可以降低患者移植次數(shù)，減少冷凍保存所消耗的液氮等資源[5,6]。目前我中心采用的是移植或冷凍2枚優(yōu)質(zhì)的D3胚胎，剩余胚胎全部培養(yǎng)囊胚，在本研究中的凍融周期移植均為凍融囊胚移植。

子宮內(nèi)膜的準(zhǔn)備方法涉及到子宮內(nèi)膜的容受性及和胚胎發(fā)育的同步性。有回顧性的文獻分析認(rèn)為在凍融胚胎移植和凍融囊胚移植時兩種方案的著床率、臨床妊娠率和分娩率均無明顯差異，因此有研究者認(rèn)為應(yīng)該首選簡單經(jīng)濟的自然周期方案準(zhǔn)備內(nèi)膜[7,8]。在本中心的實際工作中，我們發(fā)現(xiàn)，有相當(dāng)一部分的患者在取完卵后面的一個甚至幾個月經(jīng)周期里，由于卵巢尚未恢復(fù)，經(jīng)常發(fā)生排卵異常、卵巢生理性囊腫，月經(jīng)期間激素異常等情況干擾自然周期的監(jiān)測和移植，增加了周期取消率，因此本中心對這一部分患者選擇采用人工周期的內(nèi)膜準(zhǔn)備方案。這其中也有少數(shù)患者對外源性的雌激素的應(yīng)用并不敏感，會發(fā)生內(nèi)膜厚度沒有自然周期厚度高，或者雌激素抑制不住排卵的現(xiàn)象。因此綜合來說，兩種內(nèi)膜準(zhǔn)備方案各有優(yōu)勢，需要根據(jù)患者的情況選擇適宜的方案。

對于GnRH-α在FET的研究中，有多項報道表明在人工周期使用GnRH-α進行預(yù)處理后，其臨床妊娠率較對照組提高，胚胎停育和異位妊娠的發(fā)生率降低[9,10]。郭慧[11]等人研究報道稱對于PCOS 患者，F(xiàn)ET失敗后再次移植時采用GnRH-α降調(diào)節(jié)人工周期方案，可減少周期取消，提高妊娠率和著床率。有學(xué)者等認(rèn)為，PCOS 患者高 LH對子宮內(nèi)膜的容受性有不利作用，GnRH-α預(yù)處理方案可以降低其影響[12]。還有人認(rèn)為，降調(diào)解后可以更好的抑制垂體和卵巢激素的分泌，完全采用外源性激素可以使子宮內(nèi)膜和胚胎的發(fā)育更為同步化[13]。在本研究中，我們的結(jié)果提示了GnRH-α+E+P組的生化妊娠率和臨床妊娠率高于E+P組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，異位妊娠率無明顯差別，和文獻報道相一致。猜測其原因可能是GnRH-α對于一部分PCOS患者和隱性子宮內(nèi)膜異位癥患者起到了一定的作用。GnRH-α究竟怎樣作用于子宮內(nèi)膜細胞引起內(nèi)膜容受性的改變，目前的研究尚不是十分清楚，有報道稱GnRH-α使子宮內(nèi)膜上胞飲突的形成時間提前，影響了“種植窗”的形成時間[14,15]，另外GnRH-α還可以增加子宮內(nèi)膜胞飲突的數(shù)量，提高細胞粘附分子整合素ανβ3的表達，改善子宮內(nèi)膜的容受性[16]。

口服避孕藥OC輔助GnRH-α降調(diào)節(jié)常用于COH的改良長方案中，對于FET的患者，前一周期采用口服避孕藥OC預(yù)處理可以負反饋抑制垂體FSH和LH的分泌，起到一定的降調(diào)節(jié)作用，并可以抑制排卵，避免卵巢黃素化囊腫的形成，減少周期取消率[17]。本研究的結(jié)果顯示OC+E+P組的妊娠率和單純?nèi)斯ぶ芷诮M相比妊娠率增高，但結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)差異，和GnRH-α相比，OC的降調(diào)節(jié)力度沒有那么大，但更為經(jīng)濟，對于適宜的患者也可以選用OC降調(diào)節(jié)。

綜上所述，GnRH-α降調(diào)節(jié)加人工周期的方案對于冷凍囊胚移植患者的臨床結(jié)局具有一定的改善作用。但是本研究的樣本量較小，明確該方案的臨床價值和GnRH-α的作用機制需要進一步的研究。

[1]Hill MJ,Miller KA,Frattarelli JL.A GnRH agonist and exogenous hormone stimulation protocol has a higher live-birth rate than a natural endogenous hormone protocol for frozen-thawed blastocyst-stage embryotransfer cycles:an analysis of 1391 cycles[J]．Fertil Steril，2010，93(2):416 .

[2]Chen QJ,SUN XX,Li L,et al.Effects of ovarian high response on implantation and pregnancy outcome during controlled ovarian hyperstimulation ( with GnRH agonist and rFSH)[J]．ACTA Obstet Gynecol Scand，2007，86(7):849.

[3]Shapiro BS，Daneshmand ST，Garner FC，et al.Evidence of impaired endometrial receptivity after ovarian stimulation for in vitro fertilization:a prospective randomized trial comparing fresh and frozen-thawed embryo transfer in normal responders[J]．Fertil Steril，2011，96(2):344.

[4]Weinerman R,Mainigi M.Why we should transfer frozen instead of fresh embryos:the translational rationale?[J] ．Fertil Steril，2014，102(1):10.

[5]Blake D,Farquhar CM,Johnson N,et al.Cleavage stage versus blastocyst stage embryo transfer in assisted conception[J].Cochrane Database Syst Rev，2007，17(4):CD002118.

[6]Reh A，F(xiàn)ino E，Krey L，et al.Optimizing embryo selection with day5 transfer[J]．Fertil Steril，2010，93(2) :609.

[7]Givens CR,Markun LC,Ryan IP,et al.Outcomes of natural cycles versus programmed cycles for 1677 frozen - thawed embryo transfers Reprod Biomed Online，2009，19(3):380.

[8]Ghobara T,Vandekerckhove P.Cycle regimens for frozen-thawed embryo transfer[J].Cochrane Database Syst Rev，2008(1):CD003414.

[9]Fatemi HM,Kyrou D,Bourgain C,et al.Cryopreserved-thawed human embryo transfer:spontaneous natural cycle is superior to human chorionic gonadotropin-induced natural cycle[J]．Fertil Steril，2010，94(6):2054.

[10]Al-Inany H，van-Gelder P.Success of frozen embryo transfer:Does the type of gonadotropin influence the outcome?[J]．Int J Womens Health，2010，2:89.

[11]郭 慧，龔 菲，羅克麗,等．兩種雌孕激素替代法內(nèi)膜準(zhǔn)備對多囊卵巢綜合征冷凍胚胎移植臨床效果的比較[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2013，23(2):74.

[12]Griesinger G，Weig M，Schroer A，et al．Mid-cycle serum levels of endogenous LH are not associated with the likelihood of pregnancy in artificial frozen-thawed embryotransfer cycles without pituitary suppression[J]．Hum Reprod，2007，22(10):2589.

[13]Gelbaya T,Nardo L,Hunter H,et al.Cryopreservedthawed embryo transfer in natural or down-regulated hormonally con-trolled cycles:a retrospective study[J].Fertil Steril，2006，85(3):603.

[14]Bourgain C.Endometrial biopsy in the evaluation of endometrial receptivity[J].J Gynecol Obstet Biol Reprod(Paris),2004,33(1 Pt2):S13.

[15]Glujovsky D,Pesce R,Fiszbajn G,et al.Endometrial preparation for women undergoing embryo transfer with frozen embryos or embryos derived from donor oocytes[J].Cochrane Database Syst Rev,2010(1):CD006359．

[16]Neukomm C,Mueller MD.New insights into the pathophysiology of endometriosis[J].Gynakol Geburtshilfliche Rundsch，2007，47(3):113.

[17]Koras，Bag PE，witt BR，et al.Hypothalminc-pituitary suppression with oral coneraceptive pills Does Not improve outcome in Poor Responder Patients Undergoing In Vitro Fertilization-Embryo Transfer Cycles[J].Assi Repro Genetics，2001，7：391.

ApplicationofdifferentHRTprotocolsforendometrialpreparationinfrozenblastocysttransfercycles

JIAOTing-ting，WEIYan，LIJian-hua，etal.

(ReproductiveMedicineCenter，PLAArmyGeneralHospital，Beijing100700，China)

ObjectiveTo compare the pregnancy outcomes of three hormone replacement therapy (HRT)protocols used to prepare the endometrium for frozen-thawed blastocyst transfer.MethodsRetrospective analysis of clinical data with the patients

frozen-thawed blastocyst transfer from Jun.2016 to Mar.2017 in our center was performed.The patients were divided into three groups：group A(196 cycles)taked only HRT protocol(E-P)； group B(182 cycles)taked gonadotrophin releasing hormone agonist (GnRH-α) plus HRT protocol(GnRH-α+E-P)； group C(106 cycles)received oral contraceptive(OC)plus HRT protocol(OC+E-P).The age of the patients,etiology of female infertility，basal FSH，estrogen level and endometrial thickness on the day of progesterone initiation day,the number of blastocysts and high quality blastocysts,biochemical pregnancy rate,clinical pregnancy rate and ectopic pregnancy rate were compared between the three groups.ResultsThere were no significant differences in the age of the patients,etiology of female infertility,basal FSH,estrogen level and endometrial thickness on the day of progesterone initiation day,the number of blastocysts and high quality blastocysts,biochemical pregnancy rate,clinical pregnancy rate and ectopic pregnancy rate between three groups(P≥0.05)，but the biochemical pregnancy rate and the clinical pregnancy rate was significantly higher in group B than group A (Plt;0.05),while there were no statistical differences in biochemical pregnancy rate and clinical pregnancy rate between group A and group C (P≥0.05)，in addition there was also no significant difference in ectopic pregnancy rate between the three groups(P≥0.05).ConclusionGnRH-α can be used in the HRT to prepare the endometrium for frozen-thawed blastocyst transfer,which can improve the clinical pregnancy rate.

GnRH-α； frozen-thawed blastocyst transfer；hormone replacement therapy

國家自然科學(xué)基金資助項目(81401271)

*通訊作者

1007-4287(2017)11-1869-04

R282.71 R587.2

A

焦婷婷(1985-)，女，博士，主要從事生殖醫(yī)學(xué)研究。

2017-04-21)