王心珉

【摘要】 目的 探討紫光分光光度法和高效液相色譜法測定百令膠囊中D-甘露醇含量的差異。方法 采用紫光分光光度法和高效液相色譜法測定百令膠囊中D-甘露醇含量， 并比較不同方法測定的D-甘露醇含量。結(jié)果 紫光分光光度法測定的D-甘露醇含量為（6.03±0.35）mg/g， 顯著低于高效液相色譜法的（6.52±0.35）mg/g， 差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。紫光分光光度法測定的D-甘露醇含量與高效液相色譜法呈正相關(guān)（r=0.965， P=0.002<0.05）。結(jié)論 高效液相色譜法的靈敏度、穩(wěn)定性、準(zhǔn)確度、重復(fù)性均優(yōu)于紫光分光光度法， 但紫光分光光度法操作比較簡單， 對試劑的要求較低， 不需要特定標(biāo)準(zhǔn)品， 經(jīng)濟(jì)、快速， 故更適用于百令膠囊中D-甘露醇的日常定量檢測。

【關(guān)鍵詞】 紫光分光光度法；高效液相色譜法；百令膠囊；D-甘露醇

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2017.31.114

百令膠囊是《中國藥典》收載的藥品， 是人工發(fā)酵冬蟲夏草菌粉所得菌絲體而制成的膠囊， 其有效成分為19種氨基酸、D-甘露醇、生物堿、維生素及微量元素等， 具有補肺腎、益精氣及止咳化痰作用[1]， 主要用于治療慢性腎衰、IgA腎病、腎小球腎炎、腎小管損傷、腎移植、2型糖尿病伴微量白蛋白尿、反復(fù)發(fā)作性尿路感染、肝疾病、呼吸系統(tǒng)疾病等[2]。有研究顯示， 百令膠囊可通過抑制炎癥因子白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）， 并增加可溶性細(xì)胞間粘附分子-1（sICAM-1）的表達(dá)， 抑制淋巴細(xì)胞增殖， 具有雙向免疫調(diào)節(jié)作用[3]。還有研究表明， D-甘露醇即蟲草酸是真菌類藥物的主要成分之一， 具有利尿脫水、鎮(zhèn)咳祛痰平喘、降脂等功效， 并且也是人工冬蟲夏草的主要質(zhì)控指標(biāo)[4]。本研究通過紫光分光光度法和高效液相色譜法測定D-甘露醇的含量， 并比較兩種方法的準(zhǔn)確度， 為該藥物的質(zhì)控提供參考。

1 材料與方法

1. 1 儀器與試劑 主要儀器包括高效液相色譜儀（Waters系列）、UV-2000紫光可見分光光度計、電子天平（BP121S）、恒溫水浴鍋、混勻器、清洗器。主要試劑包括百令膠囊（購自中美華東制藥有限公司）、D-甘露醇對照品、高碘酸鈉、乙醇、硫酸、碘化鉀、L-鼠李糖、乙酰丙酮、醋酸銨、冰醋酸。

1. 2 方法

1. 2. 1 主要試劑溶液的制備 ①0.1% L-鼠李糖溶液的制備：稱取L-鼠李糖0.1 g于100 ml的容量瓶中， 加蒸餾水定容至100 ml， 混勻， 待用。②0.015 mol/L的高碘酸鈉溶液的制備：稱取0.321 g高碘酸鈉溶于0.12 mol/L的鹽酸溶液中， 定容至100 ml， 混勻， 待用。③Nash試劑的制備： 取75 g醋酸銨、1 ml冰醋酸、1 ml乙酰丙酮加蒸餾水定容至500 ml。

1. 2. 2 對照品溶液的制備 稱取D-甘露醇對照品0.05 g于50 ml錐形瓶中， 加蒸餾水定容至100 ml， 加熱使之溶解， 搖勻， 放置冰箱內(nèi)冷藏， 待用。

1. 2. 3 樣品溶液的制備 將百令膠囊粉末篩后， 稱取0.3 g樣品至50 ml具塞錐形瓶中， 加入25 ml乙醇， 稱重， 加熱回流2 h， 冷卻， 用乙醇不足重量， 搖勻過濾， 取25 ml濾液進(jìn)行干燥， 殘渣用流動相加熱轉(zhuǎn)溶至容量瓶中， 冷卻， 加蒸餾水定容至25 ml， 即得。

1. 2. 4 空白溶液的制備 步驟同“1.2.3”， 加入25 ml乙醇至50 ml具塞錐形瓶中， 稱重， 加熱回流2 h， 冷卻， 用乙醇不足重量， 搖勻過濾， 取25 ml濾液進(jìn)行干燥， 殘渣用流動相加熱轉(zhuǎn)溶至容量瓶中， 冷卻， 加蒸餾水定容至25 ml， 即得。

1. 3 紫光分光光度法

1. 3. 1 吸光度值的測定 吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ml對照品溶液分別置于容量瓶中， 加入蒸餾水定容至100 ml， 混勻， 再各吸取1 ml置于試管中， 分別加入 0.015 mol/L的高碘酸鈉溶液1 ml， 放置10 min， 加入0.1% L-鼠李糖溶液， 最后加入4 ml Nash試劑， 搖勻， 在恒溫水浴箱中加熱15 min， 然后冷卻， 以蒸餾水作為空白溶液， 在412 nm處測定D-甘露醇對照品的吸光度值。

1. 3. 2 樣品D-甘露醇含量的測定 根據(jù)“1.3.1”測得吸光度值的操作及標(biāo)準(zhǔn)曲線， 吸取樣品溶液1 ml進(jìn)行測定吸光度值， 并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程（Y=0.0431X+0.0033， Y為吸光度值， X為D-甘露醇對照品溶液濃度）計算樣品中D-甘露醇含量。

1. 4 高效液相色譜法

1. 4. 1 色譜條件 色譜柱：Waters sugar-pak-1鈣型（300 mm×6.5 mm）， 流動相：甲醇-0.05 mol/L磷酸氫二鈉溶液（17∶83）， 流速1.0 ml/min， 柱溫：室溫， 進(jìn)樣量：10 ?l。

1. 4. 2 樣品D-甘露醇含量的測定 吸取樣品溶液10 ?l， 根據(jù)“1.4.1”所設(shè)定的色譜條件注入高效液相色譜儀進(jìn)行測定， 記錄峰面積值， 因本樣品為干燥品， 故采用外標(biāo)法計算樣品中D-甘露醇的含量， 公式為：CX=CR（AX/AR）， 其中CX為供試品的含量， CR為對照品的含量， AX為供試品的峰面積或峰高， AR為對照品的峰面積或峰高。

1. 5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x-±s）表示， 采用t檢驗；相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 不同方法測定百令膠囊D-甘露醇含量的比較 紫光分光光度法測定的D-甘露醇含量為（6.03±0.35）mg/g， 顯著低于高效液相色譜法的（6.52±0.35）mg/g， 差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表1。endprint

2. 2 不同方法測定百令膠囊D-甘露醇含量的相關(guān)性分析 紫光分光光度法測定的D-甘露醇含量與高效液相色譜法呈正相關(guān)（r=0.965， P=0.002<0.05）。見圖1。

3 討論

冬蟲夏草是我國傳統(tǒng)藥用真菌， 有2000多年的歷史， 是三大瑰寶之一， 具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗衰老、抗病毒、抗菌、抗炎等作用， 對心、肝、肺、腎、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等具有保護(hù)作用[5]。但因其受自然條件的限制， 產(chǎn)量較低， 價格比較昂貴， 無法在臨床上推廣使用， 故在1983年沈南英等從青海省玉樹及化隆的冬蟲夏草上分離及培養(yǎng)中華束絲孢， 即為百令膠囊[6]。大部分研究均已證實， 百令膠囊具有以下作用：①免疫調(diào)節(jié)作用：主要是通過抑制抗原遞呈細(xì)胞的功能， 阻斷外來信號刺激的呈遞， 影響樹突細(xì)胞刺激增殖的能力， 出現(xiàn)免疫抑制。②抗氧化作用：主要是通過激活單核巨噬細(xì)胞T、B淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞來阻止自由基和脂質(zhì)過氧化的損傷。③抗纖維化作用：主要是通過抑制一些促纖維化因子的表達(dá)來抑制膠原及細(xì)胞外基質(zhì)的生成。④保護(hù)腎功能：主要包括減少尿蛋白， 保護(hù)腎小管細(xì)胞Na+-K+-ATP酶， 促進(jìn)腎小管細(xì)胞增殖及細(xì)胞修復(fù)， 抑制腎小球的代償性肥大。⑤抗炎作用：主要是通過抑制炎癥因子水平， 糾正Th1/Th2失衡。⑥輔助治療腫瘤：百令膠囊中含有的多肽或蛋白質(zhì)、核苷類衍生物、多糖類等能有效抑制腫瘤細(xì)胞生長， 增強放化療的耐受性及減輕毒性[7-9]。

D-甘露醇的測定方法較多， 常用的主要有高碘酸鹽氧化法、旋光法、折光法、比重法、分光光度法、高效液相色譜法等， 其中高碘酸鹽法的重現(xiàn)性和準(zhǔn)確度較好， 但操作比較復(fù)雜、費時， 對操作者的要求較高；旋光法、折光法操作比較簡單、準(zhǔn)確、方便；比重法雖然操作簡單準(zhǔn)確， 但比較費時， 這幾種方法容易受到實驗室的溫度、溶劑、儀器性能等因素的干擾， 導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確， 并且均適用于測定純甘露醇含量[10-12]。紫光分光光度法是指在特定波長處或一定波長范圍內(nèi)光的吸光度， 對待測定物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析的方法， 操作比較簡單、方便、準(zhǔn)確、快捷， 可適用于甘露醇的混合物的檢測， 能夠排除樣品中的其他還原物質(zhì)的干擾， 能夠測定D-甘露醇的實際含量。而高效液相色譜法是以液體為流動相， 采用高壓輸液系統(tǒng)， 將流動相泵入裝有固定相的色譜柱， 在柱內(nèi)各成分被分離后， 進(jìn)入檢測器， 對試樣進(jìn)行分析， 操作比較復(fù)雜， 準(zhǔn)確， 穩(wěn)定性較好， 專屬性強， 但在溶液制備過程中應(yīng)以流動相制備對照品和樣品溶液， 以減少其他溶劑對待測成分折光率的影響， 此外還需要控制柱溫和室溫， 以免影響折光率。大部分研究顯示， 高效液相色譜法中流動相的比例是影響D-甘露醇分離度的主要因素， 本研究采用甲醇-0.05 mol/L磷酸氫二鈉溶液（17∶83）流動相可使D-甘露醇色譜峰與其他峰完全脫離， 達(dá)到較好的分離效果， 能夠測定D-甘露醇的實際含量[13]。故本研究針對紫光分光光度法和高效液相色譜法這兩種方法測量百令膠囊中D-甘露醇的含量進(jìn)行比較。

有研究采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測（HPLC-ELSD）法測定百令膠囊中甘露醇的含量， 結(jié)果顯示， 甘露醇含量為10.00～27.60 mg/g， 平均17.3973 mg/g[14]， 高于本研究兩種方法測定甘露醇的含量。還有研究采用高效液相色譜-示差折光檢測（HPLC-RID）法和滴定法測定百令膠囊中甘露醇的含量[15]， 結(jié)果顯示， HPLC-RID測定的含量為5.94～7.29 mg/g， 與本研究結(jié)果基本一致， 而滴定法為14.85～18.10 mg/g， 顯著高于本研究結(jié)果。這說明HPLC-ELSD法和滴定法均不能測定甘露醇的實際含量， 可能測定的是所有還原性糖的含量， 故而測定的含量較高， 而HPLC-RID法采用以乙醇為溶劑， 加熱回流提取甘露醇， 預(yù)處理比較簡單， 分離度較高， 故可測定甘露醇的實際含量。本研究顯示， 紫光分光光度法測定的D-甘露醇含量顯著低于高效液相色譜法， 但相關(guān)性較好（r=0.965）。雖然兩種方法均能測定甘露醇的實際含量， 但高效液相色譜法的靈敏度、穩(wěn)定性、準(zhǔn)確度、重復(fù)性均優(yōu)于紫光分光光度法， 但考慮到紫光分光光度法操作比較簡單， 對試劑的要求較低， 不需要特定標(biāo)準(zhǔn)品， 經(jīng)濟(jì)， 快速， 故適用于百令膠囊中甘露醇的定量檢測。

綜上所述， 高效液相色譜法能夠更準(zhǔn)確地測定百令膠囊中D-甘露醇的含量， 且靈敏度、穩(wěn)定性、準(zhǔn)確度、重復(fù)性均較高， 隨著分析技術(shù)的不斷發(fā)展， 高效液相色譜法的成本能夠降低， 逐漸成為測定甘露醇含量的主要方法。但在日常檢測中， 應(yīng)充分了解兩種方法的優(yōu)、缺點， 結(jié)合實際情況選擇使用兩種方法， 保證百令膠囊的臨床效果。

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