黃曉穎，許振平，魏萬千，陳 璇，梁鈺儀，鄧慧華，馬 群，陳美珍

（汕頭大學(xué)理學(xué)院生物學(xué)系，廣東 汕頭 515063）

扁桃斑鳩菊抗氧化活性成分的提取與篩選

黃曉穎，許振平，魏萬千，陳 璇，梁鈺儀，鄧慧華，馬 群，陳美珍

（汕頭大學(xué)理學(xué)院生物學(xué)系，廣東 汕頭 515063）

目的 研究提取扁桃斑鳩菊（Vernonia amygdalina Del）葉中抗氧化活性成分的最佳工藝條件，并篩選活性最強(qiáng)的部位.方法 以DPPH自由基清除能力為響應(yīng)值，利用響應(yīng)面法優(yōu)化提取條件；用不同極性有機(jī)溶劑對(duì)扁桃斑鳩菊乙醇提取物進(jìn)行萃取分離，以DPPH自由基清除能力和還原能力為指標(biāo)，篩選抗氧化活性最強(qiáng)部位.結(jié)果 響應(yīng)面法優(yōu)化的最優(yōu)提取條件為：提取溫度58.5℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)62%和料液比1∶24，在此條件下，獲得的提取物DPPH自由基清除能力最強(qiáng)，理論預(yù)測(cè)值IC50為70.04 μg/mL，實(shí)際值IC50為（69.20±0.61）μg/mL，說明建立的模型可較好地描述該實(shí)驗(yàn)中因素與指標(biāo)的關(guān)系；各萃取部位的抗氧化能力大小依次為：正丁醇部位＞氯仿部位＞石油醚部位＞水相部位，其中正丁醇部位對(duì)DPPH自由基清除能力IC50為18.78 μg/mL，與乙醇提取物比較提高了2.68倍.結(jié)論 扁桃斑鳩菊體積分?jǐn)?shù)為62%乙醇提取物的正丁醇萃取部位具有很強(qiáng)的抗氧化活性，值得進(jìn)一步研究利用.

扁桃斑鳩菊；響應(yīng)面法；抗氧化活性

扁桃斑鳩菊（Vernonia amygdalina Del）俗稱南非葉，原產(chǎn)于熱帶非洲，近年來從新加波、馬來西亞移植到中國.目前，在我國廣東、福建等地已有種植.扁桃斑鳩菊具有抗氧化、抗腫瘤等多種生理活性，其葉既可入藥，也可作為蔬菜食用.民間常用其治療乳腺癌、鼻咽癌、前列腺癌、肺癌、結(jié)腸癌等多種癌癥.在東南亞、臺(tái)灣等地民間使用較多[1].

對(duì)尼日利亞普遍食用的扁桃斑鳩菊的研究發(fā)現(xiàn)，其葉子含有抗壞血酸、木犀草素等多酚類物質(zhì)，鮮葉自由基清除能力為（32.9±0.2）%[2].扁桃斑鳩菊的水提物、醇提物的氯仿、乙酸乙酯、正己烷、正丁醇部位對(duì)腫瘤細(xì)胞生長都有顯著抑制作用[3-6].然而，目前所見扁桃斑鳩菊的研究，其原料多限于國外種植的，而對(duì)引進(jìn)種植于我國的扁桃斑鳩菊活性成分的研究未見報(bào)道.為此，本文開展對(duì)采集于中國廣東省的扁桃斑鳩菊葉子的抗氧化活性物質(zhì)的研究，以期為扁桃斑鳩菊的進(jìn)一步研究提供科學(xué)基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 扁桃斑鳩菊新鮮葉片，采集于中國廣東省汕頭市.

1.1.2 試劑 1，1-二苯基-2-苦肼基（日本分裝進(jìn)口，齊云生物技術(shù)有限公司）；無水乙醇，石油醚（60-90），氯仿，正丁醇，抗壞血酸（VC），F(xiàn)eSO4·7H2O，水楊酸，質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%過氧化氫，十二水磷酸氫二鈉，二水磷酸二氫鈉，鐵氰化鉀，三氯乙酸，氯化鐵等，均為國產(chǎn)AR級(jí).

1.2 儀器與設(shè)備

Universal 320R臺(tái)式冷凍離心機(jī)（德國Hettich公司）；FD-1C-50真空冷凍干燥器（上海比朗儀器有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52AA（上海亞榮生化儀器廠）；高速萬能粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）；2100型UV-2100分光光度計(jì)（龍尼柯（上海）儀器有限公司）；數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-2（國華電器有限公司）；101-1型電熱鼓風(fēng)干燥箱（江蘇省東臺(tái)市電器廠）.

1.3 方法

1.3.1 原料預(yù)處理

扁桃斑鳩菊新鮮葉片洗凈，輕輕甩干水分，放置60℃干燥箱中烘干，粉碎、過40目篩，將粉末置于棕色瓶中保存?zhèn)溆?

1.3.2 抗氧化活性成分的提取

取扁桃斑鳩菊葉干粉，用乙醇溶液恒溫浸提，提取液離心分離，減壓濃縮，冷凍干燥得乙醇提取物.

1.3.3 乙醇提取的單因素實(shí)驗(yàn)

據(jù)報(bào)道扁桃斑鳩菊活性成分主要為甾醇類化合物、皂苷、生物堿、多酚類、單萜、倍半萜類化合物和不飽和脂肪酸[1，7]等.因此，以乙醇為提取溶劑、以提取物對(duì)DPPH自由基半數(shù)清除濃度即DPPH·IC50為考察指標(biāo)，在提取時(shí)間固定為120 min和其他條件不變的情況下進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，分別考察提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比三個(gè)因素對(duì)乙醇提取物抗氧化活性的影響.

實(shí)驗(yàn)方法：精確稱取5 g扁桃斑鳩菊葉粉末，在設(shè)定的條件下進(jìn)行單因素提取實(shí)驗(yàn)，提取物冷凍干燥后用蒸餾水配制成一定的濃度梯度，測(cè)定DPPH自由基清除率.通過SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件處理，得各提取條件下樣品的DPPH·IC50.

1.3.4 響應(yīng)面法優(yōu)化乙醇提取條件

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比三個(gè)變量為Box-Behnken設(shè)計(jì)的自變量，以三次實(shí)驗(yàn)所得的DPPH·IC50平均值作為響應(yīng)值（YDPPH），運(yùn)用Minitab 15統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)分析及建立模型.響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1.

表1 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)因素與水平

1.3.5 乙醇提取物的萃取分離

按1.3.4得到的最優(yōu)提取工藝，提取獲得扁桃斑鳩菊乙醇提取液，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去乙醇得到乙醇浸膏，按乙醇浸膏與萃取劑1∶2體積比依次進(jìn)行石油醚、氯仿、正丁醇分級(jí)萃取分離，得到乙醇提取物各萃取部位，將各萃取部位冷凍干燥48 h得干粉備用.

1.3.6 乙醇提取物活性部位的篩選

分別測(cè)定扁桃斑鳩菊乙醇提取物各萃取部位體外對(duì)DPPH自由基清除能力和對(duì)鐵離子的還原能力作為篩選指標(biāo).

1） DPPH自由基清除能力的測(cè)定

參考Capek.P等人[8]的方法進(jìn)行.分別將樣品溶于水中配制成6個(gè)濃度梯度（20、40、80、160、320、640 μg/mL），在各試管中依次加入樣品溶液2 mL（空白管不加）、DPPH溶液（0.08 mg/mL）2 mL（本底管不加），各管用蒸餾水補(bǔ)足至4 mL，振蕩器混勻，室溫靜置30 min，在517 nm處以蒸餾水調(diào)零測(cè)定吸光度，得清除率.抗壞血酸（VC）作為陽性對(duì)照.計(jì)算公式如下：

式中：A空白為未加入樣品的DPPH溶液的吸光度；A實(shí)驗(yàn)為DPPH溶液加入樣品的吸光度；A本底為未加入DPPH的樣品溶液的吸光度.

2） 還原能力的測(cè)定

參照Oyaizu M[9]的方法進(jìn)行.分別取pH6.6磷酸緩沖液（PBS）和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%鐵氰化鉀溶液各2.5 mL，加入不同濃度的樣品液（0.2、0.4、0.6、0.8、1 mg/mL）1 mL，混勻，50℃水浴加熱20 min，迅速冷卻.加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%三氯乙酸溶液2.5 mL，混勻，4000 r/min離心10 min.取上清液2.5 mL，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%FeCl3和蒸餾水各2.5 mL，混勻，靜置10 min后，以蒸餾水調(diào)零、于700 nm波長處測(cè)定吸光度.抗壞血酸（VC）作為陽性對(duì)照.吸光度的大小即代表體系還原能力的大小[10].

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

考察了提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比（m：v）三個(gè)因素對(duì)乙醇提取物DPPH自由基清除活性的影響，結(jié)果見圖1-3.

圖1 溫度對(duì)提取物 DHHP·IC50的影響

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取物 DHHP·IC50的影響

圖3 料液比對(duì)提取物 DHHP·IC50的影響

從圖中可知，在單因素試驗(yàn)中，當(dāng)提取溫度60℃時(shí)，乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，料液比1∶20，提取物對(duì)DPPH自由基清除活性最強(qiáng)，此時(shí)的DPPH·IC50最低.在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了響應(yīng)面的因素水平進(jìn)一步優(yōu)化提取條件.

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

2.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2.

表2 乙醇提取Box-Behnken實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.2 回歸模型顯著性檢驗(yàn)

運(yùn)用Minitab 15統(tǒng)計(jì)軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，得到二次多元回歸方程為：YDPPH＝71.604-1.161X1-1.391X2-7.267X3+6.162X12+4.526X22+9.621X32+1.315X1X2+6.613X1X3+ 0.461X2X3.

通過回歸方程方差分析結(jié)果考察模型的可靠性，結(jié)果如表3.結(jié)果顯示，回歸方差模型（P＝0.018＜0.05）顯著，失擬項(xiàng)（P＝0.150＞0.05）不顯著，說明模型是有效的.模型的決定系數(shù)R2為0.934 0，說明響應(yīng)值的變化有93.40%來源于所選因素，因此，該回歸模型能很好地?cái)M合所選因素與響應(yīng)值的關(guān)系，可應(yīng)用該模型對(duì)乙醇提取物DPPH自由基清除能力進(jìn)行分析和預(yù)測(cè).

表3 回歸模型方差分析

由表4回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果表明：一次項(xiàng)系數(shù)X3（P＜0.01）極顯著，X1和X2（P＞0.05）不顯著，平方項(xiàng)系數(shù)X12（P＜0.05）顯著，X32（P＜0.01）極顯著，而交叉乘積項(xiàng)系數(shù)除X1*X3外的P值均大于0.05為不顯著，說明提取溫度和料液比存在交互作用.結(jié)合表3得出，回歸模型線性顯著（P＜0.05），平方（P＜0.01）極顯著，交互作用不顯著（P＞0.05）.因此，所選因素與響應(yīng)值之間并非是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，對(duì)乙醇提取物DPPH自由基清除能力的影響大小依次為料液比（X3）＞乙醇體積分?jǐn)?shù)（X2）＞提取溫度（X1）.

表4 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)

2.2.3 響應(yīng)曲面分析

通過回歸模型方程繪出3D響應(yīng)曲面圖及2D等高線圖（見圖4），以此確定各個(gè)因素的最佳水平范圍.

圖4 各因素交互作用對(duì)提取物DPPH自由基清除能力IC50值的影響

由圖4A可知，在提取溫度55～65℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)55%～70%的條件下，對(duì)提取物的DPPH自由基清除能力有較強(qiáng)的影響；如圖4 C所示，乙醇體積分?jǐn)?shù)在50%～70%、料液比在1∶15～1∶30的條件下，對(duì)提取物的DPPH自由基清除能力有較強(qiáng)的影響；從圖4 B可以看出，其等高線為橢圓形，故提取溫度和料液比這兩因素之間交互作用顯著.

通過Minitab 15軟件分析，得出扁桃斑鳩菊葉乙醇提取抗氧化成分最佳提取工藝條件是：提取溫度58.48℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)61.52%和料液比1∶24.34.在此條件下，得到的提取物具有最強(qiáng)的DPPH自由基清除能力，其DPPH·IC50理論值可達(dá)70.04 μg/mL.考慮實(shí)際的可操作性，將優(yōu)化的提取條件修正為：提取溫度58.5℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)62%和料液比1∶24，在此條件下進(jìn)行重復(fù)三次的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，所得DPPH·IC50實(shí)際值為（69.20±0.61）μg/mL，與理論值相比，相對(duì)誤差為1.20%，說明回歸模型方程具有可行性，優(yōu)選的工藝能有效地提取扁桃斑鳩菊葉的抗氧化活性成分.

2.2.4 乙醇提取物各部位抗氧化活性

1） 對(duì)DPPH自由基清除能力

分別測(cè)定了乙醇提取液不同濃度石油醚部位、氯仿部位、正丁醇部位、水相部位對(duì)DPPH自由基清除能力，結(jié)果見圖5.以SPSS 19.0軟件Probit回歸分析，置信區(qū)間為95%，獲得在一定的濃度梯度下各部位的DPPH·IC50（見表5）.

圖5 乙醇提取物各萃取部位對(duì)DPPH自由基清除能力

表5 各萃取部位的DPPH·IC50

由圖5可見，在一定作用濃度范圍內(nèi)，各部位對(duì)DPPH自由基都具有較強(qiáng)清除活性，且存在濃度梯度效應(yīng).結(jié)合表5，可知各活性部位對(duì)DPPH自由基清除能力大小依次為正丁醇部位＞氯仿部位＞石油醚部位＞水相部位，其中正丁醇部位活性最強(qiáng)，其DPPH·IC50為18.778 μg/mL，清除能力接近陽性藥物抗壞血酸. 2） 還原能力的測(cè)定結(jié)果

分別測(cè)定了石油醚部位、氯仿部位、正丁醇部位、水相部位和抗壞血酸的還原能力，結(jié)果如圖6和圖7.

圖6 乙醇提取物各活性部位的還原能力

圖7 抗壞血酸的還原能力

由圖6可知，各活性部位的還原能力均隨著其濃度的增加而增強(qiáng)，其還原能力的大小依次為正丁醇部位＞氯仿部位＞石油醚部位＞水相部位，與1）中的清除DPPH自由基的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似，說明提取物的抗氧化與還原能力呈正相關(guān).當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL時(shí)，正丁醇部位的還原能力達(dá)0.483±0.021，是其他活性部位的3倍以上，但與圖7陽性藥物比較，仍弱于抗壞血酸.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，正丁醇部位是扁桃斑鳩菊葉乙醇提取物的最強(qiáng)抗氧化活性部位.

3 討論

1） 通過響應(yīng)面法優(yōu)化扁桃斑鳩菊抗氧化活性物質(zhì)的提取工藝條件為：提取溫度58.5℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)62%和料液比1∶24.在此條件下，提取120 min，得到的乙醇提取物DPPH·IC50為（69.20±0.61）μg/mL，與模型預(yù)測(cè)值70.04 μg/mL誤差較小，認(rèn)為建立的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ途哂袑?shí)際應(yīng)用價(jià)值.

2） 檢測(cè)了乙醇提取物各有機(jī)相提取部位對(duì)DPPH自由基清除能力和對(duì)鐵離子的還原能力，得出各部位的抗氧化能力大小依次為：正丁醇部位＞氯仿部位＞石油醚部位＞水相部位.正丁醇部位顯示出最強(qiáng)抗氧化活性.Erasto P.等利用DPPH法等篩選扁桃斑鳩菊葉的丙酮、甲醇和水提取物的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)甲醇提取物表現(xiàn)出較強(qiáng)的DPPH自由基清除活性，其清除能力為75%～99.3%，強(qiáng)過丁基羥基甲苯，與兒茶酚類物質(zhì)相當(dāng)，而水提取物的活性最低[11]，這與本研究水提取物的抗氧化活性最低的結(jié)果相似.

3） 據(jù)文獻(xiàn)[2]扁桃斑鳩菊正丁醇部位主要含有倍半萜類、多糖類和黃酮類等，它們具有體外抗氧化和抗腫瘤活性.江燕從扁桃斑鳩菊葉醇提正丁醇部位分離鑒定出三個(gè)化合物，分別是丁二酸、Vemodalinol和木犀草苷[12].Erasto P等指出了扁桃斑鳩菊的抗氧化活性成分中Vemolide對(duì)DPPH自由基的還原能力比Vemodalol的強(qiáng)[13].然而，上述報(bào)道所用扁桃斑鳩菊原料均采集于尼日利亞或南非等國，而移植于我國南方的扁桃斑鳩菊其葉的化學(xué)組成是否發(fā)生變化？其抗氧化成分的種類與含量等尚待今后進(jìn)一步分離鑒定等研究加以闡明.

[1]楊早.南非葉化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，29（4）：397-400.

[2]OBOH G.Effect of blanching on the antioxidant properties of some tropical green leafy vegetables[J]. LWT-Food Science and Technology，2005，38（5）：513-517.

[3]IZEVBIGIE E B，BRYANT J L，WALKER A.A novel natural inhibitor of extracellular signal-regulated kinases and human breast cancer cell growth[J].Experimental Biology and Medicine，2004，229（2）：163-169.

[4]OPATA M M，IZEVBIGIE E B.Aqueous Vernonia amygdalina extracts alter MCF-7 cell membrane permeabilityand efflux[J].International Journal of Environmental Research and Public Health，2006，3（2）：174-179.

[5]QYUQIDA，LUOX，LEEKS，et al.Activity makers of the antibreast carcinoma cell growth of Vernonia amygdalinaextracts[J].Exp Biol Med（Maywood），2009，234（4）：410-417.

[6]IZEVBIGIE E B.Discovery of water-soluble anticancer agents（edotides）from a vegetable found in Benin City，Nigeria[J].Experimental Biology and Medicine，2003，228（3）：293-298.

[7]江燕，林翠梧，柴樺，等.扁桃斑鳩菊揮發(fā)性化學(xué)成分的頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法分析[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2010，21（11）：2884-2886.

[8]CAPEK P，MACHOVá E，TURJAN J.Scavenging and antioxidant activities of immunomodulating polysaccharidesisolated from Salvia officinalis L[J].International Journal of Biological Macromolecules，2009，44（1）：75-80.

[9]OYAIZU M.Antioxidative activities of browning products of glucosamine fractionated by organic solvent and thin-layer chromatography[J].Journal of the Japanese Society for Food Science and Technology（Japan），1988，35（11）：771-775.

[10]蔡凌云，周江菊，樂利，等.空心蓮子草多糖的體外抗氧化活性[J].食品科學(xué)，2011，32（17）：186-189.

[11]ERASTO P，GRIERSON D S，AFOLAYAN A J．Evaluation of antioxidant activity and the fatty acid profile of the leaves of Vernonia amygdalina growing in South Africa[J].Food Chemistry，2007，104：636-642.

[12]江燕.抗癌植物扁桃斑鳩菊化學(xué)成分的研究[D].南寧：廣西大學(xué)，2010：37-58.

[13]ERASTO P，GRIERSON D S，AFOLAYAN A J．Antioxidant constituents in Vernonia amygdalina leaves[J].Pharmaceutical Biology，2007，45（3）：195-199.

Study on Extracting and Screening Antioxidant Active Properties of Vernonia amygdalina Del

HUANGXiaoying,XUZhenping,CHENXuan,WEI Wanqian,DENG Huihua, LIANGYuyi,MAQun,ZHANG Yueling,CHENMeizhen*
（Department of Biology,College of Science,Shantou University,Shantou515063,Guangdong,China）

Objective:The optimum extraction process of antioxidant active properties ofVernonia amygdalinawasdetermined and the strongest antioxidant properties were screened as well.MethodsThe extract conditions were optimized bythe Response Surface Methodology,response value on DPPH radical scavenging ability.Different polar organic solvents were used to separate theVernonia amygdalinaethanol extract.Based on DPPH radical scavengingabilityand reducingpower,screening the strongest antioxidant properties.Results:At last the optimum conditions of extraction were determined as follows:extraction temperature 58.5℃,ethanol concentration 62%and solid-liquid ratio 1:24.Under the optimal extraction condition,the predictive maximum value of ethanol extract’s DPPH radical scavenging capacity was IC50＝70.04 μg/mL and the actual value was IC50＝（69.20± 0.61）μg/mL,indicating the model could well describe the relationship between the factors and indexes in the experiment.The antioxidant activities of different extracts were determined as follows: butanol fraction＞chloroform fraction＞petroleum ether fraction＞aqueous fraction.Butanol fraction has the strongest antioxidant activities（DPPH radical scavenging capacity,IC50＝18.778 μg/mL）, which has improved 2.68 times by comparing with the previous ethanol extract.Conclusion:The results showedthat the butanol fraction ofVernonia amygdalinafromthe 62%ethanol extraction had strongantioxidant activities,and deserves further study.

Vernonia amygdalina;response surface methodology;antioxidant activity

1001-4217（2017）04-0017-09

R284.2

A

2016-02-04

陳美珍（1956—），女，教授，研究方向?yàn)樘烊换钚晕镔|(zhì)研究與開發(fā).E-mail：chenmz@stu.edu.cn

2015年廣東省大學(xué)生科技創(chuàng)新培育專項(xiàng)資金重點(diǎn)項(xiàng)目