羅成江，包愛情，陸春波，陳曉林，王 彬，林仙軍

(浙江省獸藥飼料監(jiān)察所，杭州 311101)

氟苯尼考注射液中非法添加二氧丙嗪的檢測方法研究

羅成江，包愛情，陸春波，陳曉林，王 彬，林仙軍

(浙江省獸藥飼料監(jiān)察所，杭州 311101)

建立氟苯尼考注射液中非法添加二氧丙嗪的檢測方法。對1批氟苯尼考注射液照《中國獸藥典》2010版HPLC法進行含量測定時，發(fā)現(xiàn)未知物質峰。采用超高效液相色譜-四級桿-飛行時間質譜(UHPLC-Q/TOF MS)對該批檢品進行篩查，發(fā)現(xiàn)該添加物疑似二氧丙嗪，并采用高效液相色譜-二極管陣列檢測法(HPLC-DAD)對二氧丙嗪進行定性和定量檢測。結果顯示，高效液相色譜法二氧丙嗪在1～100 μg/mL濃度范圍內的線性良好(r=1.0000)，平均回收率為99.5%，RSD為0.3%。本方法專屬性強，靈敏度高，重現(xiàn)性好，適用于氟苯尼考注射液中非法添加二氧丙嗪的檢測。

超高效液相色譜-四級桿-飛行時間質譜；高效液相色譜法；氟苯尼考注射液；二氧丙嗪

氟苯尼考收載于《中華人民共和國獸藥典》2010年版一部，是動物專用的氯霉素類新型廣譜抗生素，主要用于敏感細菌所致的豬、雞及魚的細菌性疾病，尤其對呼吸系統(tǒng)感染和腸道感染療效顯著。該藥以甲砜基取代氯霉素分子結構中的硝基，消除了不可逆性致再生障礙性貧血的毒副作用；以氟基取代甲砜霉素分子結構中α-甲基位上的羥基，不僅抗菌活性增強，而且對大部分耐氯霉素和甲砜霉素的菌株仍有活性[1-3]。二氧丙嗪為抗組胺藥，是異丙嗪的衍生物，又名雙氧丙嗪、雙氧異丙嗪、克咳敏，屬人用藥品，具有鎮(zhèn)咳、平喘、祛痰、抗炎和局部麻醉作用。臨床用于鎮(zhèn)咳、祛痰，用于急慢性氣管炎和各種疾病引起的咳嗽。二氧丙嗪治療量與中毒量接近，不得超過極量，高空作業(yè)及駕駛車輛、操縱機器者禁用；癲癇、肝功能不全者應慎用[4-5]。

目前，為了有力打擊非法添加藥物的情況，我國農(nóng)業(yè)部發(fā)布了第2448號等公告[6]，制訂了氟苯尼考制劑中非法添加磺胺類、氟喹諾酮類等化學藥物檢查方法。但由于二氧丙嗪屬人用藥品，已發(fā)布的農(nóng)業(yè)部公告中尚不涉及二氧丙嗪的檢查，因此在參考了相關文獻[7]的基礎上，本文對氟苯尼考注射液中非法添加二氧丙嗪的檢查方法進行了研究。

1 材 料

1.2 藥品與試劑

1.2.1 對照品 鹽酸二氧丙嗪對照品來自中國食品藥品檢定研究院，含量99.9%，批號100299-201202。

1.2.2 試劑 乙酸銨，分析純，西隴化工股份有限公司；冰醋酸，分析純，上海凌峰化學試劑有限公司；三乙胺，分析純，江蘇強盛功能化學股份有限公司；乙腈，色譜純，Merck KGaA公司；甲醇，色譜純，Merck KGaA 公司；水，超純水。

1.2.3 供試品

1.2.3.1 陰性氟苯尼考注射液 氟苯尼考注射液，批號79SF-2，生產(chǎn)企業(yè)為西班牙海博萊生物大藥廠。

1.2.3.2 陽性氟苯尼考注射液 氟苯尼考注射液，批號20160615，生產(chǎn)企業(yè)為四川省某公司。

1.2.3.3 陽性添加氟苯尼考注射液 在陰性氟苯尼考注射液中添加鹽酸二氧丙嗪對照品，混勻，根據(jù)二氧丙嗪藥物添加達到一定藥效和市場臨床使用劑量，共添加3個濃度，分別為1mL∶1mg、1 mL∶2mg和1mL∶5mg。

對于寡這個詞，我們嶺北周村的人是有一番見解的。用在特定的女人身上，那是真正的寡，守寡的寡。但用在寡這個寡那個的時候，就代表坑蒙拐騙了。所以，我們嶺北周村人管坑蒙拐騙的人也叫寡子。周老相公講的就是寡子，現(xiàn)在這個寡子是女的，她叫常愛蘭。

2 方法與結果

2.1 UHPLC-Q/TOF MS法

2.1.1 供試品溶液的制備 精密量取1 mL氟苯尼考注射液，置100 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.1.2 液相及質譜條件 采用十八烷基鍵合硅膠色譜柱(Waters Atlantis, 150 mm×3.0 mm, 3 μm)，流動相A為5 mmol/L乙酸銨的0.1%甲酸水溶液，流動相B為5 mmol/L乙酸銨的0.1%甲酸甲醇溶液，梯度洗脫程序：0～1 min，5% B；1～4 min，5% B～60% B；4～14 min，60% B～100% B；14～18 min，100% B，后運行3 min，5% B；流速0.5 mL/min；柱溫25 ℃；進樣量2 μL。質譜采用Dual AJS ESI源，掃描方式為正離子全掃描(ESI+)，毛細管電壓4.0 KV，干燥氣流速為15 L/min，溫度為350 ℃；鞘氣流速為12 L/min，溫度為350 ℃；碰撞電壓(Fragmentor)為350 V。一級質譜數(shù)據(jù)采集為單級質譜全掃描模式，掃描范圍：m/z100～1000 Da；采集速率為1.5 spectra/s。采集數(shù)據(jù)時連續(xù)導入?yún)⒈热芤?，對儀器質量軸進行實時校正，參比離子為m/z121.0509和m/z922.0098。

2.1.3 篩查結果 使用UHPLC-Q/TOF MS對1.2.3.2項下供試品進行一級質譜數(shù)據(jù)采集，總離子流圖(TIC)如圖1所示，TIC圖中在5.901 min有明顯的峰，對該峰進行質譜提取，得到m/z317.1312處響應明顯大于其他離子的離子(圖2)。在已經(jīng)建立的一級數(shù)據(jù)庫中進行匹配，發(fā)現(xiàn)二氧丙嗪的[M+H]+與m/z317.1312匹配且保留時間一致，匹配分數(shù)為92.25，懷疑該未知物為二氧丙嗪。

圖1 總離子流圖Fig 1 The chart of total lon chromatograms

圖2 質譜提取圖Fig 2 The chart of mass spectrometry extraction

2.2 液相色譜法

2.2.1 溶液的制備

2.2.1.1 對照品溶液的制備 取鹽酸二氧丙嗪對照品約200 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻制成20 mg/mL的對照品儲備液。精密量取上述對照品儲備液適量，加甲醇定量稀釋成20 μg/mL的二氧丙嗪對照品溶液，即得。

2.2.1.2 供試品溶液的制備 精密量取1 mL氟苯尼考注射液，置100 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.2.2 高效液相色譜條件 色譜柱為Agilent XDB-C18 (4.6 mm×250 mm，5.0 μm)；以醋酸鹽緩沖液(取0.05 mol/L的醋酸銨溶液1000 mL，加三乙胺1 mL，用冰醋酸調節(jié)pH值至6.5 )-乙睛(70∶30)；采用二極管陣列檢測器，采集波長范圍為200～400 nm，分辨率為1.2 nm，柱溫30 ℃，流速1 mL/min，進樣量10 μL；記錄光譜圖和226 nm波長處的色譜圖。色譜圖見圖3，光譜圖見圖4。

2.3 峰純度及光譜匹配檢查 對供試品溶液及對照品溶液色譜圖中二氧丙嗪色譜峰進行峰純度檢查，結果見圖5。結果表明，供試品溶液及對照品溶液色譜圖中二氧丙嗪峰的純度因子均大于閾值，均為單一物質峰。對供試品溶液及對照品溶液色譜圖中二氧丙嗪色譜峰光譜圖進行匹配，匹配因子為999.771，可認為是同一物質。

圖3 二氧丙嗪對照品(A)、陰性樣品(B)、陽性添加(C)、空白溶劑(D)色譜圖Fig 3 The chromatogram of (A)dioxopromethazine reference substance;

圖4 對照品(A)和陽性添加供試品(B)紫外吸收光譜圖Fig 4 Ultra-violet absorption spectra of (A) reference substance and (B) the spiked sample

A 供試品溶液峰純度檢查：純度因子999.048，閾值999.002; B 對照品溶液峰純度檢查：純度因子999.737，閾值999.201A: The peak purity test of sample; The purity factor is 999.048, the threshold value is 999.002.B: The peak purity test of the reference substance; The purity factor is 999.737, the threshold value is 999.201.圖5 峰純度檢查圖Fig 5 The chart of peak purity test

2.4 線性關系考察 分別精密量取2.2.1.1項下的鹽酸二氧丙嗪對照品儲備液，用甲醇稀釋成1、2、4、10、20、100 μg/mL的系列混合對照品溶液，從低濃度到高濃度依次進樣，按上述色譜條件分析，以峰面積為縱坐標、標準溶液濃度為橫坐標，進行線性回歸分析，回歸方程為Y=48.85X-4.541(r=1.0000)，結果表明二氧丙嗪進樣濃度在1～100 μg/mL范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

2.5 添加回收試驗 按1.2.3.3項下方法制備陽性添加樣品，每個添加含量做5份平行樣，按2.1.1.2項下方法制備供試品溶液。按照外標法定量，回收率結果見表1。從回收率結果可以看出本實驗平均回收率為99.5%，RSD為0.3%。

表1 二氧丙嗪回收率結果(n=5)Tab 1 The result of the recovery rate of dioxopromethazine

2.6 檢測限 按上述色譜條件，將對照品溶液逐步稀釋，同時記錄色譜圖及光譜圖(圖6)，以光譜圖失真的最大濃度為檢出限，該色譜條件下二氧丙嗪在氟苯尼考注射液樣品中的檢出限為0.2 mg/mL。

圖6 二氧丙嗪檢出限(濃度2 μg/mL)色譜圖(A)和光譜圖(B)Fig 6 (A)The chromatogram and (B)spectrogram of detection limit of dioxopromethazine (The concentration was 2 μg/mL)

2.7 耐用性 從柱溫、流動相pH值、色譜柱三個方面考察方法的耐用性。分別改變柱溫為25 ℃、30 ℃、35 ℃，流動相的pH值6.3、6.5、6.7，色譜峰出峰順序無變化，保留時間稍有變化；使用不同品牌、不同型號的色譜柱，如Agilent XDB-C18 (4.6 mm×250 mm, 5 μm)；Agilent Plus C18 (4.6 mm×250 mm, 5μm)；Waters Symmetry C18 (4.6 mm×250 mm, 5 μm)等，結果表明，氟苯尼考與二氧丙嗪能很好地分離且保留時間合理。本方法的耐用性較好。

2.8 穩(wěn)定性試驗 供試品溶液分別于配制0、1、2、4、8、12、24 h后，進樣10 μL測定，RSD為1.0%。結果表明溶液自制備后24 h內基本穩(wěn)定。

2.9 樣品測定 取氟苯尼考注射液(批號為20160615)1.0 mL，置100 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。分別精密量取供試品溶液和二氧丙嗪對照品溶液(20 μg/mL)10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖和光譜圖，平行測定3次，計算平均含量。結果表明供試品溶液二氧丙嗪色譜峰與二氧丙嗪對照品溶液色譜峰保留時間一致，光譜相似；此批氟苯尼考注射液二氧丙嗪平均含量為0.96 mg/mL，RSD為0.2%。

3 討論與小結

3.1 未知物的發(fā)現(xiàn)和分析 本文從發(fā)現(xiàn)該批樣品的非法添加物到建立UHPLC-Q/TOF MS篩查確證和HPLC-DAD雙重確證及含量測定，最后總結出一種較好的模式化篩查流程，為未來獸藥處方外非法添加提供了一定的思路，對打擊獸藥處方外添加有較好的實際應用價值。隨著農(nóng)業(yè)部對獸藥非法添加的檢查力度加大，獸藥的非法添加也越來越隱蔽，二氧丙嗪為人用藥物，此次二氧丙嗪的檢出，是否意味獸藥的非法添加不僅僅局限于獸用藥，希望由此引起有關部門的重視。

3.2 色譜條件、提取溶劑和提取波長的選擇 本試驗的色譜條件參考二氧丙嗪含量檢測的相關文獻，二氧丙嗪在226nm有最大吸收，故選擇檢測波長為226nm。對二氧丙嗪在甲醇中的溶解性進行考察，發(fā)現(xiàn)在本方法濃度范圍內，二氧丙嗪在甲醇中的溶解性良好?？紤]到在非法添加高通量篩查中以甲醇作為溶劑具有普適性，選取甲醇作為提取溶劑。

3.3 檢測限與定量限的確立 本方法采用二極管陣列檢測器進行定性定量測定，由于需要對被測試藥物優(yōu)先進行定性判斷，故本研究檢出限以光譜圖失真為依據(jù)，與傳統(tǒng)含量測定以信噪比 1∶3作為檢出限有所不同，在光譜圖失真時信噪比仍大于1∶10，故未對定量限再作規(guī)定。

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Ministry of Agriculture of the People 's Republic of China .Bulletin No. 2448.

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(編輯：陳希)

DeterminationofDioxopromethazineIllegallyAdulteredintoFlorfenicolInjection

To establish a method for determination of dioxopromethazine illegally added in florfenicol injection. In the course of content determination of 1 batch florfenicol injection with the method of HPLC according to the Chinese Veterinary Pharmacopoeia 2010, a suspicious compound peak was found. The suspicious compound was found by quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry (UHPLC-Q/TOF MS)，then confirmation and content determination were completed by high performance liquid chromatography-diode array detector (HPLC-DAD) . The suspicious compound in this sample was identified as dioxopromethethazine. The results showed that there was a good linear correlation between the peak areas and the concentrations of dioxopromethazine at the range of 1～100 μg/mL(r=1.0000). The average recovery was 99.5% withRSDof 0.3% by HPLC. The method is convenient, reliable and accurate. It was suitable for detection of dioxopromethazine illegally adulterated in florfenicol injection.

UHPLC-Q/TOF MS；HPLC； florfenicol injection；dioxopromethazine

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.11.07

2017-02-03

A

1002-1280 (2017) 11-0044-07

S859.79

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201203023-4)；浙江省“三農(nóng)六方”科技協(xié)作專項(中獸藥注射劑中非法添加物控制技術研究與風險監(jiān)測)

羅成江，獸醫(yī)師，從事獸藥、畜產(chǎn)品安全檢測技術研究。 E-mail: luocj2001@163.com

LUO Cheng-jiang, BAO Ai-qing, LU Chun-bo, CHEN Xiao-lin,WANG Bin, LIN Xian-jun

(ZhejiangProvincialSupervisoryInstituteofVeterinaryDrugandFeedstuff，Hangzhou311101,China)