黃小潔，楊承槐，劉 丹，侯力丹，李慧姣，李俊平，陳曉春

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081)

運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)感染雞種蛋中的REV

黃小潔，楊承槐，劉 丹，侯力丹，李慧姣，李俊平*，陳曉春*

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081)

為研究通過種蛋檢測(cè)的方法監(jiān)測(cè)SPF雞群REV感染情況，運(yùn)用已建立的熒光定量PCR方法檢測(cè)攻毒母雞種蛋中REV，并與血清REV水平進(jìn)行比較。人工感染12月齡母雞，從種蛋中提取蛋清，接種正常雞胚成纖維細(xì)胞后傳代一次，之后石蠟密封孵化至9日齡制成雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)，運(yùn)用熒光定量PCR方法檢測(cè)蛋清，并和血清的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果顯示：83份蛋清，3份陽(yáng)性樣品分別收集自攻毒后的第8、11、14天；46份CEF，2份陽(yáng)性樣品分別收集自攻毒后的第11天和第14天，陽(yáng)性的蛋清和CEF呈對(duì)應(yīng)關(guān)系，說明兩種方法的檢測(cè)結(jié)果一致。攻毒后的6～15 d是病毒血癥持續(xù)期，陽(yáng)性雞蛋均采集自這段時(shí)間，表明通過種蛋REV檢測(cè)能反映SPF雞的急性感染狀態(tài)。本研究為通過種蛋抗原檢測(cè)從而監(jiān)測(cè)SPF雞REV感染奠定基礎(chǔ)。

網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒；熒光定量PCR；血清；蛋清；雞胚成纖維細(xì)胞

禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥(Reticuloendotheliosis，RE)是指由反轉(zhuǎn)錄病毒科網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒(Reticuloendotheliosis virus，REV)引起的禽類以急性網(wǎng)狀細(xì)胞腫瘤、生長(zhǎng)抑制綜合癥、淋巴組織和其他組織的慢性腫瘤形成為特征的一群病理綜合癥。REV與禽白血病病毒(Avian leukemia virus, ALV)、馬立克氏病病毒(Marek's disease virus, MDV)并稱為雞群的三大腫瘤性病毒，嚴(yán)重危害我國(guó)的家禽養(yǎng)殖業(yè)。

REV屬正反轉(zhuǎn)錄病毒科，γ反轉(zhuǎn)錄病毒屬，為單股、正鏈、線性RNA。REVS基因組RNA是由兩個(gè)30～40s的RNA亞單位的60～70復(fù)合體組成[1]，分離株存在3個(gè)明顯的亞型，網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病病毒T株(SNV)鴨傳染性貧血病毒(DIAV)、雞合胞體病毒(CSV)[2]，不同毒株具有相同的抗原性。REV的傳統(tǒng)檢測(cè)方法包括免疫熒光、病毒分離培養(yǎng)、血清學(xué)等方法。然而，這些方法在敏感性、特異性、時(shí)效性等方面存在各自的不足。國(guó)標(biāo)中，檢測(cè)SPF雞REV感染的方法主要是采用血清學(xué)的方法，然而血清的采集不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力，疫苗企業(yè)要獲得可靠的血清作為檢測(cè)樣品也很困難。因此，亟待建立一種更為快速、方便、可靠的檢測(cè)方法來準(zhǔn)確診斷SPF雞的REV感染情況。

近年來，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Fluo rescent quantitative PCR)技術(shù)以其快速、靈敏、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)在基因表達(dá)水平的分析、病原體的定性和定量檢測(cè)等方面得到廣泛應(yīng)用[3-5]。本研究運(yùn)用已建立的REV實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法[2]，對(duì)人工感染REV母雞的血清及種蛋進(jìn)行檢測(cè)，探討種蛋檢測(cè)方法的可行性，為通過種蛋抗原檢測(cè)從而監(jiān)測(cè)SPF雞REV感染奠定基礎(chǔ)。

1 材 料

1.1 病毒 REV MD-2株，病毒含量為104.34TCID50，由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所分離保存。

1.2 SPF種雞和種蛋 5只12月齡的成年SPF母雞，2只SPF公雞購(gòu)自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；100枚SPF種蛋，購(gòu)自5家SPF雞胚生產(chǎn)企業(yè)；30枚普通雞蛋購(gòu)自北京某雞場(chǎng)。

1.3 主要試劑 OMEGA總RNA提取試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司；SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒、PrimeScript TMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒購(gòu)自大連寶生物(Takara)工程有限公司；蛋白酶K溶液購(gòu)自天根生化科技有限公司；無水乙醇、苯酚、氯仿、異戊醇購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)。

2 方 法

2.1 樣品采集

2.1.1 動(dòng)物試驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)組：4只母雞和1只公雞放于一個(gè)隔離器內(nèi)飼養(yǎng)，每只母雞肌肉注射105TCID50的REV MD-2株強(qiáng)毒，分別標(biāo)記為1-4號(hào)雞；對(duì)照組：1只公雞和1只母雞放于另一隔離器，注射與實(shí)驗(yàn)組相同劑量的生理鹽水，標(biāo)記為5號(hào)雞。兩組雞同飼養(yǎng)兩個(gè)月，每天收集種蛋，三天采一次全血分離血清，做好標(biāo)記，保存于-20 ℃冰箱。

2.1.2 制作雞胚成纖維細(xì)胞(CEF) 按照《中國(guó)獸藥典》(二O一O版三部)[6]方法制作。

2.2 樣品采集及處理

2.2.1 感染種蛋蛋清的提取及CEF的制作 用1 mL注射器吸取0.5 mL蛋清，隨后立即用石蠟密封，將種蛋放入孵化箱孵化；受精蛋孵化至9日齡按1.2.2的方法制成雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)；蛋清樣品用PBS進(jìn)行10倍稀釋，取1 mL接種CEF，放于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 h，棄去蛋清，用PBS洗滌2～3次，補(bǔ)充細(xì)胞維持液，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d后傳代一次冷藏備用。

2.2.2 血清中病毒DNA提取 按OMEGA總RNA提取試劑盒說明從血清中提取病毒RNA；按照PrimeScript TMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒說明將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，保存于-80 ℃冰箱。

2.2.3 蛋清細(xì)胞培養(yǎng)物、CEF細(xì)胞DNA提取 取437.5 μL病毒液于1.5 mL Eppdendorf管中，分別加入12.5 μL proteinase K(20 mg/mL)， 50 μL 10% SDS充分混勻后56 ℃水浴60 min；加入500 μL酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)，上下顛倒混勻，室溫靜置5 min，4 ℃，12000 r/min離心15 min，取上層水相；加入900 mL冰冷的無水乙醇和45 mL 3 mol/L NaAC(pH5.2)，-20 ℃沉淀過夜；加入450 μL氯仿-異戊醇(24∶1)，上下顛倒混勻，室溫放置5 min，4 ℃，12000 r/min離心10 min，取上層水相；4 ℃，12000 r/min離心20 min沉淀核酸；棄上清，加入450 μL 70%乙醇，混勻后4 ℃，12000 r/min離心20 min，棄上清；將Eppdendorf管倒扣于吸水紙上，室溫下使乙醇自然揮發(fā)；加入30 μL的雙蒸水溶解核酸，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 樣品DNA(cDNA)的熒光定量PCR檢測(cè) 按照已建立的熒光定量PCR方法[1]，對(duì)提取的樣品DNA(cDNA)樣品進(jìn)行熒光定量檢測(cè)，25 μL反應(yīng)體系為：SYBR Premix Ex TaqTM 12.5 μL；PCR Forward Primer(10 μmol/L) 0.5 μL；PCR Reverse Primer(10 μmol/L) 0.5 μL；DNA Template 2 μL；ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s；55 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。

2.4 數(shù)據(jù)分析 每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次，每次取樣品DNA(cDNA)模板2 μL，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出病毒基因組拷貝數(shù)平均對(duì)數(shù)值(log10 copies/μL)，再換算成1 μL樣品中所含的DNA(cDNA)拷貝數(shù)平均對(duì)數(shù)值(log10 copies/μL)，3次測(cè)定結(jié)果的平均值為最終測(cè)定結(jié)果。以Ct值小于35作為陽(yáng)性樣品判定標(biāo)準(zhǔn)。

2.5 臨床樣品檢測(cè) 對(duì)100枚SPF種蛋和50枚普通雞蛋進(jìn)行REV檢測(cè)。

3 結(jié) 果

3.1 REV在母雞血清中的動(dòng)態(tài)分布 采集母雞全血分離血清，攻毒后的3 d、6 d、9 d、12 d、15 d從 4只攻毒母雞血清中均檢測(cè)到病毒cDNA，將4只母雞的檢測(cè)結(jié)果取平均值，3 d時(shí)平均拷貝數(shù)約為102拷貝，6 d時(shí)約為104拷貝，9 d拷貝數(shù)達(dá)到峰值為105拷貝，12 d時(shí)降至104拷貝，15 d為102拷貝。 18 d以后檢測(cè)不到病毒(圖1)。對(duì)照母雞在各個(gè)階段血清中REV的檢測(cè)結(jié)果均為陰性。

圖1 REV在感染雞體內(nèi)的增殖規(guī)律Fig 1 The proliferation of REV in infected chickens

3.2 蛋清細(xì)胞培養(yǎng)物、CEF檢測(cè)結(jié)果 兩個(gè)月時(shí)間共收集感染種蛋樣品83份，提取蛋清83份，接種CEF并傳代一次，有3份檢測(cè)結(jié)果為REV陽(yáng)性，分別為感染后的第8、11、14天收集(表1)。83份雞蛋樣品中，有46份受精，孵化制成CEF樣品46份，有2個(gè)樣品檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，分別為感染后第11天和第14天收集。同一份種蛋的陽(yáng)性CEF和陽(yáng)性蛋清一一對(duì)應(yīng)，均在感染后的11和14天收集。對(duì)照組的蛋清、CEF均為陰性。

表1 蛋清細(xì)胞培養(yǎng)物、CEF檢測(cè)結(jié)果Tab 1 The detection result of the eggWhite cell culture and the CEF

3.3 臨床樣品檢測(cè)結(jié)果 100枚SPF種蛋的蛋清細(xì)胞培養(yǎng)物100份，制成CEF細(xì)胞82份，經(jīng)熒光定量PCR檢測(cè)均為REV陰性；30枚普通雞蛋的蛋清培養(yǎng)物有30份，均為非受精蛋，蛋清的細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)檢測(cè)有11份為REV陽(yáng)性(圖2)，陽(yáng)性率為36.7%。

1-11 陽(yáng)性雞蛋；12-30 陰性雞蛋1-11 positive eggs；12-30 negative eggs圖2 普通雞蛋蛋清細(xì)胞培養(yǎng)物熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果Fig 2 Detection result of fluorescent quantitative PCR for egg white cell culture

4 討 論

本實(shí)驗(yàn)人工感染12月齡SPF母雞，攻毒后第3天即可從血清中檢測(cè)出病毒，這個(gè)結(jié)果比起雛雞感染后出現(xiàn)病毒血癥[7-8]的時(shí)間要早約10 d，這可能與接種的病毒毒株、接種方式不同，以及雞的日齡大免疫機(jī)能完善等因素有關(guān)。第9天血清REV達(dá)到峰值，之后緩慢下降，第18天左右病毒血癥消失，攻毒后3～18 d是病毒血癥的持續(xù)時(shí)間。在蛋清的細(xì)胞培養(yǎng)物和CEF細(xì)胞中，檢測(cè)出了REV，陽(yáng)性雞蛋的蛋清和CEF呈一一對(duì)應(yīng)關(guān)系，說明這兩種方法的檢測(cè)結(jié)果一致，運(yùn)用這兩種方法檢測(cè)種蛋均可行。并且檢測(cè)出的陽(yáng)性樣品的采集時(shí)間同血清病毒血癥持續(xù)的時(shí)間相一致，表明了耐受性感染的母雞確實(shí)能把病毒垂直傳播給后代。但是雞蛋中REV檢出率比較低，可能是垂直傳播的幾率低導(dǎo)致[9-11]，也可能是病毒從母雞傳播到雞蛋后，病毒含量非常低，方法的敏感性不夠而導(dǎo)致檢測(cè)不到病毒。

SPF雞感染REV后血清抗體持續(xù)時(shí)間很長(zhǎng)[1]，通過抗體檢測(cè)只能反映雞群的感染歷史，不能判斷雞群是否處于急性感染期，判斷感染期最可靠的方法還是進(jìn)行病毒檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用建立的熒光定量PCR方法對(duì)攻毒母雞的血清、蛋清、CEF細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明三者出現(xiàn)的時(shí)間基本一致，通過對(duì)SPF種蛋進(jìn)行病毒檢測(cè)能如實(shí)反映雞群的急性感染狀態(tài)。但由于垂直傳播率較低，實(shí)驗(yàn)步驟也比較繁瑣，本方法是否適合大規(guī)模推廣還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。對(duì)SPF雞蛋和普通雞蛋進(jìn)行REV抗原檢測(cè)，SPF雞蛋REV檢出率為0，普通雞蛋的檢出率36.7%，檢出率較高，說明我國(guó)商品雞群存在較高的REV感染率。

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(編輯：李文平)

DetectionofREVinSerumandEggsofInfectedChickensbyReal-timeFluorescentQuantitativePCR

HUANG Xiao-jie, YANG Cheng-huai, LIU Dan, HOU Li-dan, LI Hui-jiao, LI Jun-ping*, CHEN Xiao-chun*

(ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl,Beijing100081,China)

LIJun-ping,E-mail:lijunping@ivdc.org.cn;CHENXiao-chun,E-mail:chenxiaochun@ivdc.org.cn

The aim of this study was to study the egg detection indicating the REV infection status in SPF chickens. The REV of eggs in infected hens was detected by real-time PCR method already established, and compared with the serum. 12 month-old hens inoculated with REV.The egg white was extracted from the eggs and was inoculated into chicken embryo fibroblast(CEF) and passaged once, then these eggs were sealed with paraffin wax and hached, CEF was made from 9 days embryos. These egg white and CEF were detected by the real-time PCR then compared with the serum. The result showed that REV in three egg white samples could be detected from 83 samples, which collecting from the eighth and the eleventh and the fourteenth day after infection. Two CEF samples could be detected from 46 samples, which collecting from the eleventh and the fourteenth day after infection. The positive egg white and CEF was correspondence. The result indicated the two methods were consistent. The viremia continued from 6 to 18 days after attack and the positive eggs were collected from this time. The result indicated that the egg detection could be used to monitor the acute infection status in SPF chicken. The research provided a foundation for monitoring REV infection in SPF chickens by egg antigen test.

REV; real-time PCR; serum; egg white; CEF

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.11.03

2017-04-26

A

1002-1280 (2017) 11-0015-05

S852.65

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目“禽病檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與計(jì)量技術(shù)方法研究”課題(2016YFD0500809)

黃小潔，獸醫(yī)碩士，從事禽病毒類生物制品的檢驗(yàn)和研究工作。

李俊平，E-mail: lijunping@ivdc.org.cn；陳曉春，E-mail: chenxiaochun@ivdc.org.cn