李長棟 荔志云

(蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院神經(jīng)外科, 甘肅 蘭州 730050)

·論著·

大黃素甲醚對顱腦損傷大鼠NSE和GFAP表達(dá)的影響

李長棟 荔志云*

(蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院神經(jīng)外科, 甘肅 蘭州 730050)

目的觀察大黃素甲醚對創(chuàng)傷性腦損傷大鼠人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞 (hUC-MSCs)移植后神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)表達(dá)的影響。方法將40只 2～3個(gè)月齡，體重200～250 g清潔級Wistar大鼠隨機(jī)分為對照組(10只)、顱腦外傷組(10只)、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植組(10只)、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植(hUC-MSCs)+大黃素甲醚組(10只)。免疫組織化學(xué)法檢測神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)的表達(dá)。結(jié)果與模型組比較，hUC-MSCs移植組、聯(lián)合組大鼠腦組織中神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)的表達(dá)增強(qiáng)，聯(lián)合組表達(dá)更為顯著。結(jié)論大黃素甲醚可通過誘導(dǎo)hUC-MSCs表達(dá)神經(jīng)元NSE、GFAP，發(fā)揮其對TBI后神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用。

人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞; 移植; 創(chuàng)傷性顱腦損傷; 大黃素甲醚; 神經(jīng)性分化

腦外傷(traumatic brain injury, TBI)是頭部受到暴力所造成的損傷，其發(fā)生率僅次于四肢傷，在死亡傷員中占第一位，是死亡率最高的部位傷，一直是創(chuàng)傷救治的重點(diǎn)和難點(diǎn)。重型顱腦損傷所導(dǎo)致的重度殘疾和植物生存狀態(tài)是困擾臨床醫(yī)師和科研工作者的難題[1]。

作為一種治療創(chuàng)傷性顱腦損傷的新方法，近年來干細(xì)胞移植治療顱腦損傷得到了學(xué)者的共識。間充質(zhì)干細(xì)胞 (mesenchymal stem cells, MSCs)是來源于中胚層具有自我復(fù)制更新和多向分化的成體多能干細(xì)胞[2]。2003年Romanov等從人的臍帶中分離出間充質(zhì)干細(xì)胞，稱為人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells, hUC-MSCs)[3]。通過深入研究，發(fā)現(xiàn)hUC-MSCs能分化成多種組織細(xì)胞，具有來源廣泛，組織排異性低等優(yōu)點(diǎn)[4]，是用于干細(xì)胞移植和再生組織工程領(lǐng)域的優(yōu)質(zhì)材料，臨床應(yīng)用前景非常廣闊[5]。大黃素甲醚(physcion)為大黃中有效成分之一。大量文獻(xiàn)報(bào)道，大黃素甲醚具有皮層神經(jīng)元神經(jīng)營養(yǎng)的作用[6]，抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用[7]，抗炎性因子和抗氧化的作用[8]等。本實(shí)驗(yàn)研究運(yùn)用免疫組化法，從腦組織神經(jīng)元特異性蛋白的表達(dá)變化方面，觀察大黃素甲醚聯(lián)合hUC-MSCs移植對TBI后腦組織的保護(hù)作用，為研究一種既能被臨床廣泛應(yīng)用，同時(shí)又具備誘導(dǎo)分化hUC-MSCs的藥物，為治療TBI提供理論依據(jù)。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Wistar大鼠體質(zhì)量200～250 g，2～3個(gè)月齡，雌雄不限，由蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

二、主要儀器和試劑

人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院血液病干細(xì)胞治療中心培養(yǎng))；低溫高速臺式離心機(jī)(UNIVERSAL116型，德國Hetaeus公司)：倒置相差顯微鏡(CKX41-A32PH型，日本Olympus公司)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(NU-2700E型，德國NUAIR公司)；潔凈工作臺(SW-CJ-2FD型，蘇州潔凈化設(shè)備有限公司)；微量移液器(大龍醫(yī)療設(shè)備上海有限公司)：水欲搖床(SBD50-1.610型，Heto公司)；恒溫循環(huán)器(CBN8-30型，Heto公司)；電子天平(AG-135型，瑞士梅特勒公司)；流式細(xì)胞檢測儀(E0675型，美國FACSCALIBUR公司)；正置萬能顯微鏡[20050929 (ND-11D)，日本Olympus公司]；多聚酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)擴(kuò)增儀(Waltham, Massachusetts公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(BioRad公司)。

三、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)、鑒定

本實(shí)驗(yàn)?zāi)７慢R凱[9]在《人臍帶來源間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)方法的優(yōu)化》這篇文章中的方法進(jìn)行了臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)、分離和純化。取對數(shù)期P3代細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化，配制成濃度為10×106/mL的細(xì)胞懸液，每個(gè)Eppendorf管加100 μL的細(xì)胞懸液，每種抗體設(shè)置2個(gè)復(fù)管。分別加入20 μL異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)-CD44、PE-CD45、PE-CD34，對照管分別加入等量相對應(yīng)的FITC-IgG1和PE-IgG1，冰上避光孵育30 min，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution, PBS)洗滌2次，250 g離心5 min，重新制備細(xì)胞懸液，經(jīng)400目細(xì)胞篩過6濾，流式細(xì)胞儀(FACSCalibur)上機(jī)檢測，熒光激活細(xì)胞分離法(fluorescence activated cell sorting, FACS)分析，記數(shù)10細(xì)胞，Cell Quest軟件分析結(jié)果。

四、TBI動(dòng)物模型的建立與實(shí)驗(yàn)步驟

將40只大鼠隨機(jī)分為四組即對照組(10只)、TBI組(10只)、hUC-MSCs移植組(10只)、hUC-MSCs移植+大黃素甲醚組(10只)。TBI組、hUC-MSCs移植組、聯(lián)合組共30只大鼠制備TBI模型，用10%水合氯醛按3 mL/kg劑量注射至大鼠腹腔中麻醉成功后，采用改良的Feeney法建立自由落體撞擊模型造成大鼠閉合性顱腦損傷,致傷后大鼠出現(xiàn)四肢抽搐，呼吸暫停數(shù)秒，傷后昏迷2～10 h說明致傷成功。在制模結(jié)束后24 h將hUC-MSCs(已經(jīng) DAPI標(biāo)記)2.0×106個(gè)細(xì)胞懸液0.5 mL通過大鼠尾靜脈植入。 hUC-MSCs移植+大黃素甲醚組大鼠在移植細(xì)胞2～4 h開始予大黃素甲醚干預(yù)，用藥劑量40 mg/kg·d灌胃，共用藥2 w。

五、取材與處理

在模型制備后48 h、14 d、21 d，分別取TBI組及正常大鼠腦組織，常規(guī)HE染色鏡下觀察記錄大體病理改變。hUC-MSCs移植組、聯(lián)合組大鼠在細(xì)胞移植的21 d斷頭取腦備用。對照組和TBI組自前囟處開始作冠狀位切片，至海馬結(jié)構(gòu)行HE染色；hUC-MSCs移植組、聯(lián)合組同樣方法切片至海馬結(jié)構(gòu)，每個(gè)腦標(biāo)本選取位置相同的非連續(xù)層面5處，每一層面連續(xù)切片3張，用于抗體 NSE和抗體GFAP單染，片厚均為 5 μm。

六、免疫組織化學(xué)法檢測神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron specific enolase, NSE)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)

石蠟包埋，切片，脫蠟和水化，枸櫞酸鹽緩沖液(pH=6.0)電爐加熱修復(fù)。按免疫組化試劑盒說明操作，室溫下孵20 min后再滴加鏈酶親和素-過氧化物酶；二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木素輕度復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。于顯微鏡下觀察大鼠損傷腦組織 NSE及GFAP表達(dá)。每張切片隨機(jī)選取損傷側(cè)皮層5個(gè)視野，用圖像分析系統(tǒng)Image2Proplus 6.0進(jìn)行圖像采集(顯微鏡×200倍)。觀察每個(gè)視野表達(dá)陽性物質(zhì)的神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)目，測定陽性表達(dá)的面積密度和平均光密度，計(jì)算整合光密度值(integral optical density, IOD)。陽性反應(yīng)越大表示IOD值越大，反應(yīng)越強(qiáng)。反之陽性反應(yīng)越小，反應(yīng)越弱表示IOD值越小。本次試驗(yàn)中NSE及GFAP陽性均表達(dá)呈棕褐色。

七、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、TBI大鼠腦組織病理變化

大體觀察：對照組大鼠腦組織未見異常，TBI模型組大鼠腦組織可見腦皮層組織局部損傷(圖1、2)；光鏡觀察：TBI組腦組織病理變化以左側(cè)為主，病變主要集中在皮質(zhì)部位；皮質(zhì)固有細(xì)胞層次混亂，組織結(jié)構(gòu)疏松，呈篩網(wǎng)狀改變；各區(qū)域均存在神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量減少伴炎性細(xì)胞浸潤，周圍組織水腫，殘存神經(jīng)元細(xì)胞中有散在的核固縮、核碎裂、凋亡小體形成，右側(cè)腦組織病理變化不大。

圖1 大鼠腦組織造模后48 h大體標(biāo)本觀察
Fig 1 Observation of rat brain tissues at 48 h after modeling

圖2 造模后第14天大鼠斷頭取腦并行病理切片鏡下觀察，腦皮層受損傷病理學(xué)改變(HE染色, ×40)
Fig 2 At 14 d after modeling the rats were decapitated and examined by microscope (HE, ×40)

二、hUC-MSCs流式細(xì)胞學(xué)檢測

hUC-MSCs流式細(xì)胞學(xué)檢測細(xì)胞表面抗原發(fā)現(xiàn)，MSC的標(biāo)志抗原CD45表達(dá)陽性，白細(xì)胞標(biāo)志抗原CD44和造血前體細(xì)胞標(biāo)志抗原CD34均表達(dá)陰性。證實(shí)該細(xì)胞為臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(圖3A～C)。

三、免疫組織法分析NSE、GFAP的表達(dá)

在正置萬能顯微鏡下觀察，NSE、GFAP表達(dá)的陽性細(xì)胞呈棕褐色。鏡下觀察hUC-MSCs主要分布于左側(cè)大腦皮質(zhì)、海馬等部位并分化為神經(jīng)細(xì)胞，表達(dá)NSE、GFAP；聯(lián)合組標(biāo)本中hUC-MSCs的數(shù)量更多，分布范圍更廣，NSE、GFAP的表達(dá)更顯著，正常對照組和TBI模型組中NSE、GFAP的表達(dá)較少(見圖4和表1)。

圖3 hUC-MSCs表達(dá)CD44純度可達(dá)99%以上，不表達(dá)造血干細(xì)胞表型CD34和CD45
Fig 3 hUC-MSCs did not express the hematopoietic stem cell phenotype CD34 or CD45 and expression purity of CD44 was more than 99%.
A: The expression of CD44 antigen was negative in MSC; B: All of the CD34 markers of hematopoietic precursor cells were negative; C: MSC antigen positive expression of CD45.

CroupnNSEpositiveexpressionGFAPpositiveexpression Control616．91±1．4116．87±1．08 TheTBImodel616．32±1．34a16．93±1．62a hUC?MSCstransplant620．95±2．18b21．17±2．09b PHN+hUC?MSCstransplant625．82±1．72c30．29±2．48c

aPlt;0.01,vscontrol group;bPlt;0.01,vsTBI model group;cPlt;0.01,vshUC-MSCs transplantation group (PHN: Physcion).

圖4 鏡下觀察hUC-MSCs主要分布于左側(cè)大腦皮質(zhì)、海馬等部位并分化為神經(jīng)細(xì)胞，表達(dá)NSE、GFAP
Fig 4 Microscopic observation of hUC-MSCs mainly distributed in the left cerebral cortex and hippocampus and differentiated into nerve cells
A: Control group; B: TBI group; C: hUC-MSCs group; D: hUC-MSCs transplantation+physcion group.

討 論

TBI后大鼠腦組織的皮層神經(jīng)元發(fā)生了繼發(fā)性損傷、凋亡，相對應(yīng)的神經(jīng)元的功能也隨之喪失。目前利用干細(xì)胞移植治療顱腦損傷是一種比較前沿的治療方法。安雅臣等[10]證實(shí)，hUC-MSCs移植后能明顯減輕神經(jīng)系統(tǒng)的功能損害。近年來，相關(guān)hUC-MSCs移植治療腦損傷的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)積極開展，但研究發(fā)現(xiàn)移植到損傷大鼠腦組織中的hUC-MSCs神經(jīng)元分化率較低，是妨礙臨床中進(jìn)行細(xì)胞移植治療TBI的主要問題，因此，需要尋找一種不但臨床應(yīng)用廣泛而且具有誘導(dǎo)hUC-MSCs神經(jīng)分化能力的藥物，以便更加有效地治療TBI。

大黃是一味應(yīng)用廣泛的傳統(tǒng)中藥，也是我省四大名貴中草藥之一。主要藥理作用包括：致瀉作用，保肝作用，止血作用，利尿作用，抗炎作用，抑制細(xì)胞凋亡等[11-14]。大黃素甲醚(physcion)為大黃中有效成分之一。大黃素甲醚具有皮層神經(jīng)元神經(jīng)營養(yǎng)作用[15]，抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡作用[16]，抗炎性因子和抗氧化作用[17]等。近些年來有關(guān)中藥誘導(dǎo)hUC-MSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化的研究取得了重大的進(jìn)展，例如使用黃芪、七葉皂苷鈉等，并檢測到誘導(dǎo)后hUC-MSCs可以表達(dá) NSE、GFAP等多種神經(jīng)細(xì)胞的特異性標(biāo)志物[18]。本研究發(fā)現(xiàn)hUC-MSCs經(jīng)大黃素甲醚誘導(dǎo)后可表達(dá)神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)且表達(dá)增強(qiáng)，提示大黃素甲醚具有促進(jìn)hUC-MSCs分化和增殖的作用。

綜上所述，本研究證實(shí)了大黃素甲醚可通過誘導(dǎo)hUC-MSCs表達(dá)神經(jīng)元NSE、GFAP，發(fā)揮其對TBI后神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用。

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EffectsofphysciononexpressionofNSEandGFAPinratswithcerebralinjury

LIChangdong,LIZhiyun

DepartmentofNeurosurgery,GeneralHospitalofLanzhouMilitaryCommand,Lanzhou730050, China

ObjectiveEffects of physcion on expressions of neuron specific enolase (NSE) and glial fibrillary acidic protein (GFAP) after transplantation of human umbilical cord mesenchymal stem cells (hUC-MSCs) in rats with traumatic brain injury were studied.MethodsA total of 40 clean Wistar rats (2～3 months, weighing 200～250 g) were divided randomly into control group (10 rats), TBI group (10 rats), hUC-MSCs group (10 rats), and hUC-MSCs transplantation+physcion group (10 rats). Expressions of NSE and GFAP were detected by immunohistochemical assay.ResultsCompared with TBI model group, the expressions of NSE and GFAP in hUC-MSCs group and hUC-MSCs transplantation+physcion group were significantly increased, with the hUC-MSCs transplantation+physcion group the most significant.ConclusionPhyscion can induce the expression of NSE and GFAP by hUC-MSCs, and exert its protective effect on the neurons after TBI.

hUC-MSCs; Transplantation; Traumatic brain injury; Physcion; Neurogenic differentiation

1671-2897(2017)16-321-04

R 651

A

甘肅省科技重大專項(xiàng)課題基金資助項(xiàng)目(1102FKDA005)；后勤科研計(jì)劃課題基金資助項(xiàng)目(CLZ12J006)

李長棟，碩士研究生，E-mail:13919932236@163.com

*通訊作者：荔志云，教授，碩士生導(dǎo)師，E-mail:lizhiyun456@l63.com

2016-08-28；

2017-06-05)