錢大偉，扶教龍，吳晨奇，邱業(yè)先，施 磊，胡翠英，李良智

（蘇州科技大學(xué) 化學(xué)生物與材料工程學(xué)院，江蘇 蘇州 215009）

研磨 -超聲法提取根瘤土壤桿菌發(fā)酵產(chǎn)物CoQ10

錢大偉，扶教龍*，吳晨奇，邱業(yè)先，施 磊，胡翠英，李良智

（蘇州科技大學(xué) 化學(xué)生物與材料工程學(xué)院，江蘇 蘇州 215009）

通過研磨輔助超聲波法進行單因素和響應(yīng)面實驗，以優(yōu)化根瘤土壤桿菌中輔酶Q10的提取條件。得出的最佳工藝條件為：丙酮研磨料液比為1∶6，研磨時間為5 min；超聲波破碎輸出功率為260 W，工作總時間為14 min，每次輻射時間1.3 s。優(yōu)化后輔酶Q10的提取率可達135.82%。結(jié)果與理論值相符合，并且明顯優(yōu)于常規(guī)超聲波法提取，因此，該方法具有一定的實際應(yīng)用價值。

輔酶Q10；研磨法；超聲波破碎法；響應(yīng)面法；根瘤土壤桿菌

輔酶Q10（CoQ10）是一種脂溶性醌類化合物，是呼吸鏈中的必要成分。CoQ10具有抗氧化和清除氧自由基的功效，可預(yù)防和治療多種疾病，在治療心臟衰竭、延緩皮膚衰老等方面具有較廣泛的應(yīng)用[1]。因此，經(jīng)濟生產(chǎn)CoQ10的途徑也變得尤為重要。CoQ10的生產(chǎn)方法一般有組織提取法、化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法幾種，其中微生物發(fā)酵法具有成本低、不受原料限制、產(chǎn)品活性好和易大規(guī)模生產(chǎn)的特點，成為最具發(fā)展?jié)摿屯茝V前景的生產(chǎn)方法[2]。作為胞內(nèi)產(chǎn)物，CoQ10的提取成為整個生產(chǎn)過程中一個重要的工藝步驟，提取工藝的選擇將直接影響到產(chǎn)品的得率、質(zhì)量、后續(xù)的精制工藝以及產(chǎn)品成本等[3]。

CoQ10提取一般由超聲法、皂化法或多種方法結(jié)合使用。超聲法具有簡便、快速、高效等優(yōu)點，超聲法不但可以獲得較高的提取率，而且不會使胞內(nèi)物質(zhì)受到破壞，是提取胞內(nèi)物質(zhì)的常規(guī)手段[4-6]。李偉靜等[7]優(yōu)化超聲提取條件后，CoQ10得率比堿醇皂化法提高了近6倍。為了獲得更高的產(chǎn)品得率，常常將超聲波破碎法與其他法結(jié)合使用[8]。如龍海燕等[9]使用超聲輔助皂化提取黑曲霉中CoQ10，結(jié)果比常規(guī)皂化法的效率提高了55%。許芳等[10]使用酶解和凍融方法輔助超聲提取光合細菌中CoQ10，提取率分別提高了5.1%和9.4%。李祖明等[11]使用酶法輔助超聲波法從類球紅細菌提取CoQ10，提取率也提高了91.9%。可見，超聲法與其他方法結(jié)合使用，可明顯提高CoQ10的提取率。

筆者采用研磨法和超聲法結(jié)合的方法從根瘤土壤桿菌中提取輔酶Q10，通過對樣品進行預(yù)處理，有利于后續(xù)產(chǎn)物的提取，且大大減少有毒有害試劑的用量和排放，對環(huán)境是友好的，而且方便大規(guī)模生產(chǎn)。因此，研磨法輔助超聲法提取輔酶Q10，從理論上看能夠提高輔酶Q10的提取率，在生產(chǎn)中具有較廣闊的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

根瘤土壤桿菌（Agrobacterium tumefaciens）購自中國普通微生物菌種保藏管理中心（CGM-CC）。根瘤土壤桿菌突變株為筆者所在實驗室篩選獲得。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：葡萄糖1%（w/v，下同），酵母膏0.5%，蛋白胨0.5%，氯化鈉0.5%；NaOH調(diào)pH值至7.2，121℃滅菌20 min，斜面培養(yǎng)基在種子培養(yǎng)基中添加2%瓊脂。

發(fā)酵培養(yǎng)基：糖蜜廢液 8%，玉米漿 1%，MgSO4·7H2O 0.3%，KH2PO40.2%，（NH4）2SO40.4%，NaCl 0.2%，NaOH調(diào)pH值至7.2，121℃滅菌30 min。

1.2 方法

1.2.1 菌體制備

將保存于斜面的根瘤土壤桿菌接種于種子培養(yǎng)基中，在30℃、200 r·min-1條件下?lián)u床培養(yǎng)24 h，得液體種子。按 10%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r·min-1搖床培養(yǎng) 72 h，4 000 r·min-1、離心 15 min，經(jīng)蒸餾水洗滌2次后，再經(jīng)真空冷凍干燥處理24 h，獲得干菌體，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 研磨處理初始條件

精確稱取0.4 g干菌體攪拌均勻，倒入研缽中，按1∶6的料液比（g·mL-1）加入丙酮與菌體混合，開始研磨計時3 min。研磨時，注意力度均勻速度穩(wěn)定，盡量避免因研磨強度而造成的誤差。研磨結(jié)束后，快速將其轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中，用50℃蒸干丙酮。收集的干菌體即為CoQ10的粗提物。

1.2.3 超聲波破碎提取

將得到的粗提物用8 mL無水乙醇重懸為菌懸液，冰浴超聲，超聲條件為：輸出功率為270 W，工作總時間為10 min，每次輻射時間2 s。破碎結(jié)束后，破碎液于4℃冰箱過夜，使其析出膽固醇等雜質(zhì)。次日，將細胞破碎液過濾，定容，最后用craven氏顏色試驗法檢測樣品中CoQ10的含量。

1.2.4 CoQ10標準曲線

該方法利用在堿性條件下氰基乙酸乙酯可取代CoQ10的甲氧基生成藍色化合物，并在波長620 nm處有最大吸收值。根據(jù)不同濃度的CoQ10標準品溶液在堿性條件下與氰基乙酸乙酯反應(yīng)，測得在620 nm下的吸光度值繪制標準曲線[12]。其中CoQ10的乙醇溶液與氰基乙酸乙酯和甲醇鈉的甲醇溶液體積比為5∶4∶l，反應(yīng)10 min后測的吸光值Y，以吸收值Y與CoQ10濃度X（mg·L-1）做回歸處理，得標準曲線，求出回歸方程為：Y=57.61X，R2=0.999 6。

1.2.5 CoQ10含量測定及計算

根據(jù)不同CoQ10提取液與氰基乙酸乙酯和甲醇鈉的甲醇溶液反應(yīng)，測得其在620 nm下的吸光值代入標準曲線，求得其中 CoQ10含量。CoQ10得率（mg·g-1）Y=V1C/M=0.008C/0.2=0.04C。其中，V1為 CoQ10提取液體積，L；C 為提取液中 CoQ10濃度，mg·L-1；M 樣品干菌重量，g。

其中，Y1為下文2.1節(jié)單因素實驗中的最高CoQ10得率的平均值；Y2為每次單因素實驗中CoQ10的最高得率的平均值。

1.2.6 單因素實驗

在研磨輔助超聲波法初始條件下，逐步改變研磨料液比、研磨時間進行單因素分析實驗，分別考察其對CoQ10提取率的影響。在較優(yōu)研磨條件下輔助超聲波法，逐步改變超聲破碎總功率、破碎總時間、每次輻射時間進行單因素實驗，從而分別考察出其對CoQ10提取率的影響。

1.2.7 響應(yīng)面實驗

在上面單因素實驗基礎(chǔ)上，選擇恰當(dāng)?shù)囊蛩睾退?，進行響應(yīng)面實驗，找出最優(yōu)的因素和水平，得到理論預(yù)測的CoQ10提取率。

1.2.8 驗證實驗

在響應(yīng)面分析法求得的最佳條件下，考慮到實際情況的可操作性，進行再次實驗，三次平行取平均值，測得CoQ10的得率與提取率，與理論預(yù)測值作比較，來驗證模型的可靠性。

1.2.9 不同破碎方法提取效果比較

將研磨輔助超聲波法提取效果與單一的研磨法、單一的超聲波法比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 研磨料液比對CoQ10提取率的影響

在研磨初始條件下，改變干菌體與丙酮比例分別為 1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10，以最高提取率為 100%，觀察其對CoQ10提取率的影響，結(jié)果見圖1?？梢?，當(dāng)干菌體與丙酮的比例為1∶6時，對CoQ10具有最高的提取率，其得率為3.843 mg·g-1，并以此提取率為100%，下面實驗均與此得率做比較，得出相對提取率。因此，選擇料液比為1∶6的方式進行后續(xù)實驗。

2.2 研磨時間對CoQ10提取率的影響

采用干菌體與丙酮比例為1∶6的最佳方式，研磨時間分別設(shè)定為1、3、5、7、9 min，以超聲初始條件提取CoQ10，考察研磨時間對CoQ10提取率的影響，結(jié)果見圖2。由圖2可知，當(dāng)研磨時間為5 min時，CoQ10得率達到最高為4.897 mg·g-1，提取率為127.42%。當(dāng)超過5 min后，細胞內(nèi)CoQ10充分釋放后，由于空氣中的氧氣以及光照影響，CoQ10開始了降解，因而使提取率開始下降。由此，確定最佳研磨時間為5 min。

圖1 丙酮研磨料液比對CoQ10提取率的影響

圖2 研磨時間對CoQ10提取率的影響

2.3 超聲波總功率對CoQ10提取率的影響

采用較優(yōu)研磨條件下輔助超聲提取CoQ10，在超聲波法初始條件下改變超聲總功率分別為 90、180、270、360、450 W 進行實驗，考察超聲總功率對CoQ10提取率的影響，結(jié)果見圖3。當(dāng)超聲波工作總功率達到270 W時，CoQ10提取率達到127.42%，得率最高為4.897 mg·g-1。由于超聲波功率主要是通過惠更斯原理以及空化作用而造成影響，超聲波功率越大，造成的影響也就越劇烈。當(dāng)功率小于270 W時，超聲波的處理對于CoQ10的釋放和在有機物中的溶解起促進作用，但是當(dāng)功率超過270 W時，因為功率過大，空化作用開始對細胞結(jié)構(gòu)造成破壞，導(dǎo)致細胞內(nèi)組織破碎，影響CoQ10的提取。因此，最終確定270 W為最適功率。

圖3 超聲波破碎總功率對CoQ10提取率的影響

2.4 超聲波破碎總時間對CoQ10提取率的影響

采用較優(yōu)研磨條件輔助超聲提取CoQ10，在超聲波法初始條件下改變超聲總時間依次在5、10、15、20、25 min進行實驗?？疾斐暱倳r間對CoQ10提取率的影響，結(jié)果見圖4。當(dāng)超聲波破碎總時間為15 min時，CoQ10提取率最高為131.50%，得率為5.054 mg·g-1。低于15 min，超聲破碎不充分，細胞破碎不完全。高于15 min，超聲會對CoQ10的結(jié)構(gòu)造成破壞，并被空氣氧化。因此，最終選定最佳超聲破碎總時間為15 min。

2.5 超聲波破碎每次輻射時間對CoQ10提取率的影響

采用較優(yōu)研磨條件輔助超聲提取CoQ10，在超聲波法初始條件下改變超聲破碎每次輻射時間分別為1、2、3、4、5 s進行實驗?？疾烀看屋椛鋾r間對CoQ10提取率的影響，結(jié)果見圖5。由圖5可見，每次輻射時間為2 s時，CoQ10提取率達到最高為127.42%，得率為4.897 mg·g-1。低于2 s，超聲波的空化作用引起的劇烈震動不足以使細胞完全破碎。高于2 s，能量過度和溫度升高可能會破壞CoQ10，影響CoQ10的提取，因此，確定最佳輻射時間為2 s。

圖4 超聲波破碎總時間對CoQ10提取率的影響

圖5 超聲波破碎每次輻射時間對CoQ10提取率的影響

2.6 響應(yīng)面優(yōu)化提取條件

2.6.1 試驗設(shè)計與結(jié)果

根據(jù)單因素研究試驗的結(jié)果，選擇超聲波破碎功率（X1）、工作總時間（X2）、每次輻射時間（X3）三個因素確定的水平范圍，用Design-Expert.V8.0.6統(tǒng)計分析軟件設(shè)計響應(yīng)面試驗，進行三因素三水平，共15個實驗點的響應(yīng)面實驗[13－14]。因素及水平見表1，實驗設(shè)計及結(jié)果見表2，其中包括12個析因點實驗，3個零點重復(fù)實驗用于估計實驗誤差。

表1 響應(yīng)面試驗因素水平表

表2 響應(yīng)面設(shè)計表及實驗結(jié)果

2.6.2 回歸模型建立及方差分析

通過Design-Expert.V8.0.5b統(tǒng)計分析軟件對表2試驗結(jié)果進行多元回歸擬合，建立二次多項式回歸模型[15-16]。以CoQ10提取率為響應(yīng)值的全變量二次回歸方程：Y=29.764 58+0.289 91X1+11.071 17X2-11.82750X3-3.316 67×10-3X1X2+0.039 593X1X3+0.555 67X2X3-5.635 80×10-4X12-0.397 70X22-2.433 33X32。

根據(jù)表3方差分析可知，方程自變量與因變量之間的線性關(guān)系明顯，回歸方程p=0.003＜0.005，回歸效果顯著，模型失擬項為0.076 1＞0.05，說明該模型的模式失擬項不顯著。而交互項（X1X3）、（X2X3）極顯著，說明超聲總功率和每次輻射時間、超聲總時間與每次輻射時間等因素之間的交互作用極顯著。由表4模型可信度分析得該模型相關(guān)性系數(shù)R2=0.988 5，決定系數(shù)R2Adj=0.967 9，說明該模型與實驗擬合良好，自變量與響應(yīng)值之間線性關(guān)系顯著，可用于該反應(yīng)的理論推測。變化系數(shù)（CV）越低，實驗的可信度和精確度越高，CV=1.16%表示實驗數(shù)據(jù)可靠，分析結(jié)果可信。因此，可用此回歸方程代替各組實驗對實驗結(jié)果進行分析和預(yù)測。根據(jù)回歸方程作出不同因子的響應(yīng)面分析圖（圖6、7、8）。由響應(yīng)面分析圖可見，當(dāng)超聲破碎功率為250-280 W、總時間為13-17 min、每次輻射時間為1-1.75 s，可以得到較高的CoQ10得率與提取率。

表3 回歸模型方差分析表

表4 模型可信度分析

圖6 y=f（x1，x2）響應(yīng)面立體圖

圖7 y=f（x1，x3）響應(yīng)面立體圖

圖8 y=f（x2，x3）響應(yīng)面立體圖

2.7 驗證試驗

在響應(yīng)面分析法求得的最佳條件下，考慮到實際情況的可操作性，根據(jù)二次回歸方程獲得較優(yōu)的超聲提取條件是：超聲功率260 W，超聲總時間14 min，每次輻射時間1.3 s，CoQ10提取率可達到136.03%。為檢驗響應(yīng)面分析法的可靠性，采用上述最優(yōu)條件進行驗證實驗，三次平行取平均值，實測得CoQ10的得率為5.219 mg·g-1，提取率為135.82%，這一結(jié)果雖然與理論預(yù)測值稍有偏差，分析原因可能是每次研磨帶來的誤差，但是該模型仍舊可以較好地預(yù)測實際提取情況。

2.8 不同破碎方法效果比較

取相同質(zhì)量的培養(yǎng)物分別進行研磨輔助超聲波法提取（最優(yōu)條件下）、單一的研磨法（1∶6料液比、研磨5 min）和單一的超聲波法（2 s每次輻射時間、270 W功率超聲15 min）比較提取效果。結(jié)果見表5，明顯可見研磨輔助超聲波法能獲得更好的提取效果。

表5 三種提取方法比較

3 結(jié)語

以超聲作為細胞破碎的手段，并輔以研磨的方法，力求降低有毒有害原料及中間添加劑的使用量，盡可能的提高所需產(chǎn)物的產(chǎn)量，并減少有害物質(zhì)的排放。在以上目標的前提下，實驗結(jié)果得到最佳工藝條件：丙酮研磨最佳料液比為1∶6，研磨時間為5 min。超聲波破碎中，最佳輸出功率為260 W，工作總時間為14 min，每次輻射時間為1.3 s。采用優(yōu)化后的丙酮研磨輔助超聲波破碎提取法，CoQ10提取率可達135.82%。這為優(yōu)化CoQ10提取工藝打下基礎(chǔ)。但該實驗仍存在一定的問題，雖然盡量控制研磨強度（轉(zhuǎn)速、震動頻率、受力面壓強大小等）、研磨界面的粗糙程度，但人為因素較大，仍存在較大的誤差，且無法控制與檢測。但該實驗為CoQ10提取提供一個新思路，而且工業(yè)中研磨機的使用能較好的避免這些不足帶來的誤差。在接下來的試驗中，將進一步探究較大規(guī)模的CoQ10提取工藝，并對超聲波與其他破碎手段結(jié)合方面進行深入、系統(tǒng)的研究。

[1]ZHONG W H，F(xiàn)ANG J J，LIU H G，et al.Enhanced production of CoQ10by newly isolated sphingomonas sp.ZUTEO3with a coupled fermentationextraction process[J].Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology，2009，36（5）：687-693.

[2]JEYA M，MOON H J，LEE J L，et al.Current state of coenzyme Q10production and its applications[J].Applied Microbiologyamp;Biotechnology，2010，85（6）：1653-1663.

[3]MORIYAMA D，HOSONO K，F(xiàn)UJII M，et al.Production of CoQ10in fission yeast by expression of genes responsible for CoQ10biosynthesis[J].Bioscience Biotechnologyamp;Biochemistry，2015，79（6）：1-8.

[4]LIAO J，QU B，LIU D，et al.New method to enhance the extraction yield of rut in from sophora japonica using a novel ultrasonic extraction system by determining optimum ultrasonic frequency[J].Ultrasonics Sonochemistry，2015，27（11）：110-116.

[5]KE L.Optimization of ultrasonic extraction of polysaccharides from lentinus edodes based on enzymatic treatment[J].Journal of Food Processingamp;Preservation，2015，39（2）：254-259.

[6]扶教龍，張云康，陳佳佳，等.超聲波法提取番茄紅素的工藝研究[J].食品研究與開發(fā)，2009，30（12）：178-181.

[7]李偉靜，喬志新，賀敏，等.快速提取類球紅細菌中CoQ10的方法研究[J].生物技術(shù)通訊，2009，20（2）：221-223.

[8]王桃云，邱業(yè)先，汪金蓮，等.響應(yīng)面法優(yōu)化銀杏葉多酚提取工藝及對脲酶抑制活性的研究[J].化學(xué)研究與應(yīng)用，2013（7）：999-1005.

[9]龍海燕，郭育濤，邢遠清，等.超聲輔助皂化提取黑曲霉中輔酶Q10的研究[J].應(yīng)用化工，2007，36（3）：266-269.

[10]許芳，張淑榮，張鵬，等.酶解和凍融輔助超聲提取光合細菌中CoQ10的研究[J].化學(xué)與生物工程，2008，25（8）：43-45.

[11]李祖明，常平，高麗萍，等.酶法輔助超聲波法提取類球紅細菌CoQ10條件優(yōu)化[J].微生物學(xué)雜志，2014，1（1）：47-52.

[12]郜曉峰，范成英，何開澤，等.薄層色譜紫外分光光度法定量測定微生物發(fā)酵產(chǎn)物輔酶Q10[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報，2006，12（3）：420-423.

[13]劉佳，李良智，胡翠英，等.廢棄茶葉對模擬苯酚廢水的吸附研究[J].蘇州科技學(xué)院學(xué)報（自然科學(xué)版），2014，31（2）：41-46.

[14]凌宏志，葛菁萍，平文祥，等.響應(yīng)面法優(yōu)化黑曲霉HDF05產(chǎn)β-葡萄糖苷酶過程參數(shù)[J].生物工程學(xué)報，2011，27（3）：419-426.

[15]WU J，YU D，SUN H，et al.Optimizing the extraction of anti-tumor alkaloids from the stem of Berberis amurensis by response surface methodology[J].Industrial Cropsamp;Products，2015，69（7）：68-75.

[16]SUN S Q，WANG Y J，XU W，et al.Optimizing ultrasound-assisted extraction of prodigiosin by response surface methodology[J].Preparative Biochemistryamp;Biotechnology，2015，45（2）：101-108.

責(zé)任編輯：李文杰

Coenzyme Q10extraction from Agrobacterium tumefaciens with grinding-ultrasonic method

QIAN Dawei， FU Jiaolong*， WU Chenqi， QIU Yexian， SHI Lei， HU Cuiying， LI Liangzhi
（School of Chemistry，Biology and Materials Engeneering，SUST，Suzhou 215009，China）

We studied the extraction of coenzyme Q10from Agrobacterium tumefaciens with grinding-ultrasonic method.Optimum working conditions were gained by single factor test and response surface experiments.The optimal conditions for coenzyme Q10extraction were as follows:the ratio of acetone 1∶6，total grinding time by acetone 5 min，output power of ultrasonic disruption 260 W，work time 1.3 s，total time 14 min.Under the optimized conditions，the extraction rate of coenzyme Q10could reach 135.82%.This method is reliable and superior to the traditional method of ultrasonic extracting，so it is of great application value.

coenzyme Q10；grinding method；ultrasonic disruption；response surface methodology；Agrobacterium tumefaciens

Q814.1

A

2096－3289（2017）04－0047－07

2016－03－26

蘇州市科技計劃項目（SYN201317）；蘇州科技學(xué)院科研基金資助項目（XKZ201411）

錢大偉（1991-），男，江蘇鹽城人，碩士研究生，研究方向：生物化工，微生物育種。

*通信作者：扶教龍（1969-），男，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，E-mail：jlfu999@126.com。