楊琴波，崔金剛，王培偉，丁李立強，陳 瑜，張 騰

·基礎醫(yī)學論著/研究·

三七總皂苷防治異丙腎上腺素誘導的心肌損傷實驗研究

楊琴波1，2，崔金剛1，2，王培偉1，2，丁李立強1，陳 瑜1，2，張 騰1，2

目的觀察三七總皂苷(PNS)對異丙腎上腺素(ISO)誘導的心肌損傷的療效，并探索三七總皂苷防治心肌損傷潛在的作用機制，為三七總皂苷防治心肌損傷的臨床應用提供實驗依據(jù)。方法將實驗小鼠分為3組：正常對照組、ISO模型組、PNS治療組。ISO造模7 d后，取心臟組織進行HE染色和Masson三色染色評估PNS對ISO誘導的心肌損傷的防治作用。進一步對心肌組織行RT-PCR檢測miR-1和miR-222表達，通過免疫組化方法檢測MET蛋白在心肌組織的表達。結(jié)果心臟病理染色顯示，ISO誘導的心肌損傷模型組心肌細胞壞死、大量炎性細胞浸潤、膠原纖維增多。而PNS治療組心臟僅有少量，偶見的炎性細胞，膠原纖維陽性率較ISO模型組顯著降低。在ISO模型組心臟中miR-1表達較正常對照組顯著降低，miR-222表達顯著升高。經(jīng)PNS治療后，與ISO模型組相比miR-1表達顯著增高；而miR-222表達顯著降低。免疫組化表明，MET在模型組心臟中表達顯著升高且主要集中在損傷部位，而在PNS治療組中顯著降低。結(jié)論PNS對ISO誘導的心肌損傷具有明顯防治作用，miR-1/MET/miR-222信號通路可能參與ISO誘導心肌損傷的形成及PNS抗心肌損傷。

心肌損傷；三七總皂苷；微小核苷酸；異丙腎上腺素

心血管疾病已成為威脅人類健康的頭號殺手。最新統(tǒng)計表明，心血管病死亡占我國城鄉(xiāng)居民總死亡原因首位，農(nóng)村為44.6%，城市為42.51%[1]。心血管疾病負擔日漸加重，已成為重大的公共衛(wèi)生問題，因此對心血管疾病研究已成為目前全世界重點。心血管疾病作為高發(fā)慢性病，其發(fā)生與多種因素相關，包括：吸煙、高血壓、肥胖、高血脂、糖尿病、情緒問題等。有研究表明，各類心血管疾病如心肌缺血，心肌梗死，心肌肥厚等引起心肌細胞壞死或凋亡、炎癥細胞浸潤、細胞外基質(zhì)蛋白或膠原纖維增多、細胞排列紊亂等病理特征[2]。目前西醫(yī)對心血管疾病治療有手術治療和藥物治療，藥物治療多以病因為主，分為硝酸酯類、他汀類降血脂藥、抗血小板制劑、β-受體阻滯劑、鈣通道阻滯劑等。中醫(yī)將心血管疾病歸為“胸痹”“心痛”等疾病范疇，主要有治則：行氣活血、芳香溫通、活血化瘀、益氣活血、宜痹通陽、通陽化痰和補腎健脾[3]，其中活血化瘀方藥運用廣泛，有較好療效。

三七為五加科植物三七Panax notoginseng (Burk)F.H.Chen的干燥根和根莖，是一類常用的中藥材，主要功效為：活血祛瘀，止血，消腫止痛?！侗静菥V目拾遺》中記載：“人參補氣第一，三七補血第一”，并有“止血不留瘀，行血不傷新”的作用。通過統(tǒng)計600首治療冠心病方劑中藥使用頻率，發(fā)現(xiàn)三七使用139次，說明三七在臨床上廣泛應用于心血管疾病的治療[4]。三七總皂苷(panax notoginseng saponins，PNS)為三七的主要有效活性成分，有研究表明其具有抗血小板聚集、抗氧化、抗炎等藥理作用[5]，但其防治心血管疾病的作用機制還需進一步研究。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類長度約18個～24個核苷酸，內(nèi)源性的非編碼單鏈RNA。miRNA通過與靶基因mRNA 3’UTR區(qū)域結(jié)合從而抑制靶基因的表達，達到負向調(diào)控基因表達目的，通過這種方式miRNA調(diào)控人類基因組約1/3基因。miRNA表達受相關基因調(diào)控，因此生長、發(fā)育、疾病發(fā)生等過程中miRNA-mRNA網(wǎng)絡式互作起重要作用。有研究表明，多個miRNA在心血管疾病發(fā)病過程中起重要作用，如血管重構(gòu)、炎癥反應、細胞增殖和遷移等[6-8]。那么miRNA是否參與PNS防治心血管疾病過程呢？

異丙腎上腺素(isoproterenol，ISO)為β受體激動劑，臨床上主要治療支氣管哮喘、心臟驟停、房室傳導阻滯和抗休克等，過量使用時，由于心肌收縮力和耗氧量增加，引起心律失常、心肌缺血壞死等，因此實驗室常用異丙腎上腺素誘導心肌損傷動物模型[9]。本研究使用異丙腎上腺素誘導小鼠心肌損傷模型，并行PNS治療。經(jīng)心臟HE染色和Masson三色染色評估ISO是否誘導造模成功及PNS對ISO誘導心肌損傷的療效；進一步通過檢測心肌組織中miRNA表達和組織免疫組化探討PNS在防治ISO誘導心肌損傷中潛在的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 4周齡清潔級雄性C56BL/6小鼠購置于上海斯萊克實驗動物有限公司，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院動物實驗中心[合格證：SYXK(滬)2006-0001，No.0069937]。飼養(yǎng)觀察室溫度：25 ℃±2 ℃，相對濕度：40%～50%，給予標準光照周期(12 h光照/12 h黑夜)。

1.2 試劑與儀器 PNS(純度≥98%)購于上海泛亞生物醫(yī)藥集團； ISO(純度≥99%)購于東京化成工業(yè)株式會社(TCI)；石蠟包埋組織miRNA抽提試劑盒購于Thermo Fisher；miR-222和miR-1引物訂購于上海生工技術有限公司。兔抗鼠MET抗體購于Santa Cruz，羊抗兔二抗購于武漢三鷹。HE染色、Masson三色染色和免疫組化的組織切片使用萊卡DM2000(LEICA)觀察拍照，實時熒光定量PCR在羅氏480(Roche 480II)上進行。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗動物分組及造模 4周齡雄性C56BL/6小鼠飼養(yǎng)至平均體重20 g左右，按體重隨機分為：①正常對照組(VC)；②ISO模型組(Model)；③PNS治療組(PNS)，每組6只。小鼠心肌損傷的造模方法：腹腔注射ISO 5 mg/kg體重，每日1次，連續(xù)7 d。模型組小鼠先腹腔注射100 μL PNS溶劑對照(PBS)30 min后，腹腔注射ISO 5 mg/(kg·50 μL)，連續(xù)7 d。PNS治療組小鼠腹腔注射PNS 150 mg/(kg·100 μL) 30 min后，腹腔注射ISO 5 mg/(kg·50 μL)。同時正常對照組小鼠每日平行注射PNS溶劑對照(100 μL，PBS)和ISO溶劑對照(50 μL，DMSO)。7 d后對實驗小鼠進行解剖取材。

1.3.2 心臟組織HE染色和Masson三色染色 將剝離的心臟在4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋。心臟組織從心尖部連續(xù)作橫斷面切片(厚度為4 μm)，每個樣品選取4張間隔相等的切片用于HE染色和Masson 三色染色。在光學顯微鏡下觀察組織病理改變。

1.3.3 心臟miRNA抽取及表達檢測 石蠟包埋心臟組織的miRNA使用Life Technology 公司的專用試劑盒(RecoverAllTMTotal Nucleic Acid Isolation Kit)抽取。從心臟石蠟塊上連續(xù)切4個20 μm切片用于miRNA抽提，實驗操作嚴格遵守試劑盒操作手冊。抽提miRNA進行濃度測定后，使用miScript Reverse Transcription Kit (Qiagen)將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA用于實時熒光定量PCR。QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix(Qiagen)、cDNA、通用引物和miRNA特異引物按照試劑說明書進行配制，之后在Roche 480II上完成數(shù)據(jù)采集和分析。U6B作為內(nèi)參用于評估各組心肌組織中miR-1、miR-222的相對表達。實時熒光定量PCR實驗中所有樣本三個復孔同時進行擴增，且實驗重復3次。miR-1特異引物為5’CCCCTGGAATGTAAAGAAGTATG3’；miR-222特異引物為5’AGCTACATCTGGCTACTGGGT3’；U6B特異引物為5’ACGCAAATTCGTGAAGCGTT3’。

1.3.4 心臟MET免疫組化 組織切片脫蠟至水，經(jīng)過3%H2O2-甲醇溶液封閉15 min；0.01 mol/L檸檬酸緩沖液微波30 min抗原修復；10%兔血清2 h封閉非特異性抗原；之后MET抗體1∶50稀釋，4 ℃過夜孵育；二抗1∶200稀釋孵育30 min；HRP標記的鏈霉親和素1∶200稀釋孵育30 min；最后DAB顯色5 min；蘇木素復染5 min；脫水、透明、封片在光學顯微鏡下讀片。

2 結(jié) 果

2.1 PNS顯著減輕ISO誘導的心肌損傷 正常對照組心臟HE染色顯示：心肌細胞排列規(guī)則，心肌結(jié)構(gòu)完整；而ISO模型組左心室出現(xiàn)大面積心肌細胞壞死，壞死區(qū)域大量炎癥細胞聚集，細胞排列雜亂；而PNS治療組小鼠心臟HE染色顯示左心室有少量、散在的心肌細胞壞死和炎癥細胞聚集，其程度明顯輕于ISO模型組(見圖1)。因此小鼠心臟病理觀察顯示ISO成功地誘導小鼠心肌損傷，而PNS可有效地緩解ISO誘導的心肌損傷。

圖1 小鼠心臟HE染色

2.2 PNS顯著減少ISO誘導產(chǎn)生的膠原纖維 心臟組織Masson三色染色標記膠原纖維以評估心肌纖維化的程度。如圖2所示，正常對照組僅在血管周圍可見膠原纖維陽性染色；ISO模型組則在損傷區(qū)域可見大量膠原纖維陽性染色；PNS治療組在損傷區(qū)域可見少量膠原纖維陽性染色，但顯著少于ISO模型組。通過使用Image Pro對膠原纖維陽性染色進行定量分析，發(fā)現(xiàn)ISO模型組膠原纖維陽性率為(9.79±1.06)%，顯著高于正常對照組(1.26±0.24)%(P=0.0054)；而PNS治療組膠原纖維陽性率為(3.32±0.68)%，與ISO模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.015 9)。因此，Masson三色染色表明ISO誘導的心肌損傷促進膠原纖維生成，而PNS能顯著緩解ISO誘導產(chǎn)生的膠原纖維。

注：與正常對照組比較，*Plt;0.05；與模型組比較，#Plt;0.05。

2.3 心肌組織切片miR-1與miR-222表達的影響 RT-PCR結(jié)果表明，與正常對照組比較，ISO模型組心肌組織中miR-1表達顯著降低(P=0.040 4)；PNS治療組心肌組織中miR-1表達較ISO模型組顯著升高(P=0.002 6)(圖3A)。如圖3B所示miR-222的表達在ISO模型組中較正常對照顯著升高(P=0.043 2)，而PNS治療組中miR-222的表達較ISO模型組顯著降低(P=0.007 9)。詳見圖3。

注：與正常對照組比較，*Plt;0.05；與模型組比較，#Plt;0.05。

圖3小鼠心臟中miR-1和miR-222的表達

2.4 小鼠心臟MET免疫組化表達 MET為miR-1的靶基因，受到miR-1負向調(diào)節(jié)，同時MET可激活miR-222表達。本研究對心肌組織MET免疫染色，MET免疫陽性主要集中在心肌損傷部位。通過定量心肌組織中MET免疫陽性率表明，ISO模型組MET免疫陽性率顯著高于正常對照組(P=0.001)；而PNS治療組MET免疫陽性率比ISO模型組顯著降低(P=0.001)。詳見表4。

注：與正常對照組比較，*Plt;0.05；與模型組比較，#Plt;0.05。

圖4小鼠心臟MET免疫組化

3 討 論

PNS作為三七的主要活性成分，多項研究表明其對心肌損傷具有良好的治療作用，且臨床上有以PNS為主要成分的心血管藥物，如血塞通。本課題組在腫瘤并發(fā)心肌損傷模型中證實PNS對心肌損傷的防治作用。本研究通過HE染色和Masson三色染色證明，PNS具有抗心肌損傷作用，這一結(jié)果與以往報道一致。miRNA在心血管病的發(fā)生、發(fā)展中具有重要意義，參與血管生成、血管內(nèi)皮再生、平滑肌細胞和內(nèi)皮細胞的增殖、遷移、凋亡；炎細胞浸潤和激活等[10]。

miR-1與血管重構(gòu)緊密相關，包括心臟發(fā)育、心律失常、缺血、心肌梗死和心肌肥大等[7]。有研究表明，miR-1在心臟發(fā)育過程中具有促進心肌細胞增殖和抑制凋亡作用[11]，在心肌肥大和慢性心肌梗死中miR-1表達較正常降低。有研究認為，高表達的miR-1可能通過調(diào)控細胞骨架調(diào)節(jié)蛋白MYLK3、CALM1和CALM2抑制心肌肥大[12-14]。本研究發(fā)現(xiàn)miR-1在ISO誘導的心肌損傷小鼠心臟中表達顯著降低，說明miR-1可能參與ISO誘導的心肌損傷。PNS治療能顯著提高miR-1表達，因此PNS可能通過調(diào)節(jié)miR-1的表達緩解ISO誘導的心肌損傷。

研究報道m(xù)iR-222具有抗血管生成作用，主要表現(xiàn)為抑制血管內(nèi)皮細胞遷移，損傷修復和微管形成[15]。內(nèi)皮祖細胞(EPC)作為血管內(nèi)皮細胞的前體細胞在血管損傷修復中有重要作用，研究表明在動脈粥樣硬化病人中miR-221/222水平與EPC數(shù)量呈負相關[16]。miR-222具有促進血管平滑肌細胞的增殖和遷移作用[17]。本研究表明，miR-222在ISO誘導的心肌損傷小鼠心臟中表達升高，而PNS治療顯著降低miR-222在心臟中表達，因此miR-222可能在ISO誘導產(chǎn)生心肌損傷和PNS抗心肌損傷中有重要作用。文獻報道m(xù)iR-1通過負向調(diào)控MET表達，抑制腫瘤細胞的增殖和遷移[18]。而MET在腫瘤細胞中激活miR-222表達，促進細胞浸潤和遷移[19]。既往研究表明PNS能顯著抑制腫瘤組織和腫瘤細胞中MET表達，且miR-222表達在PNS治療的腫瘤組織和細胞中顯著低于對照組[20]。

本研究發(fā)現(xiàn)miR-1和miR-222在ISO誘導心肌損傷心臟中較正常對照組差異表達，進一步研究發(fā)現(xiàn)MET在心肌組織中表達基本集中在損傷區(qū)域，在ISO誘導心肌損傷模型中表達顯著高于正常對照組，而PNS治療顯著降低MET在心肌組織中的表達。MET水平與miR-1表達呈負相關，與miR-222表達呈正相關。因此miR-1/MET/miR-222信號通路可能與PNS抗ISO誘導心肌損傷的分子機制有關。

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2017-05-21)

(本文編輯 薛妮)

Experimental Study on Panax notoginseng Saponins Attenuates Isoproterenol-induced Myocardial Injury

Yang Qinbo， Cui Jingang， Wang Peiwei， Ding Liliqiang， Chen Yu， Zhang Teng

Yueyang Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine， Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai 200437， China；Clinical Research Institute of Integrative Medicine，Shanghai Institute of Traditional Chinese Medicine， Shanghai， China

Chen Yu， Zhang Teng

Objective To investigate the effect of panax notoginseng saponins (PNS) on isoproterenal (ISO)-induced myocardial injury and explore the mechanism of PNS anti myocardial injury. Methods C57 mice were divided into vehicle control (VC) group， ISO induced myocardial injury (ISO) group，and PNS treatment (PNS) group.All mice were intraperitoneally injected vehicle control，ISO，ISO，and PNS separately for 7 days. Heart was utilized for HE stain and massion trichrome stain were performed in heart to access the therapeutic effect of PNS on ISO-induced myocardial injury.Further，real time-PCR was carried out to detect the expression of miR-1 and miR-222 in heart，and Met was probed in heart using immunohistochemical staining to discover the role of miR-1/MET/miR-222 in the anti-myocardial injury effect of PNS. Results The pathological staining showed that ISO induced myocardial injuries including necrotic degeneration，granulation as well as inflammatory cell infiltration，and collagen accumulation which was invariably observed in ISO challenged mice.Whereas，slight necrosis，sporadic infiltration of inflammatory cells and accumulation of collagen were observed in PNS treated mice.Down regulated expression of miR-1 and up regulated expression of miR-222 were demonstrated in heart from ISO induced myocardial injury mice compared to that from vehicle control mice.While expression of miR-1 and miR-222 were rescued in heart from PNS treated mice.The level of MET was increased in heart from ISO challenged mice and it focused in the area of injury.But the positive stain of MET in heart from PNS treated mice was significantly less than that from ISO challenged mice. Conclusion PNS has a dominantly therapic effect on ISO induced myocardial injury. MiR-1/MET/miR-222 axis may play an important role in the pathological process of myocardial injury induced by ISO and anti-myocardial injury effect of PNS.

myocardial injury；panax notoginseng saponins；microRNA；isoproterenal

R542.2 R256.2

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.20.006

1672-1349(2017)20-2534-06

上海市優(yōu)秀學術帶頭人資助項目(No.1XD1403500)；國家自然基金面上項目(No.81273960，No.81473732)；國家自然基金青年項目(No.81400313)；上海市東方學者跟蹤計劃(No.GZ2015011)；上海市高校特聘教授(東方學者)人才計劃(No.滬201188)

1.上海中醫(yī)藥大學附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院(上海 200437)；2.上海市中醫(yī)藥研究院中西醫(yī)結(jié)合臨床研究所

陳瑜，E-mail：chenyu6633@hotmail.com；張騰，E-mail：zhangteng501@hotmail.com

信息：楊琴波，崔金剛，王培偉，等.三七總皂苷防治異丙腎上腺素誘導的心肌損傷實驗研究[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2017，15(20)：2534-2539.