陳文，陳珍，楊光提，黃遠強

（湖南省瀏陽市畜牧獸醫(yī)水產(chǎn)局，湖南瀏陽410300）

L-茶氨酸對H2O2損傷的瘤胃上皮細胞活性的影響

陳文，陳珍，楊光提，黃遠強

（湖南省瀏陽市畜牧獸醫(yī)水產(chǎn)局，湖南瀏陽410300）

以體外分離培養(yǎng)的60日齡湘東黑山羊瘤胃上皮細胞作為試驗材料，利用H202構(gòu)建損傷模型，通過分別添加4、8、12和16mmol/L的L-茶氨酸溶液，來測定L-茶氨酸對瘤胃上皮細胞活性的影響。結(jié)果表明：L-茶氨酸的濃度在8～16mmol/L時能夠顯著增加的瘤胃上皮細胞的活性(P＜0.05)，并且隨著添加濃度的增加其活性增加，且在24h時處理效果較好。由此可知，L-茶氨酸對H202損傷的湘東黑山羊瘤胃上皮細胞具有一定的保護作用。

L-茶氨酸；瘤胃上皮細胞；細胞活性

胃腸道的氧化應激主要是由兩種應激通過產(chǎn)生自由基引起的，包括急性和慢性應激。長期應激會對動物機體造成很大的損傷，產(chǎn)生的自由基會造成特定維生素和微量元素的大量耗損，從而使畜禽的免疫力下降，進而造成機體的功能障礙甚至是誘發(fā)死亡[1]。研究表明，活性氧的產(chǎn)生能夠誘發(fā)多種類型的胃腸疾病[2]。并且H2O2是引起胃粘膜細胞氧化損傷的主要活性氧。

綠茶作為一種養(yǎng)生性飲品，隨著研究者對于其功能的逐步認知，目前已經(jīng)得到廣泛的關(guān)注[3]。天然的茶氨酸僅以游離的形式存在，并且主要是L型[4]。作為茶科植物中的主要活性成分，茶氨酸主要是借助氨基酸轉(zhuǎn)運系統(tǒng)來完成在組織和細胞內(nèi)的作用的，并且研究表明，茶氨酸對組織損傷具有一定的保護作用，例如腦組織[5-7]和肝組織[8-9]。

作為反芻動物特有的消化器官，瘤胃在反芻動物消化過程中起著決定性的作用。反芻動物能夠高效的利用高纖維的飼料原料，離不開瘤胃的功勞。反芻動物的瘤胃功能完善和健康，能夠保證反芻動物的正常生理活動。本試驗借助構(gòu)建的離體氧化損傷模型，通過添加不同濃度梯度的L-茶氨酸來分析其對湘東黑山羊瘤胃上皮細胞活性的影響，為更加全面的了解L-茶氨酸對瘤胃上皮受損的保護作用，探索其作用機制提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗儀器

分光光度計(BIO RAD680,美國)，二氧化碳培養(yǎng)箱（SELECTA，西班牙），倒置相差顯微鏡（Ol ympus，日本），高壓蒸汽滅菌鍋（SANYO，日本），超凈工作臺（SANYO，日本），水平搖床(哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司，H ZS-H)，鼓風干燥箱（上海申賢恒溫設(shè)備廠）

1.2 試驗試劑

胎牛血清（Cel l m ax）、基本培養(yǎng)基（Dul becco’s m odi f i ed eagl e m edi um∶nut ri ent m i xt ure F-12,DM EM/F12）、0.25%Trypsi n+0.02%EDTA、磷酸鹽緩沖溶液（PBS）、青霉素均購自（Gi bco,美國）；兩性霉素B+慶大霉素（Gent am i ci n/am phot eri ci n Sol ut i on）購自 Therm o Fi shersci ent i f i c（R-015-10,10×1m L，美國）；L- 茶氨酸（L-t heani ne,CAS∶3081-61-6,純度≥99%,H PLC）；3-（4,5- 噻唑 -2）-2,5- 二苯基四氮唑溴鹽（M TT）、二甲基亞砜（DM SO）購自美國Si gm a公司。

1.3 細胞培養(yǎng)

試驗選擇4只60日齡（體重為8.2±0.8 kg）健康的湘東黑山羊。采用頸靜脈放血的方法，待山羊死亡后即刻采取瘤胃組織，沖洗并棄內(nèi)容物，后用生理鹽水反復沖洗，干凈后進行取樣。對瘤胃上皮進行鈍性剝離，浸泡于4℃含10倍雙抗、5倍慶大霉素的DM EM-F12培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)移至細胞培養(yǎng)室；組織用含5倍雙抗的PBS液清洗3～5次；將組織盡量剪碎，加入0.25%胰酶消化液；37℃空氣浴振蕩消化，收集酶解液，加入適量完全培養(yǎng)基重懸細胞，依次經(jīng)100μm孔徑篩網(wǎng)過濾，收集濾液，1000 r/m i n離心5 m i n，去上清，將細胞重懸于DM EM/F12完全培養(yǎng)液中，并調(diào)整細胞濃度為1×106/m L，置于CO2培養(yǎng)箱，37℃，5%CO2培養(yǎng)。

1.4 試驗方法

1.4.1 條件培養(yǎng)液的配制

將L-茶氨酸在完全培養(yǎng)基中進行充分溶解，使其終濃度達到32m m ol/L的濃縮液。處理時用完全培養(yǎng)基進行稀釋，使最終的工作液分別為4m m ol/L、8m m ol/L、12m m ol/L、16m m ol/L 各 20m L。保存在4℃冰箱中備用。

1.4.2 細胞的分組及處理

當細胞密度達到80%～90%時，進行換液，用PBS對貼壁細胞進行沖洗，重復一次，加入1m L的胰蛋白酶消化細胞，放入恒溫恒濕的CO2培養(yǎng)箱中消化4 m i n。倒置顯微鏡下觀察，當所有細胞變亮、變圓且有部分細胞漂浮時，迅速用完全培養(yǎng)基終止消化。輕輕吹打細胞，使其形成細胞懸液，吸取懸液進行離心1000 r/m i n 5 m i n，保留底部沉淀。隨后用完全培養(yǎng)基使細胞重懸，相同比例接種在兩個培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)箱中放置1h，隨后重吸細胞懸液，轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，重復接種過程一次，進一步純化[10]。純化后細胞可備用于試驗處理，待細胞密度達到60%～70%時，分為6組，每組6個重復，分為對照組添加0、Ⅰ組 800 μm ol/L H2O2、Ⅱ組4m m ol/L L-茶氨酸+800 μm ol/L H2O2、Ⅲ組8m m ol/L L- 茶 氨 酸 +800 μm ol/L H2O2、 Ⅳ 組12m m ol/L L-茶氨酸 +800 μm ol/L H2O2和Ⅴ組16m m ol/L L-茶氨酸+800 μm ol/L H2O2，分別處理12、24、48h，隨后PBS沖洗三遍,將M TT加入試驗處理組各孔,并在培養(yǎng)箱中孵育4h,吸取上清液。后向每孔種添加150 μL DM SO,水平搖床中振蕩10 m i n,570 nm波長測定其各孔的吸光度值。

2 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 21軟件進行分析，統(tǒng)計方法采用LSD法，對各水平間數(shù)據(jù)進行多重比較，試驗結(jié)果以均值±標準誤的形式進行呈現(xiàn)。

3 結(jié)果

3.1 不同濃度L-茶氨酸對H2O2誘導的受損瘤胃上皮細胞存活率的影響

本試驗的研究目的，主要是圍繞L-茶氨酸的保護機制來探索，探究其對受損瘤胃上皮細胞活性的影響。試驗首先采用不同濃度水平(4、8、12、16m m ol/L)的L-茶氨酸來處理細胞，孵育1h后與H2O2(0.8 m m ol/L)共同培養(yǎng)24h。試驗結(jié)果（圖1）表明：瘤胃上皮細胞的活性對于H2O2的刺激很敏感(P＜0.01)。H2O2對細胞的損傷作用，只有在L-茶氨酸濃度不低于8m m ol/L的情況下才得到改善。當L-茶氨酸的孵育濃度達到8、12和16 m m ol/L時,其細胞活性分別為(62.43±8.21)%、(69.55±6.78)%、(76.44±7.42)%,與H 2O2單獨添加組比較,顯著增加 (P＜0.01)，由此可知，L-茶氨酸的濃度在8～16m m ol/L時能夠顯著改善受損的瘤胃上皮細胞的細胞活力。

圖1 不同L-茶氨酸水平下瘤胃上皮細胞活性

3.2 不同濃度L-茶氨酸不同作用時間下H2O2誘導的受損瘤胃上皮細胞的存活率

試驗結(jié)果如圖2所示，處理濃度相同的情況下，時間處理不同組的細胞活性各組間差異不顯著(P＞0.05)，然而與12h和48h處理組相比，24h處理組的細胞具有更好的活性，由此說明對于H2O2誘導的受損瘤胃上皮細胞，在L-茶氨酸處理24h時對細胞的保護性最強。

圖2 不同濃度茶氨酸不同處理時間瘤胃上皮細胞活性

4 討論

高濃度的活性氧能夠作用于瘤胃上皮細胞，使相關(guān)疾病惡化，甚至是誘導細胞發(fā)生凋亡。作為引起細胞損傷的關(guān)鍵因素，氧化自由基的產(chǎn)生因素有很多，例如缺血再灌注、藥物代謝，以及一些重金屬引起的中毒[11]。氧化自由基的種類有很多，H2O2在占了很大的比例，也是目前研究最為廣泛的自由基之一[12]。H2O2可導致細胞損傷的機制涉及的范圍比較廣，不僅會對通過作用線粒體和DNA來起到損傷作用，而且還可以對細胞內(nèi)的蛋白和脂質(zhì)進行氧化，同時消耗大量的ATP，對細胞造成損傷，甚至是誘導細胞發(fā)生凋亡[13]。

作為綠茶中天然存在的氨基酸，L-茶氨酸主要起著呈味的作用，并且已經(jīng)廣泛應用在食品行業(yè)。研究表明，L-茶氨酸不僅能夠抗氧化，還能幫助神經(jīng)細胞抵御外界的各種刺激[14]。目前對于茶氨酸對氧化應激誘導的受損瘤胃上皮細胞是否起作用，還鮮有文獻報道。因為L-茶氨酸是由谷氨酰胺衍生而得的，在代謝過程中可以轉(zhuǎn)化成谷氨酸，進而參加谷胱甘肽（GSH）的合成。除此之外，L-茶氨酸可以保護細胞內(nèi)的抗氧化酶，減少GSH損耗的同時還能生成GSH，以維持細胞內(nèi)GSH的穩(wěn)態(tài)，保證細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的正常運轉(zhuǎn)，免受氧化應激造成的應激損傷[15]。

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S852.32

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1006-4907（2017）05-0041-03

10.3969/j.issn.1006-4907.2017.05.019

2017-09-19