王秀杰,王維奇,李 軍,李 蕓,張彥灼,孫藝齊,王思宇,卞 偉

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異養(yǎng)硝化菌sp.的分離鑒定及其脫氮特性

王秀杰,王維奇,李 軍*,李 蕓,張彥灼,孫藝齊,王思宇,卞 偉

(北京工業(yè)大學建筑工程學院,北京100124)

從北京市高碑店污水處理廠BBR(Bacillus Bacteria Bioreactor)中試設備的活性污泥樣品中分離得到一株異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌株JQ1004,利用16S rDNA對其進行同源性分析,初步鑒定其為不動桿菌屬(sp.).在好氧條件下,以丁二酸鈉為碳源,分別以氨氮和硝酸鹽氮為氮源,研究其脫氮特性,發(fā)現(xiàn)該菌株在33h時氨氮去除率達到99.45%,COD去除率達到92.54%;在34h時,硝酸鹽氮去除率達到84.42%,而COD去除率達到93.11%.另外通過研究發(fā)現(xiàn),與降解氨氮相比,菌株JQ1004在降解硝酸鹽氮時需要更高的C/N.利用Compertz模型對其脫氮特性進行擬合發(fā)現(xiàn),菌株對氨氮的最大降解速率明顯高于降解硝酸鹽氮的最大降解速率,分別為m=7.93mg/(L·h)和m=4.08mg/(L·h).利用響應面法進行實驗設計,優(yōu)化其脫氮條件,得到最佳脫氮條件為:pH=7.33;溫度=31.80℃;轉速=154.54r/min;C/N=7.76.

不動桿菌屬；異養(yǎng)硝化-好氧反硝化；響應面；動力學

目前,生物脫氮工藝主要依賴于傳統(tǒng)硝化和反硝化過程,即硝化菌在好氧條件下將氨氮轉化為亞硝酸鹽氮和硝酸鹽氮,再依靠反硝化菌在缺氧條件下將亞硝酸鹽氮和硝酸鹽氮轉化為N2O、NO或N2[1].硝化菌為自養(yǎng)菌,有機碳會抑制其生長[2],然而反硝化菌為異養(yǎng)菌,其生長代謝依賴于有機碳;另外,硝化菌降解氨氮時依賴于溶解氧,而溶解氧又會對反硝化菌產生抑制[3].由于有機碳和溶解氧的限制,使得硝化過程和反硝化過程必須分別在好氧池和厭氧池內進行,這就使得污水廠基建費用大大增加.另外,由于硝化菌為自養(yǎng)菌,世代周期長,生長易受外界環(huán)境影響,導致傳統(tǒng)生物脫氮工藝抗沖擊負荷能力差、水力停留時間長、能耗大等缺點[4].為了克服這些不足,近年來越來越多新型生物脫氮工藝被研究利用,包括短程硝化、好氧反硝化、厭氧氨氧化以及它們的組合工藝[5].

繼Verstraete等[6]在1972年從自然界中分離出了第一株異養(yǎng)硝化菌sp.之后, Robertson等在1983年從活性污泥中分離出了一株同時具有異養(yǎng)硝化和好氧反硝化功能的脫氮菌(現(xiàn)更名為)[7].到目前為止越來越多異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌被分離出來,如No.4[8]、Y-11[9]、YB[10]、A1[11]、CPZ24[12]等.這些異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌與傳統(tǒng)硝化菌相比,世代周期短,且對環(huán)境有更強的適應性.另外,這類菌株可以實現(xiàn)同步脫氮除碳,利用有機碳在同一好氧階段將氨氮轉化為氣態(tài)氮排放到大氣中,并且能夠利用多種不同氮源進行生長代謝.異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌的這些優(yōu)點使得在同一反應器內實現(xiàn)同步硝化反硝化(SND)成為可能.

為探究異養(yǎng)硝化好氧反硝化菌的脫氮特性及降解動力學特性,本研究通過建立Compertz模型,對一株從活性污泥樣品中分離出的異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌株JQ1004的脫氮特性進行模擬,同時利用響應面法對其脫氮特性進行優(yōu)化,以期為異養(yǎng)硝化好氧反硝化菌在生物添加領域的應用提供新的菌源.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

菌株分離自北京市高碑店污水處理廠BBR(Bacillus Bacteria Bioreactor)中試設備活性污泥. BBR設備將生物膜法(生物轉盤主體)和活性污泥法(4個連續(xù)曝氣池)集于一體(設備流程如圖1所示),在設備運行期間定期添加活化后芽孢桿菌生物菌劑,設備進水氨氮濃度為50~ 60mg/L,COD濃度為200~300mg/L,經過2個月的啟動維護,設備實現(xiàn)了穩(wěn)定同步脫氮除碳.氨氮和COD去除率穩(wěn)定保持在95%及以上,TN去除率達到80%.

圖1 BBR設備工藝流程

1.2 培養(yǎng)基

異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基(g/L):0.47 (NH4)2SO4,4.219 (CH2COONa)2·6H2O,50mL維氏鹽溶液,C/N=7.5.

反硝化培養(yǎng)基(g/L):0.72KNO3,4.219 (CH2COONa)2·6H2O,50mL維氏鹽溶液,C/N=7.5.

維氏鹽溶液(g/L):6.55K2HPO4·3H2O, 2.5MgSO4·7H2O,2.5NaCl,0.038MnSO4·H2O,0.05 FeSO4·7H2O.

LB培養(yǎng)基(g/L):10.00 胰蛋白胨,5.00 酵母提取物,10.00NaCl.

以上培養(yǎng)基中C/N指培養(yǎng)基中TC/TN (/).培養(yǎng)基在使用前用Na2HPO4和NaH2PO4緩沖溶液調整pH=7.0~7.1,121℃高壓蒸汽滅菌15min.平板培養(yǎng)基需加入1.5%~2%瓊脂粉.

1.3 菌株的分離與鑒定

1.3.1 菌株的篩分 取10mL活性污泥于90mL0.9%生理鹽水中,用玻璃珠將泥樣充分打散,使細菌呈單細胞狀態(tài)懸浮于溶液中.采用梯度稀釋法將菌液稀釋.將各梯度稀釋液涂布到異養(yǎng)硝化固體培養(yǎng)基上,于30℃培養(yǎng)2~3d.等菌落長出后,用接種環(huán)挑取單菌落接種于異養(yǎng)硝化液體培養(yǎng)基中.30℃、140r/min搖瓶培養(yǎng)24h后,測定氨氮、硝酸鹽氮、亞硝酸鹽氮濃度變化,進而挑選出具有顯著氨氮去除效果的菌株進行復篩.最終篩選出脫氮性能最好的菌株JQ1004.采用平板劃線法對最終篩選出菌株進行純化,反復劃線純化5~7代,直至形成均勻單菌落,且無異常菌落出現(xiàn).以上操作均在無菌環(huán)境中.菌株凍存于-80℃的40%甘油中.

1.3.2 菌株的16S rDNA鑒定 挑取茁壯單菌落接種于液體異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基中,30℃、140r/min搖床過夜培養(yǎng)12h.取菌液于12000r/min、4℃離心5min,獲得菌體.將菌體反復重懸于無菌水中洗滌3次.再次離心獲得菌體.加入400μL Buffer SCL裂解菌體,65℃水浴1h左右,中間每隔10min混勻1次,直至混合液變澄清.然后離心取上清液進行DNA提取.采用Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒(上海生工)提取基因組DNA.將提取的DNA作為模板,采用針對細菌16S rRNA基因的通用引物對27f(5′-AGAGTTTGATCCTGGC- TCAG-3′)和1492r(5′-TACGGYTACCTTGTTA- CGACTT-3′)進行PCR擴增.將PCR產物送交上海生工進行測序,將測得的序列利用BLAST在線程序與Genbank中已有的模式菌株序列進行比對,并下載同源性較高的序列,利用MEGA5.0中的Neighbor-joining算法進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構建.

1.4 不同氮源條件下菌株JQ1004降解特性及動力學模型分析

將新鮮固體培養(yǎng)基上生長良好的單菌落接種于無菌水中并定容,制備成均勻菌懸液(0.5麥氏濁度)作為接種液.以下實驗均以此菌液作為接種液.分別以硫酸銨、硝酸鉀為唯一氮源,探究菌株在不同氮源情況下脫氮特性.C/N=7.5, pH= 7.0~7.1,培養(yǎng)條件為30℃,140r/min.定時取樣測定氨氮、亞硝酸鹽氮、硝酸鹽氮濃度,數據測定3次取平均值.

菌株JQ1004對不同氮素的降解動力學模型與Compertz 模型相似度較大可以通過修飾過的 Compertz 模型[13-15]來進行擬合:

式中:指某一時刻氮素濃度,mg/L;0指氮素初始濃度,mg/L;m指最大轉化速率,mg/(L·h);0指遲滯時間,h;指培養(yǎng)時間,h;e是數學常數.

1.5 響應面法優(yōu)化菌株的脫氮條件

表1 Box-Behnken實驗設計的變量及其水平值

1.6 測試分析與計算方法

NH4+-N:納氏試劑分光光度法;NO2--N:N- (1-萘基)-乙二胺分光光度法;NO3--N:麝香草酚分光光度法;CODcr:重鉻酸鉀法;NH2OH:間接分光光度法;pH值、溫度: WTW/Multi3420便攜式測定儀.

平均氨氧化速率計算:

2 結果與討論

2.1 菌株的分離與鑒定

圖2 菌株JQ1004在固體培養(yǎng)基上的形態(tài)

利用梯度稀釋法和平板劃線法一共篩分得到24株具有異養(yǎng)硝化-好氧反硝化功能的菌株.將全部菌株分別接種于液體異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基中進行搖瓶實驗,驗證得到一株脫氮效果最好的菌株,命名為JQ1004.菌株JQ1004在異養(yǎng)硝化固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h后,如圖2所示菌落呈白色,凸起,邊緣整齊,表面光滑濕潤,黏稠不易挑取.

提取該菌株DNA,并利用通用引物對27F/1492R經PCR擴增后得到長度為1400bp基因片段,將該片段利用BLAST在線程序與Genbank中已有的模式菌株序列進行比對后發(fā)現(xiàn),菌株JQ1004與An17同源性在98%以上,結合菌株形態(tài)可以初步鑒定JQ1004為不動桿菌.利用MEGA 5.0中的Neighbor- joining 算法對菌株JQ1004與一些已經發(fā)現(xiàn)的異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌以及其他不動桿菌進行系統(tǒng)發(fā)育樹構建,得到菌株JQ1004系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3),進一步證明JQ1004為不動桿菌屬(sp.),命名為sp. JQ1004.

圖3 菌株JQ1004系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 不同氮源條件下菌株JQ1004降解特性及動力學模型分析

2.2.1 菌株JQ1004對不同氮素降解特性 以氨氮為唯一氮源,菌株脫氮特性如圖4(A)所示.菌株在經歷2~3h遲滯期后開始迅速生長,此時氨氮和有機碳被大量降解,氨氮氧化速率在此階段達到最大值.在24h時,OD600達到最大并進入穩(wěn)定期.在33h,氨氮去除率達到99.45%,COD去除率達到92.54%.Chen等[12]報道,sp. CPZ24在初始氨氮濃度為50mg/L條件下,氨氮去除率在20h內可完全去除,而在相同條件下,硝酸鹽氮去除率為67%.當培養(yǎng)基中不添加有機碳源時,菌株JQ1004無法生長,只有外加有機碳源時,氨氮才能夠被降解利用,這表明菌株JQ1004為異養(yǎng)硝化菌.由圖4(A)可知,在對數期時,菌株快速繁殖,氨氮與有機碳被大量降解,這表明菌株能夠在好氧條件下(140r/min),實現(xiàn)同步脫氮除碳.在整個氨氧化過程中,只檢測到少量的硝酸鹽氮積累,而未檢測到亞硝酸鹽氮和羥胺積累,這是由于在氨氮被氧化過程中,亞硝酸鹽氮和羥胺等中間產物被迅速轉化而未產生積累[18].

由圖4(B)可知,在好氧條件下菌株JQ1004能夠以硝酸鹽氮為氮源進行反硝化,這表明菌株JQ1004不僅具有異養(yǎng)硝化功能,還具有好氧反硝化功能,這與大部分已分離的異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌株如sp. HA2[19]、sp.Y16[20]、YB[10]等脫氮特性一致,即在好氧條件下能夠以氨氮和硝酸鹽氮為唯一氮源進行新陳代謝;而另一類異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌株,如No.4[8],HNR[21],NR[22]等,分別以氨氮、硝酸鹽氮、亞硝酸鹽氮和羥胺為唯一氮源研究其脫氮途徑時發(fā)現(xiàn),該類菌株不能夠利用亞硝酸鹽氮和硝酸鹽氮進行反硝化,只能利用氨氮和羥胺進行代謝.此兩類異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌株的脫氮途徑還未有統(tǒng)一定論,仍需進一步的研究.由圖4(B)可知,在經過5h的遲滯期之后,菌株JQ1004進入對數期,在這一時期菌株迅速生長繁殖,OD值迅速上升,硝酸鹽氮和有機碳被大量降解.直到34h左右,菌株生長進入穩(wěn)定期,在此時刻之后OD值穩(wěn)定在1.1左右,不再大幅度上升.此時硝酸鹽氮去除率僅達到84.42%,而COD去除率達到93.11%.分析可能的原因是在氮素初始濃度相同條件下,菌株JQ1004降解硝酸鹽氮比降解氨氮需要更高的C/N比,由于碳源不足,在反應過程的后期,C/N不能夠滿足菌株新陳代謝的需要,從而限制了菌株的生長.

2.2.2 菌株JQ1004對不同氮素降解動力學模型構建及分析 實驗表明,溫度、pH值等對菌株JQ1004降解不同氮素具有顯著影響.菌株對氨氮和硝酸鹽氮的降解情況隨時間的變化,采用修飾過Compertz模型進行擬合.

菌株JQ1004對不同氮素降解動態(tài)擬合曲線見圖5.從圖5中可以看出,修飾過的Compertz模型很好地描述了菌株降解不同氮素隨時間的變化情況,由表2可知氨氮和硝酸鹽氮擬合曲線的相關系數2分別為0.997和0.985.

圖5 菌株JQ1004對不同氮素降解動態(tài)擬合曲線

表2 菌株JQ1004降解不同氮素動力學參數

從Compertz模型擬合后(圖5)可以看出,菌株JQ1004在降解氨氮與硝酸鹽氮時均存在遲滯期,且降解硝酸鹽氮的遲滯期(12.74h)明顯長于降解氨氮的遲滯期(5.91h).在相同條件下,氨氮平均降解速率明顯大于硝酸鹽氮平均降解速率,氨氮在6~24h被迅速降解,且在這一時間段內降解速率達到最大(m=7.93mg/(L·h));而硝酸鹽氮在經過12.74h的遲滯期后,進入快速降解期,在13~35h硝酸鹽氮降解速率達到最大值m= 4.08mg/(L·h).Ren等[10]通過研究YB在不同C/N條件下氨氮去除效果,發(fā)現(xiàn)氨氮最大去除率在4.04~10.09mg/(L·h)之間.分析這種脫氮特性的原因,一方面可能是該菌株降解氨氮和硝酸鹽氮的代謝途徑不同,經前期研究發(fā)現(xiàn),異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌可能存在兩條脫氮途徑,一種是與傳統(tǒng)脫氮途徑相同,即NH4+-N→ NO2--N→NO3--N→NO2--N→NO→N2O→N2,另一條是NH4+-N→NH2OH→NO→N2O→N2,推測當氨氮為氮源時,菌株JQ1004脫氮途徑以第二條脫氮途徑為主,以硝酸鹽氮為氮源時以NO3-- N→NO2--N→NO→N2O→N2為主;另一方面可能是氨氧化過程中酶的活性要高于好氧反硝化過程中酶的活性[18].

2.3 響應面法優(yōu)化菌株JQ1004的脫氮條件

參考前期相關文獻,確定出pH值、溫度、轉速、C/N為顯著影響異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌株脫氮性能的環(huán)境因素.通過單因素實驗確定出各環(huán)境因子的最佳范圍,以30h內平均氨氮氧化速率為響應值,利用Box-Behnken法的中心組合試驗設計原理設計四因素三水平的實驗組合.各組實驗響應值如表3所示.

利用Design Expert對各組實驗數據進行擬合和方差分析,得到響應值與各因素編碼值之間的函數關系式如下:

=3.06+0.39+0.39+0.30+0.015+0.033-

0.055-0.020+0.12-0.028+

0.15-0.542-0.672-0.252-0.212

式中:表示氨氧化速率,、、、分別表示pH值、溫度、轉速、C/N.

表3 實驗設計和響應值

對擬合模型進行方差分析(ANOVA),結果如表4.

由表4可知,該模型值<0.0001,表明擬合得到的方程極為顯著,模型在整個被研究的回歸區(qū)域內擬合性很好.模型失擬項(Lack of Fit)用來表示所用模型與實驗值的擬合程度,即二者的差異程度.該擬合模型中失擬項為0.5385>0.05,不顯著.表明無失擬因素存在,因此可用該回歸方程代替試驗真實點對實驗結果進行分析.同時結合圖6中平均氨氧化速率的實際值與模型預測值之間的擬合關系可知,實際值與預測值具有很好的擬合度,其中散點為實驗所得平均氨氧化速率,直線為預測值擬合直線.

表4 響應面結果的方差分析

注:*<0.05.

圖6 回歸模型平均氨氧化速率預測值與實際值的關系

另外,模型決定系數2=0.9957,表明99.57%的實驗數據可用該模型進行解釋,說明方程可靠性高且回歸有效.校正決定系數(Adj2=0.9913)和預測決定系數(Pred2=0.9801)差值為0.0112< 0.2,變異系數CV=2.23%<10%,說明實驗具有較高可信度和良好的穩(wěn)定性.該模型的信噪比為51.563,其值大于4,說明該模型具有足夠分辨力,能適應實驗結果[23].在統(tǒng)計學中,Cook距離表示某一條數據從回歸統(tǒng)計量和計算中排出后,由此造成的回歸系數變化有多大,通常認為D<1的數據為合理數據[24].由圖7可知,用于回歸分析的數據的D均小于1,不存在對二次多項式的系數產生明顯影響的數據.綜合以上分析,該模型可以用來分析和預測菌株JQ1004降解氨氮的最優(yōu)實驗條件.

根據表4中數據分析可知,各因素對氨氮降解速率的影響排序為:pH值>溫度>轉速>C/N.并且,pH()、溫度()、轉速()的值均小于0.0001,這表明它們對模型的影響極其顯著,即pH值、溫度、轉速是氨氮降解速率的重要影響因素.C/N()的值為0.3422,不顯著,這表明C/N對于菌株降解氨氮并沒有顯著影響,分析可能原因為C/N在滿足菌株JQ1004正常代謝要求后,氨氮降解速率隨C/N的改變不會產生大的變化.C/N在6.5以上時已經滿足了菌株降解氨氮的需求,故C/N已經不是影響氨氮降解的顯著因素.另外,由交互項系數的值可知,、的值均小于0.05,這表明溫度與轉速、轉速與C/N之間的交互作用明顯.

如圖8所示,由響應面圖和等高線圖中也可以看出各因素之間的交互作用,響應面圖中等高線形狀可直接反映出兩個因素間的交互作用強弱,等高線越接近圓形兩因素間的交互作用越弱,而越接近橢圓形兩因素間的交互作用越強[25].由圖8中(以和為例) pH()和C/N()的等高線圖呈圓形,說明之間的交互作用較弱;而pH()和溫度()的等高線圖明顯呈橢圓形,說明之間的交互作用明顯較強.另外,從各因素響應面3D圖中也可以直觀看出各因素之間具有明顯的交互作用,各因素之間并不是簡單的線性關系.同時可以明顯看出模型開口向下,表明實驗結果具有最大值,即響應值具有最優(yōu)條件的響應點.

圖7 回歸模型的Cook距離分布

圖8 pH值和溫度、pH值和C/N對平均氨氧化速率影響的響應面和等高線

對構建的模型進行偏導微分處理,得到菌株JQ1004最優(yōu)脫氮條件為pH=7.33;溫度=31.80℃;轉速=154.54r/min;C/N=7.76.此時,最大平均氨氧化速率預測值為3.31mg/(L·h).為驗證模型預測的準確性和有效性,在最優(yōu)條件下進行3組平行實驗,為實驗操作方便,將培養(yǎng)條件簡化為:pH= 7.4;溫度=32℃;轉速=155r/min;C/N=7.8得到平均氨氧化速率為3.17mg/(L·h),與預測值僅相差0.14mg/(L·h).這表明回歸方程比較準確的預測了各因素對菌株JQ1004脫氮特性的影響.

3 結論

3.1 從活性污泥中分離得到一株異養(yǎng)硝化菌JQ1004,結合菌株生理形態(tài)及16S rDNA同源性分析鑒定該菌株屬于不動桿菌屬(sp.).該菌株能夠在好氧條件下,以有機碳為碳源,分別利用氨氮和硝酸鹽氮進行代謝,且無明顯亞硝酸鹽氮積累.

3.2 Compertz模型能夠很好地擬合菌株對于不同氮素降解特性,從擬合曲線可知菌株在利用氨氮時比利用硝酸鹽氮有更短的遲滯期(分別為5.91h和12.74h)和更大的最大降解速率(分別達到m=7.93mg/(L·h)和m=4.08mg/(L·h)).另外研究結果還表明,菌株在降解硝酸鹽氮時比降解氨氮時需要更高的C/N.

3.3 通過響應面優(yōu)化設計實驗,確定該菌株脫氮最優(yōu)條件為:pH=7.33;溫度=31.80℃;轉速=154.54r/min;C/N=7.76,由驗證試驗結果可知, 回歸方程比較準確的預測了各因素對菌株JQ1004脫氮特性的影響.

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Isolation and identification of a heterotrophic nitrifier,sp., and its characteristics of nitrogen removal.

WANG Xiu-jie, WANG Wei-qi, LI Jun*, LI Yun, ZHANG Yan-zhuo, SUN Yi-qi, WANG Si-yu, BIAN Wei

(The College of Architecture and Civil Engineering, Beijing University of Technology, Beijing 100124, China)., 2017,37(11)：4241~4250

Heterotrophic bacterium, the strain JQ1004 exhibiting simultaneous nitrification and aerobic denitrification were isolated from activated sludge and identified asby 16S rDNA. This study was focused on the characteristics of nitrogen removal under aerobic condition bysp. JQ1004. Clearly, a significant decrease of ammonium and COD was observed by 33h, with 99.45% and 92.54% removal efficiency respectively while NH4+-N was used as sole N-source and sodium succinate was used as organic carbon source. Besides, while the strain utilized NO3--N as nitrogen source, the removal efficiency of NO3--N was 84.42% and total 93.11% of COD was decreased during 34h of incubation. It was interesting to note that higher C/N ratio was required in the degradation of nitrate than ammonium with the same initial concentration under aerobic conditions. Based on the description by modified Compertz model for the experimental data, it was found the isolate using ammonium as a sole nitrogen source showed higher rate of converting nitrogen than using nitrate, with 7.93mg/(L·h) and 4.08mg/(L·h) respectively. Response surface methodology (RSM) experiments proved that efficient nitrogen removal and growth of strain JQ1004occurred with succinate as the carbon source, pH 7.33, 31.80℃, and high C/N ratio of 7.76and dissolved oxygen (with shaking speed of 154.54r/min).

sp.；heterotrophic nitrification-aerobic denitrification；response surface methodology (RSM)；kinetics

X172

A

1000-6923(2017)11-4241-10

王秀杰(1991-),女,山東濰坊人,北京工業(yè)大學博士研究生,主要從事污水生物脫氮研究.發(fā)表論文1篇.

2017-03-29

水體污染控制與治理科技重大專項(2015ZX07202- 013);16人才培養(yǎng)質量建設-雙培養(yǎng)計劃新興專業(yè)建設(004000542216031)

* 責任作者, 教授, 18810925108@163.com