何瑾 許國榮 林涵 王檸 陳萬金

·神經系統(tǒng)遺傳性疾病·

目標區(qū)域捕獲測序檢測常染色體隱性遺傳性腓骨肌萎縮癥GDAP1基因突變

何瑾 許國榮 林涵 王檸 陳萬金

研究背景腓骨肌萎縮癥存在高度臨床和遺傳異質性，傳統(tǒng)基因檢測需對眾多候選基因逐一篩查，存在效率低、耗時、費力等局限性。本文旨在探討目標區(qū)域捕獲測序技術診斷常染色體隱性遺傳性腓骨肌萎縮癥的可行性。方法采集5例臨床擬診常染色體隱性遺傳性腓骨肌萎縮癥患者的臨床資料和外周血樣本，采用目標區(qū)域捕獲測序技術篩查腓骨肌萎縮癥相關基因突變，Sanger測序對候選變異位點在患者及其父母外周血樣本中進行驗證。結果目標區(qū)域捕獲測序顯示，2例檢出GDAP1基因復合雜合突變，余3例未檢出致病性突變。經Sanger測序證實2例患兒存在GDAP1基因突變，例1為GDAP1基因復合雜合突變c.767A＞G（p.His256Arg）和c.866T＞A（p.Phe289Tyr），其父攜帶c.866T＞A（p.Phe289Tyr）突變，其母攜帶c.767A＞G（p.His256Arg）突變；例2為GDAP1基因復合雜合突變c.571C＞T（p.Arg191X）和c.589delC（p.Asp198IlefsX8），其父攜帶c.589delC（p.Asp198IlefsX8）突變，其母攜帶c.571C ＞T（p.Arg191X）突變，最終明確診斷為常染色體隱性遺傳性腓骨肌萎縮癥。結論目標區(qū)域捕獲測序技術是一項高效基因檢測方法，適用于常染色體隱性遺傳性腓骨肌萎縮癥的基因診斷。

夏科?馬里?圖斯病； 基因，隱性； 突變； 系譜

腓骨肌萎縮癥（CMT）是臨床常見的遺傳性運動感覺周圍神經病，發(fā)病率約為1/2500［1］。主要臨床特點是青少年期隱匿起病，對稱性遠端肌無力、肌萎縮，伴感覺缺失，多為下肢遠端先于上肢受累，大腿下部肌肉1/3萎縮明顯，呈“鶴腿”樣改變，可以累及上肢和手部肌肉，多有家族史；部分有弓形足、錘狀趾、爪形手和脊柱側彎等表現，臨床異質性較強。遺傳模式多樣，包括常染色體顯性遺傳性腓骨肌萎縮癥、常染色體隱性遺傳性腓骨肌萎縮癥、X連鎖遺傳性腓骨肌萎縮癥和新發(fā)突變的散發(fā)病例，其中尤以常染色體顯性遺傳性腓骨肌萎縮癥常見，約占50%［2］。常染色體隱性遺傳性腓骨肌萎縮癥臨床表現與常染色體顯性遺傳相似，但前者癥狀較重，發(fā)病年齡較?。??4］。由于家系中同一種致病性突變引起的臨床表型不一，進行家系調查時有些家屬不配合致家系資料不完整，導致遺傳方式難以確定，同時，臨床同質性與異質性并存，肌電圖和組織病理學缺乏特異性，難以明確診斷。尤其是常染色體隱性遺傳性腓骨肌萎縮癥，只能依靠基因診斷。腓骨肌萎縮癥的致病基因眾多，自1992年PMP22基因克隆以來，已有70余種致病基因被克?。?］。由于腓骨肌萎縮癥遺傳異質性較強、致病基因較多，傳統(tǒng)基因檢測確定致病基因存在效率低、耗時長等缺點。近年來，高通量測序技術的發(fā)展克服傳統(tǒng)基因檢測的不足，其中，目標區(qū)域捕獲測序技術在單基因遺傳病致病性突變的檢測中獲得廣泛應用［6?10］。在本研究中，我們采用目標區(qū)域捕獲測序技術對臨床疑診常染色體隱性遺傳性腓骨肌萎縮癥家系進行相關基因快速高通量測序，并采用Sanger測序技術對基因突變的2例患兒及其家系成員進行驗證，最終獲得明確診斷。

對象與方法

一、研究對象

研究對象均來自2013年1月-2016年12月福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院臨床擬診的腓骨肌萎縮癥患者，共5例，男性4例，女性1例；年齡5～31歲，平均15歲；均符合2009年美國神經病學學會（AAN）、美國神經肌肉病和電生理診斷醫(yī)學協會（AANEM）及美國物理醫(yī)學與康復學會（AAPM&R）聯合公布的遠端對稱性周圍神經病診斷指南。5例患者父母（10例）均無肌無力和肌萎縮病史，否認近親婚配。選擇同期在我院行體格檢查的健康志愿者作為對照，共計100例，男性50例，女性50例；年齡為51～80歲，平均60歲。本研究經福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院道德倫理委員會審核批準，所有受試者及其家屬均知情同意并簽署知情同意書。

二、研究方法

1.一般資料收集 采集5例患者的家系資料、臨床病史，以及神經系統(tǒng)檢查、實驗室檢查和神經電生理學檢查結果。

2.標本收集與基因組DNA提取 采集5例患者及其父母外周靜脈血各2 ml，予乙二胺四乙酸（EDTA，美國BD公司）抗凝。采用QIAamp?DNA提取試劑盒（德國Qiagen公司）提取患者及其父母外周靜脈血基因組DNA，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。采用NanoDrop2000超微量分光光度計（美國Thermo Fisher Scientific公司）分別于260和280 nm波長處定量測定基因組DNA。

3.目標區(qū)域捕獲測序與數據分析 采用目標區(qū)域捕獲測序技術對5例患者進行基因檢測。具體步驟如下：采用NimbleGen SeqCap EZ Choice試劑盒（瑞士Roche公司）建立含目標基因的全基因組文庫，包括已知的79種遺傳性運動感覺周圍神經病相關基因，如 PMP22、MPZ、GJB1等；采用 Illumina HiSeq 2500測序儀（美國Illumina公司）在晶能生物技術（上海）有限公司完成高通量測序。所獲得的原始數據采用BWA軟件（http://bio?bwa.sourceforge.net）與h19人基因組數據庫（http://hgdownload.cse.ucsc.edu/）進行比對，變異位點經ANNOVAR軟件進行注釋。采用PolyPhen?2、SIFT和 Mutation Taster軟件對變異位點進行生物信息學分析。

4.Sanger測序 經目標區(qū)域捕獲測序篩選的候選變異位點采用Sanger測序進行驗證，同時在家系中進一步驗證，以及對正常對照者進行Sanger測序。具體操作步驟如下：（1）聚合酶鏈反應（PCR），PCR反應條件為94℃預變性3 min；94℃ 30 s、56℃ 45 s、72℃ 60 s，30個循環(huán)，72℃延伸5 min。（2）蝦堿酶（SAP）純化，于EP管中逐一加入ddH2O 1 μl、10 × ExonⅠ緩沖液 0.70 μl、ExonⅠ0.25 μl、蝦堿酶 0.05 μl、PCR 產物 5 μl，37 ℃溫浴 60 min，80 ℃水浴15 min。（3）測序，于EP管中加入經蝦堿酶純化的 PCR 產物 3 μl、Big Dye 1 μl、3.20 × 106pmol/L 單向引物1 μl，進行測序，反應條件為96℃ 1 min，96℃ 10 s、50℃ 5 s、60℃ 4 min，共25個循環(huán)。測序產物經乙醇純化后采用ABI 3730基因型分析儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）進行分離，采用Sequencing Analysis Software v6.0（美 國 Thermo Fisher Scientific公司）進行分析。

表1 5例臨床擬診腓骨肌萎縮癥患者臨床特征Table 1. Clinical manifestations of 5 patients primarily diagnosed as CMT

結 果

一、臨床特征

5例臨床擬診腓骨肌萎縮癥患者，發(fā)病年齡1～23歲，平均4歲；病程1～27歲，平均7年；臨床主要表現為遠端肌無力，腱反射減退或消失，4例表現為遠端肌萎縮和針刺覺減退，2例手足畸形，1例失聰；神經電生理學檢查均符合周圍神經損害。5例患者臨床特征參見表1。

二、目標區(qū)域捕獲測序

經目標區(qū)域捕獲測序，5例患者檢測出變異位點（包括錯義突變、無義突變和同義突變）3123～4007個，平均（3328.20±380.98）個；插入/缺失變異180～265個，平均（219.20±40.18）個；測序深度92.11～231.02×，平均（154.88±68.19）×，其中2例檢測出GDAP1基因復合雜合突變，余3例未檢測出該致病性突變。數據分析顯示，例1為GDAP1基因復合雜合突變c.767A＞G（p.His256Arg）和c.866T＞A（p.Phe289Tyr），例2為GDAP1基因復合雜合突變c.571 C ＞ T（p.Arg191X） 和 c.589delC（p.Asp198IlefsX8），其中，c.767A ＞ G（p.His256Arg）和c.571C＞T（p.Arg191X）為已知變異位點，而c.866T＞A（p.Phe289Tyr）和 c.589delC（p.Asp198IlefsX8）尚未見諸報道。采用PolyPhen?2、SIFT和Mutation Taster軟件顯示，c.866T＞A（p.Phe289Tyr）為致病性突變；c.589delC（p.Asp198IlefsX8）為缺失突變，可以導致其編碼蛋白為截短蛋白，經Mutation Taster預測軟件提示該變異位點亦為致病性突變。

三、Sanger測序

采用Sanger測序對2例GDAP1基因復合雜合突變患兒及其父母進行驗證，結果顯示，例1為GDAP1基因復合雜合突變c.767A＞G（p.His256Arg）和c.866T＞ A（p.Phe289Tyr，圖 1），其父攜帶雜合突變c.866T ＞A（p.Phe289Tyr），其 母 攜 帶 雜 合 突 變c.767A＞G（p.His256Arg）；例2為GDAP1基因復合雜合 突 變 c.571C ＞ T（p.Arg191X）和 c.589delC（p.Asp198IlefsX8，圖2），其父攜帶雜合突變c.589delC（p.Asp198IlefsX8），其母攜帶雜合突變c.571C＞T（p.Arg191X）。而在100例正常對照者中未檢測出GDAP1基因 c.866T＞A（p.Phe289Tyr）和 c.589delC（p.Asp198IlefsX8）突變。

經上述基因檢測證實例1和例2均存在GDAP1基因復合雜合突變，明確診斷為常染色體隱性遺傳性腓骨肌萎縮癥。

典型病例

圖1 例1 Sanger測序顯示，GDAP1基因存在復合雜合突變c.767A＞G（p.His256Arg，箭頭所示，上圖）和c.866T＞A（p.Phe289Tyr，箭頭所示，下圖）Figure 1 Sanger sequencing of Case 1 showed compound heterozygous mutation of GDAP1 gene c.767A＞G(p.His256Arg,arrow indicates,upper panel)and c.866T＞A(p.Phe289Tyr,arrow indicates,lower panel).

圖2 例2 Sanger測序顯示，GDAP1基因存在復合雜合突變c.571C＞T（p.Arg191X，箭頭所示，上圖）和c.589delC（p.Asp198IlefsX8，箭頭所示，下圖）Figure 2 Sanger sequencing of Case 2 showed compound heterozygous mutation of GDAP1 gene c.571C＞T(p.Arg191X,arrow indicates,upper panel)and c.589delC(p.Asp198IlefsX8,arrow indicates,lower panel).

例1 男性，5歲，主因雙下肢無力1年余，于2016年2月26日至我院神經內科門診就診?；純河?年前無明顯誘因出現雙下肢無力，主要表現為漸進性雙足下垂、行走不穩(wěn)、下樓梯困難，就診時佩戴踝部矯形器輔助行走，未見明顯四肢肌萎縮，無感覺異常。患兒足月順產，單胎，生長發(fā)育和智力發(fā)育正常，15個月時可獨立行走。父母身體健康，無相似臨床癥狀，否認近親婚配。門診神經系統(tǒng)檢查：神志清楚，語言流利，腦神經檢查未見明顯異常；頸屈肌肌力正常，雙上肢肌力5級，雙側股四頭肌肌力5級，足背伸肌力左側1級、右側2級，雙側跖屈肌肌力4級，四肢肌張力均正常；雙側弓形足，跨閾步態(tài)；針刺覺和深感覺正常，四肢腱反射減退，病理反射未引出。實驗室檢查：血清肌酸激酶（CK）于正常值范圍。電生理學檢查：神經傳導速度（NCV）顯示四肢運動神經傳導速度（MNCV）正常；腓腸神經感覺神經傳導速度（SNCV）降低（左側35 m/s、右側33 m/s），余正常。針極肌電圖顯示，四肢復合肌肉動作電位（CMAP）波幅降低（正中神經1.40 mV），部分復合肌肉動作單位電位時相增寬、波幅升高、募集相減少?；驒z測顯示，GDAP1基因存在復合雜合突變c.767A ＞G（p.His256Arg）和c.866T＞A（p.Phe289Tyr），最終明確診斷為常染色體隱性遺傳性腓骨肌萎縮癥。未予藥物治療，囑患者至康復科進行康復訓練，未隨訪。

例2 男性，15歲，主因四肢無力15年、肌萎縮10余年，于2013年8月29日至我院神經內科門診就診?；純鹤猿錾蟛痪眉闯霈F四肢活動較正常同齡兒童差，3歲時方可獨立行走，5歲時出現四肢遠端肌萎縮，表現為足下垂、爪形手。患兒足月順產，單胎，生長發(fā)育和智力發(fā)育正常。父母身體健康，無相似臨床癥狀，否認近親婚配。門診體格檢查：四肢近端和遠端明顯肌萎縮，不能行走，需坐輪椅。神經系統(tǒng)檢查：神志清楚，語言流利，腦神經檢查未見異常；頸屈肌肌力4級，雙側三角肌、肱二頭肌肌力4級，雙手骨間肌肌力1級，雙側股四頭肌肌力2+級，雙側足背伸、跖屈肌肌力1級，四肢肌張力均降低；雙側馬蹄內翻足；針刺覺和深感覺正常，四肢腱反射消失，病理反射未引出。實驗室檢查血清肌酸激酶于正常值范圍。電生理學檢查：左側尺神經、雙側正中神經、腓總神經和脛神經運動神經傳導未引出波形，右側尺神經運動神經傳導速度減慢（肘上28.80 m/s、肘下30.60 m/s），復合肌肉動作電位波幅下降（肘上和肘下均0.50 mV）；雙側正中神經、腓淺神經和腓腸神經感覺神經傳導未引出波形，雙側正中神經感覺神經傳導速度減慢（左側25.00 m/s、右側30.90 m/s），復合肌肉動作電位波幅下降（左側1.90 μV、右側1.50 μV）。針極肌電圖顯示，右側脛前肌、股四頭肌、肱二頭肌、小指展肌纖顫、正銳電位；輕收縮時右側肱二頭肌動作單位電位時相增寬，呈多相波，余肌肉未引出動作單位電位?；驒z測顯示，GDAP1基因存在復合雜合突變c.571C ＞ T（p.Arg191X） 和 c.589delC （p.Asp198IlefsX8）。最終明確診斷為常染色體隱性遺傳性腓骨肌萎縮癥。未予藥物治療，囑患者至康復科進行康復訓練，未隨訪。

討 論

腓骨肌萎縮癥具有高度臨床異質性和遺傳異質性，其診斷主要依靠臨床表現、神經電生理學檢查和基因診斷。臨床表現主要為青少年期發(fā)病，四肢遠端無力和肌萎縮，腱反射減退或消失；神經電生理學表現為運動和感覺神經均受累，應注意與慢性炎性脫髓鞘性多發(fā)性神經根神經?。–IDP）、遺傳性壓力敏感性周圍神經病（HNPP）等相鑒別，特別是缺乏家族史的常染色體隱性遺傳性腓骨肌萎縮癥和新發(fā)突變患者。臨床診斷腓骨肌萎縮癥僅依靠臨床表現和神經電生理學檢查結果可能造成漏診或誤診，基因檢測是其診斷關鍵。

腓骨肌萎縮癥致病基因多達70余種，約80%常染色體顯性遺傳性腓骨肌萎縮癥系PMP22、MPZ、GJB1、MFN2基因突變所致，根據臨床表現和神經電生理學檢查，采用傳統(tǒng)基因檢測方法即可篩查出上述常見致病基因［2，11］；常染色體隱性遺傳性腓骨肌萎縮癥由于致病基因較多且每種基因發(fā)生率較低，故傳統(tǒng)基因檢測具有一定局限性［3］。近年迅速發(fā)展的目標區(qū)域捕獲測序技術可以將腓骨肌萎縮癥相關致病基因富集于一個檢測芯片中，實現對所有腓骨肌萎縮癥相關致病基因的快速高通量測序［6?11］。本研究采用目標區(qū)域捕獲測序技術對5例臨床擬診腓骨肌萎縮癥患者及其家系進行篩查，明確2例患兒致病基因為GDAP1基因。

常染色體隱性遺傳性腓骨肌萎縮癥根據神經傳導速度可分為脫髓鞘型（CMT1型）和軸索型（CMT2型），正中神經神經傳導速度＞38 m/s為CMT1型，致病基因為GDAP1、MTMR2、SBF1、SBF2、SH3TC2、NDRG1、EGR2、PRX、HK1、FGD4、FIG4、SURF1基因；正中神經神經傳導速度＜38 m/s為CMT2 型 ，致 病 基 因 為 LMNA、MED25、NEFL、HSBP1、GDAP1、LRSAM1、MFN2、HINT1 基因［3，12］，其中，GDAP1基因為常染色體隱性遺傳性腓骨肌萎縮癥最常見致病基因。有文獻報道，西班牙腓骨肌萎縮癥患者GDAP1基因突變率約為11.5%［11］。GDAP1基因突變導致的周圍神經損害較為復雜，兼有脫髓鞘型（CMT1A型）以及軸索型（CMT2H型和CMT2K 型）［3，12］，發(fā)病年齡較小，CMT1 型發(fā)病年齡 ＜2歲，CMT2型發(fā)病年齡＜10歲且周圍神經損害癥狀更嚴重；部分伴其他系統(tǒng)損害，如CMT1A型伴聲帶和膈肌麻痹，CMT2H型伴錐體束征和聲帶異常，CMT2K型伴聲帶麻痹和骨骼畸形［3，12］。本研究經基因檢測證實2例患兒為GDAP1基因突變致常染色體隱性遺傳性腓骨肌萎縮癥，根據神經電生理學檢查結果，例1符合CMT2K型，例2符合CMT1A型，均為早發(fā)型腓骨肌萎縮癥，發(fā)病年齡與文獻報道相符［3］，但未伴除周圍神經系統(tǒng)外的其他系統(tǒng)損害。

目標區(qū)域捕獲測序技術作為一種高通量測序方法，可以同時檢測數百至數千種基因突變情況，較傳統(tǒng)Sanger測序技術省時、省力，既提高基因檢測效率，且檢測費用較全外顯子測序（WES）和全基因組測序（WGS）低。因此，目標區(qū)域捕獲測序技術是一種簡便、高效、可靠的基因檢測方法，適用于單基因遺傳病的臨床診斷，可以作為常染色體隱性遺傳性腓骨肌萎縮癥基因診斷的有力輔助工具，具有較高的臨床價值。

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Target region capture sequencing for detecting GDAP1 gene mutation of autosomal recessive Charcot?Marie?Tooth disease

HE Jin,XU Guo?rong,LIN Han,WANG Ning,CHEN Wan?jin
Department of Neurology,the First Affiliated Hospital of Fujian Medical University,Fuzhou 350005,Fujian,China
Corresponding author:CHEN Wan?jin(Email:wanjinchen75@fjmu.edu.cn)

BackgroundOwing to the clinical variability and molecular heterogeneity,the traditional Sanger sequencing takes time and effort and is inefficient.In this paper,target region capture sequencing in the diagnosing of autosomal recessive Charcot?Marie?Tooth disease(AR?CMT)is explored.MethodsClinical data and peripheral blood sample of 5 clinically suspected AR?CMT patients were collected.Charcot?Marie?Tooth disease(CMT)related gene mutation were detected by target region capture sequencing.The candidate variants were confirmed in the peripheral blood sample of the patients and their parents by Sanger sequencing.ResultsTarget region capture sequencing revealed that compound heterozygous mutations of GDAP1 gene was found in 2 patients,and was not seen in the other 3 patients.Sangersequencing revealed thatamongthe 2 patientswith mutation ofGDAP1 gene,compound heterozygous mutation c.767A＞G(p.His256Arg)and c.866T＞A(p.Phe289Tyr)were seen in Case 1,whose father carried c.866T＞A(p.Phe289Tyr)heterozygous mutation and mother carried c.767A＞G(p.His256Arg)heterozygous mutation,while compound heterozygous mutation c.571C＞T(p.Arg191X)and c.589delC(p.Asp198IlefsX8)were seen in Case 2,whose father carried c.589delC(p.Asp198IlefsX8)heterozygous mutation and mother carried c.571C＞T(p.Arg191X)heterozygous mutation.Therefore,Case 1 and Case 2 were all diagnosed as AR?CMT.ConclusionsTarget region capture sequencing is a rapid and reliable genetic testing method with high efficiency.It is applicable for the diagnosis of AR?CMT.

Charcot?Marie?Tooth disease; Genes,recessive; Mutation; Pedigree

10.3969/j.issn.1672?6731.2017.08.009

國家自然科學基金青年科學基金資助項目（項目編號：81500980）；福建省衛(wèi)生廳青年科研課題（項目編號：2014-1-54）

350005福州，福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院神經內科

陳萬金（Email：wanjinchen75@fjmu.edu.cn）

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China for Young Scientists(No.81500980)and the Youth Scientific Research Subject supported by the Health Department of Fujian Province,China(No.2014-1-54).

2017?06?15）