賈鳳安　甄麗莎　常帆　呂睿+劉晨

摘要：為了篩選性能良好的新造耕地產1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸脫氨酶（1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid deaminase，簡稱ACCD）菌株，對菌株進行多項分類鑒定，分離所產生的ACCD菌株并對其性質進行研究。以 1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸（ACC）作為唯一氮源分離純化普魯蘭酶產生菌，通過形態(tài)學鑒定、16S rRNA序列分析等試驗確定菌株的分類地位。通過Biolog自動微生物鑒定系統(tǒng)，使用GenⅢ鑒定板進行生理生化測定，以及不同條件下酶活性的檢測，研究菌株的產酶特性。通過平皿促生試驗，研究菌株不同組分的促生作用。結果表明，從陜北新造耕地樣品中分離得到6株ACCD產生菌，經過多項分類鑒定顯示，這些菌株主要分為假單胞菌屬（Pseudomonas）、腸桿菌屬（Enterobacter）、伯克氏菌屬（Burkholderia），其中Enterobacter菌株YAnl_w2產酶迅速，在最適溫度和pH值條件下ACCD活性達0.54 μmol/（mg·h）（以單位質量酶蛋白在單位時間內生成α-丁酮酸的物質的量表示）。促生試驗表明，YAnl_w2對麥種具有明顯的促生作用，具有促生應用前景。對6株新造耕地分離菌株的多項分類結果鑒定發(fā)現，它們均為產ACCD的細菌，其中YAnl_w2菌株ACCD產率、產量較其他來源的酶高，對麥種促生作用明顯，具有進一步的研究價值。

關鍵詞：1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸；ACC脫氨酶；新造耕地；根際促生菌；腸桿菌屬

中圖分類號： S182 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）19-0289-05

收稿日期：2016-05-23

基金項目：陜西省科學院科技計劃青年人才項目（編號：2015K-21）；陜西省科學院青年聯合創(chuàng)新項目（編號：2016k-18）；陜西省社會發(fā)展科技攻關項目（編號：2016SF-450）。

作者簡介：賈鳳安（1985—），女，陜西西安人，碩士，研究實習員，主要從事微生物肥料及微生物代謝產物相關研究。Tel：（029）85350847；E-mail：jiafengan@hotmail.com。

通信作者：甄麗莎，博士，助理研究員，主要從事微生物肥料及石油污染土壤修復相關研究。E-mail：zhenlisha2002@163.com。 黃土高原是全國水土流失較嚴重的地區(qū)之一，自退耕還林還草工程實施以來，黃土高原的植被覆蓋度大幅提高，生態(tài)環(huán)境逐步改善。但是在退耕還林還草工程取得巨大成就的同時，黃土高原地區(qū)退耕土地面積已經超出可退耕面積的上限，導致耕地面積減少[1]，農民口糧難以保障[2]。為有效保障地方糧食生產，鞏固退耕還林草的成效，達到耕地占補平衡的政策目標[3]，陜西省延安市率先開展治溝造地整治工程，以期擴大區(qū)域內可耕地的面積。而由治溝造地方式產生的新造耕地，土壤結構已被破壞，肥力低下，難以形成高標準農田，成為制約產量的關鍵性因素[4]。

土地土壤的生物指標、化學指標及其物理指標的退化是導致土地土壤質量退化最直接的表現。在逆境條件下，作物會持續(xù)產生高濃度的乙烯，對自身的生長造成阻礙。為了減緩這一阻礙效果，需要降低作物體內逆境乙烯的產生量。乙烯生物合成途徑中的前體物質1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸（1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid，簡稱ACC）可在ACC脫氨酶（ACC deaminase，簡稱ACCD）的作用下被分解為α-丁酮酸（α-KA）和氨[5]。而直接產生ACCD的植物細胞還未見報道[6]。植物根際促生細菌（plant growth-promoting rhizobacteria，簡稱PGPR）是一類游離在土壤或共生于植物根系的可促進植物生長及其對礦質營養(yǎng)的吸收和利用，同時能抑制有害生物的有益菌群[7]。許多PGPR可誘導產生ACCD，因此，具有ACCD活性的PGPR菌株在促進植株養(yǎng)分吸收[8]、增加生物量[9]、促進豆科植物結瘤[10]，以及保護植物免受鹽堿[11]、干旱、真菌及細菌等致病菌[12]對生長產生的抑制作用方面具有較好的應用前景。

目前，關于ACCD活性的PGPR菌株研究主要集中在對自然土壤改良和增加肥效方面[13]，對人工干預土地中的原生PGPR鮮有報道。本研究通過對延安新造耕地、淤地壩等人工干預土地中PGPR菌株篩選、酶活性和促生效果的初步研究，以期尋找具有潛在促生作用的菌株，為延安人造土地提供原生菌種資源，為植物-微生物聯合改良土壤研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

樣品來源：樣品采自陜西省延安市安塞縣南溝村新造耕地表層下15～20 cm的土壤樣本。采用“S”形采樣法，每個采樣地采集20個點，混合土樣采用四分法處理保留約500 g，4 ℃冰盒保存運輸。

1.2 培養(yǎng)基

PAF培養(yǎng)基（富集培養(yǎng)基）：10 g/L蛋白胨，10 g/L酪蛋白水解物，1.5 g/L MgSO4，1.5 g/L K2HPO4，10 mL甘油，pH值7.2。

DF培養(yǎng)基（篩選培養(yǎng)基）：組分（1），含10 mg H3BO3，112 mg MnSO4·H2O，124.6 mg ZnSO4·7H2O，78.2 mg CuSO4·5H2O，10 mg MnO3，將以上成分溶解于100 mL無菌水中，4 ℃保存；組分（2），含100 mg FeSO4·7H2O，將其溶于10 mL無菌水中，4 ℃保存。各取0.1 mL組分（1）與組分（2）溶液，再加入4.0 g/L KH2PO4、6.0 g/L Na2HPO4、0.2 g/L MgSO4·7H2O、2.0 g/L葡萄糖、2.0 g/L葡萄糖酸鈉、2.0 g/L檸檬酸、2.0 g/L （NH4）2SO4。分離純化培養(yǎng)基：在DF培養(yǎng)基中添加20g瓊脂。endprint

ADF培養(yǎng)基（加富培養(yǎng)基）：將ACC溶于超純水，過濾滅菌，加入到不含（NH4）2SO4的滅菌DF培養(yǎng)基中，終濃度為30 mmol/L。

TSB培養(yǎng)基（保存培養(yǎng)基）：17 g/L胰蛋白胨，3 g/L大豆胨，5 g/L NaCl，2.5 g/L葡萄糖，2.5 g/L K2HPO4，pH值7.1。

1.3 主要試劑與儀器

ACC，購自Sigma公司；Taq酶及細菌DNA提取試劑盒，購自TaKaRa公司。Centrifuge 5804R高速冷凍離心機，購自Eppendorf公司；梯度PCR儀，購自Biometra公司；Synergy H1多功能酶標儀，購自BioTek公司；Gen Ⅲ Microstation自動微生物鑒定系統(tǒng)，購自Biolog公司。

1.4 新造土壤中ACCD細菌的富集和分離

采用Penrose等的方法[14]并有所改進。稱取延安新造耕地土壤樣品各5 g，分別加入50 mL無菌水中，振蕩制成土壤懸浮液，吸取1 mL懸浮液加入50 mL PAF培養(yǎng)液中，28 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)。24 h后，從其中吸取1 mL菌懸液重復轉接1次。從第2次菌懸液中轉移1 mL至50 mL DF培養(yǎng)液中，在相同條件下培養(yǎng)24 h后，從中吸取1 mL菌懸液加入 50 mL ADF培養(yǎng)液中，在相同條件下培養(yǎng)24 h，用于具有ACC脫氨酶活性細菌的篩選。梯度稀釋ADF培養(yǎng)液中的菌懸液，并涂布于ADF固體平板上，在28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，待長出單菌落后，挑取單菌落純化后保存于TSB斜面培養(yǎng)基上。

1.5 ACCD促生活性菌的篩選與鑒定

1.5.1 菌株產ACCD活性測定 采用Penrose等的方法[14]并有所改進。（1）將-80 ℃凍存管中保存的菌種接入5 mL TSB液體培養(yǎng)基，擴大培養(yǎng)24 h后，4 ℃、9 000 r/min離心 10 min，棄上清，收集菌體。用不含（NH4）2SO4的DF液體培養(yǎng)基離心洗滌菌體2次，重懸于7.5 mL ADF培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)24 h以誘導其產ACCD，4 ℃、9 000 r/min離心10 min，棄上清，收集菌體并記錄菌體質量。（2）將菌體重懸于 600 mL 0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH值8.5）中，加入 30 μL 甲苯，迅速振蕩30 s，破碎細胞，4 ℃貯存，即為粗酶液。（3）取 200 μL 粗酶液放入1.5mL離心管中，加入20 μL 0.5 mol/L ACC混勻，于30 ℃水浴60min。隨即加入1 mL 056 mol/L HCl終止反應，12 000 r/min離心5 min，取上清液。（4）每毫升上清液加入800 μL 0.56 mol/L HCl和 300 μL 0.2% 2，4-二硝基苯肼溶液（在2 mol/L HCl中溶解），30 ℃保溫 30 min。加入2 mL 2 mol/L NaOH混勻，540 nm 處測定吸光度。（5）繪制α-丁酮酸標準曲線：配制10 mmol/L的α-丁酮酸，分別取0、10、20、40、60、80、100、120 μL 母液稀釋液加入試管中，用0.1 mol/L Tris-HCl（pH值8.5）補足至1 mL，α-丁酮酸濃度范圍為0.024～0.293 μmol/mL。按步驟（4）操作。ACC脫氨酶活性以反應體系中1 mg酶蛋白1 h內生成α-丁酮酸的物質的量表示，單位為μmol/（mg·h）。

1.5.2 新造土壤細菌多項分類鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析 （1）生理生化鑒定：參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》（8版）[15]。（2）16S rRNA序列擴增和序列分析：菌株在LB培養(yǎng)基中于28 ℃振蕩培養(yǎng)至對數期，離心收集菌體，用TaKaRa試劑盒提取DNA。根據原核生物16S rRNA保守序列通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACC TTGTTACGACTT-3′）[16]進行16S rRNA的PCR擴增，采用50 μL反應體系，擴增程序：95 ℃ 4 min，94 ℃ 30 s，53 ℃ 35 s，72 ℃ 1.5 min，30個循環(huán)；72 ℃10 min。擴增產物由生工生物工程（上海）股份有限公司測序。將測定的序列在GenBank中用BLAST在線軟件與已知的16S rRNA序列進行同源性分析，利用DNASTAR（SeqMan）拼接序列，并手工適當校正。采用ClustX 2.1軟件進行多序列比對。用Mega 7.0軟件包中的Kimura 2-Parameter Distance模型進行多序列匹配排列，用鄰接法（Neighbor-Joining Method）構建16S rRNA 基因系統(tǒng)發(fā)育樹。（3）Biolog自動微生物鑒定：選擇IF-A培養(yǎng)液，利用Biolog GEN Ⅲ細菌鑒定板對微生物進行94種表型測試，微生物在測試板上所顯示出的表型指紋被用來在種的水平上鑒定該微生物。

1.6 菌株產ACCD的培養(yǎng)條件研究

（1）溫度對酶活性的影響：制得的粗酶液分別在溫度為15～45 ℃條件下加入底物反應30 min，測定酶活性；（2）pH值對酶活性的影響：設置pH值范圍為4.0～10.0的處理，分別用不同pH值的緩沖液配制底物和酶液，測定酶活性。

1.7 菌株促生作用研究

用飽和NaCl溶液選種，挑出飽滿完整的麥種，用10%H2O2表面消毒5 min，蒸餾水漂洗4～5次晾干備用。以無菌水作為對照，分別用促生菌株菌體重懸液、發(fā)酵液、離心后的上清浸麥種24h，將不同處理的麥種置于裝有濕潤濾紙的無菌培養(yǎng)皿中，放入28 ℃光照培養(yǎng)箱內，定期觀察種子萌發(fā)情況，5 d后測量麥種的根長、莖長，用以表征促生作用。

2 結果與分析

2.1 ACC脫氨酶活性菌株篩選endprint

采樣地地理信息：36°35′N，109°17′E，海拔1 212 m；采樣點YA-1種植玉米，為1年新造耕地混合土樣；采樣點YA-2種植白菜，為平整1月新造耕地混合土樣；采樣點YA-3為淤地壩混合土樣，種植櫻桃。

利用ADF篩選培養(yǎng)基從3份混合土樣中共分離到43株菌株，根據菌落顏色、形態(tài)、大小、長勢等特征初步去重得到18株菌株。根據Penrose等以ACC脫氨酶酶活性不低于 20 nmol/（mg·h） 作為篩選指標，得到6株ACCD活性較高的菌株[14]。

6株菌在ADF培養(yǎng)基經5次傳代后仍正常生長，表明它們有產ACCD的能力。從表1可以看出，6株菌的酶活性差異較大，其中YAnl_w2、YAnl_ty7、YAnl_011 ACCD活性分別為（0291±0.010）、（0.185±0.021）、（0.136±0.015） μmol/（mg·h），其中YAnl_w2酶活性最高。

2.2 菌株16S rRNA 基因序列的測定、Biolog細菌鑒定以及系統(tǒng)發(fā)育分析

從延安安塞南溝村新造耕地初步分離后經初步篩選，得到6株具有產ACCD活性的細菌，經DNA提取和16SrRNA基因序列擴增、測序，由圖2可以看出，6株菌主要分為假單胞菌屬（Pseudomonas）、腸桿菌屬（Enterobacter）、伯克氏菌屬（Burkholderia）。結果表明，南溝村新造耕地具ACCD活性細菌多樣性并不豐富，本試驗中只篩選到3屬共6株產ACCD細菌。研究表明，假單胞菌屬作為土壤常駐細菌在生物防治[17]、促生作用[18]方面有巨大潛力。而腸桿菌屬是近年來發(fā)現的具有ACCD活性的促生菌[19]，同時可產生吲哚乙酸（IAA）、鐵載體等物質[20]。此外，發(fā)現分泌ACCD的伯克氏菌屬[21]對番茄[22]、小麥[23]、茶葉[24]等農作物均有促生作用。

經MEGA 7構建Neighbor-Joining系統(tǒng)進化樹分析（圖2）以及在NCBI數據庫、StrainInfo數據庫中進行有效種16S rRNA基因序列相似性檢索后發(fā)現，在假單胞菌屬中，YAnl_w1 與Pseudomonas moraviensis strain CCM 7280 （AY970952.1）的相似性為98%，YAnl_011與斯氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri）strain VKM B-975 （EU883663.1）的相似性為99%，YAnl_ty7與假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）C36 strain （AJ575816.1）的相似性為99%，但與棲稻假單胞菌（Pseudomonas oryzihabitans）strain IAM 1568T （AM262973.1）的進化距離較遠，還需要進一步確定其進化關系。腸桿菌屬中，YAnl_w2與路德維希腸桿菌（Enterobacter ludwigii）strain EN-119T （AJ853891.1）的序列相似性為99%，表明YAnl_w2屬于腸桿菌屬（Enterobacter）。伯克氏菌屬YAnl_t2與Burkholderia gladioli pv. gladioli strain CFBP 2427 （GU936677.1）的相似性為98%，YAnl_ty5與Burkholderia caribiensis strain MWAP64 （Y17009.1）的序列相似性為100%，表明YAnl_t2和YAnl_ty5屬于伯克霍爾德菌（Burkholderia）。

YAnl_w2對蔗糖、水蘇糖、α-D-乳糖等多種寡糖，對D-山梨醇、D-甘露醇、肌醇等醇類，對D-絲氨酸、L-絲氨酸、L-精氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸等氨基酸，以及對乳酸、檸檬酸、乙酸、L-蘋果酸等短鏈酸呈陽性反應，其中能利用檸檬酸、乙酸為腸桿菌屬（Enterobacter）典型反應[15]；Enterobacter屬利用明膠速度慢[15]，亦表現為陰性反應。綜上可知，YAnl_w2表現為典型的Enterobacter屬特征。最終確定細菌的分類地位，仍需要通過各自形態(tài)特征、生理生化與化學分類特征及近緣菌株 DNA-DNA同源性結果來判斷。

2.3 YAnl_w2性質及促生作用

2.3.1 YAnl_w2產酶條件初步研究 研究表明，腸桿菌屬是一類產ACCD且具有促生潛力的細菌[25]，同時具有耐鹽[26]、耐重金屬[27]等優(yōu)良特性，研究YAnl_w2菌株生長條件，對研究其酶學性質、優(yōu)化產酶條件有重要意義。根據“2.1”節(jié)的試驗結果，對酶活性最高、具有應用潛力的YAnl_w2菌產酶條件進行初步研究。

由圖3-a可以看出，YAnl_w2細菌ACCD和底物反應時，溫度和pH值的變化對ACCD活性影響較大。在溫度較低（15 ℃）時，幾乎沒有酶活性，而隨著溫度的上升，酶活性逐漸升高，在30 ℃時，YAnl_w2酶活性最高，而隨著溫度繼續(xù)上升，酶活性呈下降趨勢，但37 ℃時ACCD活性仍約為最高酶活性的40%。

由圖3-b可以看出，在30 ℃體系中，YAnl_w2的ACCD最適pH值為7.0[酶活性為0.54 μmol/（mg·h）]，pH值從4.0開始酶活性逐漸升高，pH值達到7.0后酶活性隨著pH值的升高而逐漸下降。pH值在6.0～7.0之間時，YAnl_w2擁有較高的酶活性，表明YAnl_w2分泌的ACCD可能是一類中性酶。

2.3.2 YAnl_w2的促生作用 由圖4可見，與無菌水浸種對比，YAnl_w2的各組分均有促生長作用，其中發(fā)酵液對麥種促生作用與CK相比，對麥種根長、莖長的促生作用顯著，其次為菌體重懸液。菌體重懸液促生效果明顯優(yōu)于發(fā)酵液上清，說明細菌YAnl_w2通過附著在根系表面，可能在ACCD作用下吸收植物生成的ACC，從而達到促生效果；同時YAnl_w2可能還擁有其他促生因子。有報道指出，除產生ACCD外，腸桿菌可能還具有清除活性氧自由基等快速調節(jié)機制，從而對植株產生抗逆和促生的作用[28]，因此發(fā)酵液上清亦有促生效果，它對YAnl_w2的促生作用之后將進一步研究。endprint

3 結論

目前，人們對產ACCD的PGPR菌株已進行了大量報道。該菌株作為土壤改良劑、微生物活菌制劑等對土壤的改良正在成為土壤改良的研究熱點[29-30]。具有ACCD活性的PGPR作用于其根際區(qū)域的生態(tài)位，利用與宿主植物的共生作用對環(huán)境脅迫條件作出響應[28，31]，同時通過風力、雨水等作用在地表和地下以游離形式運動，從而降低地區(qū)植株根際乙烯水平，減輕逆境脅迫環(huán)境對作物的不利影響[32]。

本研究以ACC為唯一氮源，采用富集定向篩選方法，從陜西延安新造耕地土壤中分離到6株具有ACC脫氨酶活性的植物促生菌，并測定了ACC脫氨酶活性，分析了16S rDNA 序列及其進化地位。本研究發(fā)現1株酶活最高、具有潛在應用價值的細菌YAnl_w2，研究發(fā)現該菌株可能產中溫中性ACCD，酶活性最高可達0.54 μmol/（mg·h）；同時發(fā)現，YAnl_w2及其分泌的物質均對麥種產生促生效果，提示除ACCD外可能還有其他促生機制。YAnl_w2分離自延安地區(qū)新造耕地土壤，相較于其他來源的微生物制劑，對當地環(huán)境具有更好的適應性。今后，有待深入關于該菌株的促生作用以及相關微生物肥料的研究。

參考文獻：

[1]Liu Q，Wang Y，Zhang J，et al. Filling gullies to create farmland on the loess plateau[J]. Environ Sci Technol，2013，47（14）：7589-7590.

[2]Lv Y H，Fu B J，Feng X M，et al. A Policy-driven large scale ecological restoration：quantifying ecosystem services changes in the Loess Plateau of China[J]. PLoS One，2012，7（2）：e31782.

[3]2014中國國土資源公報（摘登）[N]. 中國國土資源報，2015-04-22（3）.

[4]蔡艷蓉，李永紅，高照良. 黃土高原地區(qū)土地資源分區(qū)研究[J]. 農業(yè)災害研究，2015，5（5）：38-47，53.

[5]Glick B R，Penrose D M，Li J. A model for the lowering of plant ethylene concentrations by plant growth-promoting bacteria[J]. J Theor Biol，1998，190（1）：63-68.

[6]Glick B R. Modulation of plant ethylene levels by the bacterial enzyme ACC deaminase[J]. FEMS Microbiol Lett，2005，251（1）：1-7.

[7]Ahmed A，Hasnain S. Auxins as one of the factors of plant growth improvement by plant growth promoting rhizobacteria[J]. Pol J Microbiol，2014，63（3）：261-266.

[8]劉艷萍，滕松山，趙 蕾. 高產嗜鐵素惡臭假單胞菌A3菌株的鑒定及其對黃瓜的促生作用[J]. 植物營養(yǎng)與肥料學報，2011，17（6）：1507-1514.

[9]史煦涵，劉佳莉，方 芳，等. 含ACC脫氨酶的PGPR在植物抗非生物脅迫中的作用研究進展[J]. 中國農學通報，2012，28（27）：1-4.

[10]竇雅靜，康麗華，陸俊錕，等. 黑木相思根瘤菌ACC脫氨酶活性的研究[J]. 中南林業(yè)科技大學學報，2014，34（11）：77-83.

[11]Bal H B，Nayak L，Das S，et al. Isolation of ACC deaminase producing PGPR from rice rhizosphere and evaluating their plant growth promoting activity under salt stress[J]. Plant and Soil，2013，366（1/2）：93-105.

[12]Nascimento F X，Vicente C S L，Barbosa P，et al. Evidence for the involvement of ACC deaminase from Pseudomonas putida UW4 in the biocontrol of pine wilt disease caused by Bursaphelenchus xylophilus[J]. BioControl，2013，58（3）：427-433.

[13]Gamalero E，Glick B R. Bacterial modulation of plant ethylene levels[J]. Plant Physiol，2015，169（1）：13-22.

[14]Penrose D M，Glick B R. Methods for isolating and characterizing ACC deaminase-containing plant growth-promoting rhizobacteria[J]. Physiol Plant，2003，118（1）：10-15.

[15]Buchanan R E，Gibbons N E. 伯杰氏細菌鑒定手冊[M]. 8 版.北京：科學出版社，1984：450.endprint

[16]Weisburg W G，Barns S M，Pelletier D A，et al. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study[J]. Journal of Bacteriology，1991，173（2）：697-703.

[17]Wintermans P C A，Bakker P A H M，Pieterse C M J. Natural genetic variation in Arabidopsis for responsiveness to plant growth-promoting rhizobacteria[J]. Plant Mol Biol，2016，90：623-634.

[18]Kumar M，Mishra S，Dixit V，et al. Synergistic effect of Pseudomonas putida and Bacillus amyloliquefaciens ameliorates drought stress in chickpea （Cicer arietinum L.）[J]. Plant Signal Behav，2016，11（1）：e1071004.

[19]Penrose D M，Glick B R. Levels of ACC and related compounds in exudate and extracts of canola seeds treated with ACC deaminase-containing plant growth-promoting bacteria[J]. Can J Microbiol，2001，47（4）：368-372.

[20]Yaish M W，Antony I，Glick B R. Isolation and characterization of endophytic plant growth-promoting bacteria from date palm tree （Phoenix dactylifera L.） and their potential role in salinity tolerance[J]. Antonie Van Leeuwenhoek，2015，107（6）：1519-1532.

[21]Sun L N，Wang X H，Li Y. Increased plant growth and copper uptake of host and non-host plants by metal-resistant and plant growth-promoting endophytic bacteria[J]. Int J Phytoremediation，2016，18（5）：494-501.

[22]Onofre-Lemus J，Hernandez-Lucas I，Girard L，et al. ACC （1-aminocyclopropane-1-carboxylate） deaminase activity，a widespread trait in Burkholderia species，and its growth-promoting effect on tomato plants[J]. Appl Environ Microbiol，2009，75（20）：6581-6590.

[23]Shaharoona B，Jamro G M，Zahir Z A，et al. Effectiveness of various Pseudomonas spp. and Burkholderia caryophylli containing ACC-deaminase for improving growth and yield of wheat （Triticum aestivum L.）[J]. J Microbiol Biotechnol，2007，17（8）：1300-1307.

[24]Dutta J，Handique P J，Thakur D. Assessment of culturable tea rhizobacteria isolated from tea estates of Assam，India for growth promotion in commercial tea cultivars[J]. Front Microbiol，2015，6：1252.

[25]Jha C K，Annapurna K，Saraf M. Isolation of rhizobacteria from Jatropha curcas and characterization of produced ACC deaminase[J]. J Basic Microbiol，2012，52（3）：285-295.

[26]Kim K，Jang Y J，Lee S M，et al. Alleviation of salt stress by Enterobacter sp. EJ01 in tomato and Arabidopsis is accompanied by up-regulation of conserved salinity responsive factors in plants[J]. Mol Cells，2014，37（2）：109-117.

[27]Li Y，Wang Q，Wang L，et al. Increased growth and root Cu accumulation of Sorghum sudanense by endophytic Enterobacter sp. K3-2：implications for Sorghum sudanense biomass production and phytostabilization[J]. Ecotoxicol Environ Saf，2016，124：163-168.endprint

[28]Kim K，Jang Y J，Lee S M，et al. Alleviation of salt stress by enterobacter sp. EJ01 in tomato and Arabidopsis is accompanied by up-regulation of conserved salinity responsive factors in plants[J]. Mol Cells，2014，37（2）：109-117.

[29]Molineux C J，Connop S P，Gange A C. Manipulating soil microbial communities in extensive green roof substrates[J]. Sci Total Environ，2014，493：632-638.

[30]Rashad F M，Saleh W D，Moselhy M A. Bioconversion of rice straw and certain agro-industrial wastes to amendments for organic farming systems：1. Composting，quality，stability and maturity indices[J]. Bioresour Technol，2010，101（15）：5952-5960.

[31]Hassan W，Bano R，Bashir F，et al. Comparative effectiveness of ACC-deaminase and/or nitrogen-fixing rhizobacteria in promotion of maize （Zea mays L.） growth under lead pollution[J]. Environ Sci Pollut Res Int，2014，21（18）：10983-10996.

[32]魏素娜. 小麥根際具有ACC脫氨酶活性細菌菌株的分離、鑒定及接種效應的研究[D]. 楊凌：西北農林科技大學，2011. 劉彥伶，李 渝，張雅蓉，等. 長期不同施肥處理對黃壤性水稻土理化性質的影響[J]. 江蘇農業(yè)科學，2017，45（19）：294-298.endprint