馬強(qiáng)+劉方燕+黨曉群+孫厚良+李國(guó)利+熊書(shū)+潘國(guó)慶+周澤揚(yáng)

摘要：為研究家蠶微孢子蟲(chóng)類枯草桿菌蛋白酶Nbslp2的保守性及轉(zhuǎn)錄活性，采用生物信息學(xué)相關(guān)軟件對(duì)微孢子蟲(chóng)類枯草桿菌蛋白酶slp2基因共線性、多重序列及系統(tǒng)進(jìn)化進(jìn)行比對(duì)分析，并通過(guò)Western blot分析Nbslp2在家蠶微孢子蟲(chóng)、柞蠶微孢子蟲(chóng)及納卡變形微孢子蟲(chóng)中的表達(dá)特征，以驗(yàn)證其保守性；進(jìn)一步以感染家蠶微孢子蟲(chóng)不同天數(shù)的家蠶中腸組織為材料，利用RT-PCR檢測(cè)Nbslp2的轉(zhuǎn)錄活性。共線性、多重序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，Nbslp2在微孢子蟲(chóng)基因組中的位置較保守，Western blot結(jié)果顯示Nbslp2抗體在柞蠶微孢子蟲(chóng)總蛋白中雜交出2條帶，而在納卡變形微孢子蟲(chóng)沒(méi)有雜交條帶，說(shuō)明Nbslp2相對(duì)保守，并且可將Nbslp2作為區(qū)分柞蠶微孢子蟲(chóng)和納卡變形微孢子蟲(chóng)的靶標(biāo)；RT-PCR結(jié)果顯示Nbslp2在感染家蠶微孢子蟲(chóng)后72 h檢測(cè)到轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)一步推測(cè)Nbslp2可能在家蠶微孢子蟲(chóng)感染家蠶早期發(fā)揮作用，為分子水平深入研究Nbslp2的功能奠定理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：家蠶微孢子蟲(chóng)；表達(dá)特征；定位；功能；保守性；轉(zhuǎn)錄活性；共線性；多重序列比對(duì)；系統(tǒng)進(jìn)化

中圖分類號(hào)：S884.2+1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2017）19-0150-04

收稿日期：2017-04-06

基金項(xiàng)目：重慶三峽醫(yī)藥高等專科學(xué)校苗圃工程項(xiàng)目（編號(hào)：2014mpxz1）；重慶市基礎(chǔ)與前沿研究計(jì)劃（編號(hào)：cstc2014jcyjA80019）。

作者簡(jiǎn)介：馬 強(qiáng)（1986—），男，云南玉溪人，碩士，講師，主要從事微生物功能基因組學(xué)研究。Tel：（023）58556819；E-mail：cjmaqiang@163.com。

通信作者：周澤揚(yáng)，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事微生物學(xué)及家蠶分子生物學(xué)研究。Tel：（023）68251088；E-mail：zyzhou@swu.edu.cn。 微孢子蟲(chóng)（microsporidia）能夠感染宿主并且通過(guò)自由孢子形式進(jìn)行傳播，是一類細(xì)胞內(nèi)專性寄生的單細(xì)胞真核生物，至今已發(fā)現(xiàn)并報(bào)道的微孢子蟲(chóng)種類已經(jīng)超過(guò)1 300種，分別被歸入160多個(gè)屬，能夠廣泛寄生于幾乎所有的無(wú)脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物，包括人類[1-2]。家蠶微孢子蟲(chóng)（Nosema bombycis）是1857年Nageli首次從病蠶體內(nèi)鑒定出的人類歷史上第1種微孢子蟲(chóng)，它能引起家蠶微粒子病，這種病害曾在19世紀(jì)給歐洲、美國(guó)以及亞洲的蠶業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失，直到現(xiàn)在這種病害也常有發(fā)生[3-4]。由于它的危害性巨大，一直以來(lái)都很受關(guān)注，在許多養(yǎng)蠶國(guó)家和地區(qū)，家蠶微孢子蟲(chóng)被列為蠶業(yè)生產(chǎn)上唯一的法定檢疫對(duì)象。

微孢子蟲(chóng)作為專性的細(xì)胞內(nèi)寄生生物，其生活史的完成必須嚴(yán)格依賴于宿主提供的營(yíng)養(yǎng)和能量。家蠶微孢子蟲(chóng)是家蠶微粒子病的病原，其侵染和致病機(jī)理目前仍不清楚。普遍的觀點(diǎn)認(rèn)為，家蠶微孢子蟲(chóng)通過(guò)釋放蛋白酶，水解寄主細(xì)胞內(nèi)容物，掠奪宿主營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，完成其在宿主家蠶細(xì)胞內(nèi)的增殖[5-6]。因此，分泌性蛋白酶被認(rèn)為是致病性真菌重要的毒力因子。這些蛋白酶不僅參與孢子的入侵過(guò)程，還可以與宿主的免疫系統(tǒng)相互作用。類枯草桿菌蛋白酶（subtilisin-like protease，SLP）為絲氨酸蛋白酶家族成員，廣泛存在于細(xì)菌、真菌和寄生蟲(chóng)等生物中。近年研究表明，類枯草桿菌蛋白酶與病原性細(xì)菌、真菌的致病性相關(guān)[7-8]，在真菌孢子形成、蛋白質(zhì)降解及細(xì)胞自噬等方面起著非常重要的作用[9-11]。隨著家蠶微孢子蟲(chóng)基因組測(cè)序的完成，通過(guò)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)在家蠶微孢子蟲(chóng)中也存在類枯草桿菌蛋白酶。因此，筆者推測(cè)家蠶微孢子蟲(chóng)可能在入侵過(guò)程中會(huì)分泌類枯草桿菌蛋白酶，通過(guò)降解昆蟲(chóng)體壁幫助其入侵宿主細(xì)胞?；诖耍狙芯吭谝谚b定報(bào)道的3個(gè)類枯草桿菌蛋白酶基因（Nbslp1、Nbslp2-1和Nbslp2-2）的基礎(chǔ)上[12]，分析了第2個(gè)類枯草桿菌蛋白酶基因Nbslp2的保守性及轉(zhuǎn)錄情況，為進(jìn)一步研究該基因在家蠶微孢子蟲(chóng)中的定位和功能探索提供重要的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及主要試劑和儀器

家蠶微孢子蟲(chóng)CQ1分離株由西南大學(xué)蠶病研究室分離獲得，保存于中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心（CVCC，保藏號(hào)為CVCC102059）。

Trizol、瓊脂糖購(gòu)于Invitrogen公司；乙二胺四乙酸鈉（EDTA）購(gòu)于USB公司；DNase Ⅰ、RNase Inhibitor、dNTP、Oligo（dT）、Taq酶和DL2000 DNA Marker購(gòu)于TaKaRa公司；羊抗鼠IgG-HRP、玻璃珠（150～212 μm）購(gòu)自Sigma公司；PVDF膜購(gòu)自Roche公司；EasySee Western Marker購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；焦碳酸二乙酯（DEPC）和3-（N-嗎啉）丙磺酸購(gòu)于生工生物工程上海（股份）有限公司；三氯甲烷購(gòu)于重慶化學(xué)試劑有限公司；甲醛購(gòu)于重慶北碚化學(xué)試劑廠。所需要的特異性引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 家蠶微孢子蟲(chóng)Nbslp2的多重序列比對(duì)及共線性分析

根據(jù)筆者所在實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的家蠶微孢子蟲(chóng)全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，結(jié)合NCBI公共數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）中兔腦炎微孢子蟲(chóng)（Encephalitozoon cuniculi）、蜜蜂微孢子蟲(chóng)（Nosema ceranae）、腸腦炎微孢子蟲(chóng)（Encephalitozoon intestinalis）以及腸道微孢子蟲(chóng)（Enterocytozoon bieneusi）的基因組數(shù)據(jù)，利用ClustalX軟件對(duì)slp2的同源基因序列進(jìn)行多重序列比對(duì)，用Boxshade對(duì)比對(duì)后的結(jié)果進(jìn)行修正。同時(shí)分析slp2在幾種微孢子蟲(chóng)數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因座位信息、基因長(zhǎng)度、垂直同源基因的對(duì)應(yīng)關(guān)系，利用在線軟件http：//microbe.swu.edu.cn/cgi-bin/synteny進(jìn)行共線性圖譜的繪制。此外，分別選擇真菌、細(xì)菌、頂復(fù)亞門(mén)、微孢子蟲(chóng)門(mén)幾個(gè)代表物種，對(duì)各物種中的slp2的同源序列進(jìn)行多序列比對(duì)，將多序列比對(duì)結(jié)果使用MEGA 5.0程序構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)，設(shè)置信度為1 000。endprint

1.3 家蠶微孢子蟲(chóng)Nbslp2的保守性分析

利用Western blot分析家蠶微孢子蟲(chóng)類枯草桿菌蛋白酶Nbslp2在家蠶微孢子蟲(chóng)（N. bombycis）、柞蠶微孢子蟲(chóng)（N. antheraeae）以及納卡變形微孢子蟲(chóng)（Vairimorpha necatrix）中的表達(dá)特征，以驗(yàn)證其保守性，分別取1×109純化的上述3種微孢子蟲(chóng)孢子沉淀，加400 μL PBS（pH值7.3）重新懸浮，同時(shí)分別稱取0.4 g玻璃珠加到3管孢子懸液中，加入PMSF，4 ℃渦旋振蕩6 h，然后4 ℃、12 000 r/min離心 10 min，收集上清液，得到3種微孢子蟲(chóng)的孢子總蛋白，之后將提取獲得的3種孢子總蛋白定量后進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的TBST溶液（現(xiàn)用現(xiàn)配）4 ℃封閉過(guò)夜，之后用TBST溶液洗滌封閉液，重復(fù)3次，然后加入制備的抗血清anti-NbSLP2（1 ∶6 000）作為一抗，室溫孵育 1 h。辣根酶標(biāo)記山羊抗鼠lgG（1 ∶8 000）為二抗，37 ℃孵育1 h，ECL發(fā)光系統(tǒng)檢測(cè)，暗室內(nèi)X膠片顯影Western blot檢測(cè)結(jié)果。

1.4 家蠶微孢子蟲(chóng)Nbslp2的轉(zhuǎn)錄活性分析

利用RT-PCR分析家蠶微孢子蟲(chóng)類枯草桿菌蛋白酶Nbslp2的轉(zhuǎn)錄特征。取感染家蠶微孢子蟲(chóng)1～10 d的家蠶中腸組織，加入1.0 mL Trizol，液氮研磨，轉(zhuǎn)入1.5 mL EP管，混勻，靜置5 min后加入200 μL三氯甲烷，4 ℃、12 000 r/min離心10 min。取上層水相移入EP管，加入等體積的異丙醇，混勻，室溫靜置10 min，低溫離心，加入1 mL預(yù)冷的0.1% DEPC水配制的75%乙醇洗滌沉淀，空氣中干燥RNA沉淀15 min，加入20 μL RNase-Free ddH2O將沉淀溶解。瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察，判斷RNA的完整性。將提取的家蠶微孢子蟲(chóng)總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并以此cDNA為模版，設(shè)計(jì)家蠶微孢子蟲(chóng)類枯草桿菌蛋白酶Nbslp2的引物，slp2-F：5′-GGATCCATGCTGTTTGTTCTTCTTAT-3′和slp2-R：5′-GTCGACTCAATTTACATGTATTGTAG-3′；以家蠶微孢子蟲(chóng)β-tubulin基因作為內(nèi)參，Tub-F：5′-TGGACGCCATTAG ACAAG-3′和Tub-R：3′-TCTAAAGACAGCAGCCAC-3′進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變5 min；94 ℃變性30 s、55 ℃ 退火1 min、72 ℃延伸1 min，共25個(gè)循環(huán)。

2 結(jié)果與分析

2.1 家蠶微孢子蟲(chóng)Nbslp2的共線性分析

Nbslp2在家蠶微孢子蟲(chóng)基因組中有2個(gè)拷貝，該基因家族在微孢子蟲(chóng)染色體/scaffold上的位置相對(duì)保守（圖1），且Nbslp2在Nosema屬的微孢子蟲(chóng)基因組中的排布比在Encephalitozoon屬的位置更具線性關(guān)系。

2.2 家蠶微孢子蟲(chóng)Nbslp2的多重序列比對(duì)分析

采用ClustalX軟件對(duì)Nbslp2與其他微孢子蟲(chóng)，細(xì)菌、真菌、寄生蟲(chóng)等其他物種的同源基因進(jìn)行多重序列比對(duì)，結(jié)果顯示，Nbslp2序列中都具備行使類枯草桿菌蛋白酶催化功能的保守氨基酸位點(diǎn)（圖2），分別是Asp282、His304、Ser460。不同微孢子蟲(chóng)種間slp2的氨基酸序列相似度較高。

2.3 家蠶微孢子蟲(chóng)Nbslp2的系統(tǒng)進(jìn)化分析

為了進(jìn)一步分析家蠶微孢子蟲(chóng)slp2基因與其他物種中同源基因的進(jìn)化關(guān)系，以它們的蛋白質(zhì)序列構(gòu)建了鄰接法進(jìn)化樹(shù)。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的結(jié)果（圖3）表明，家蠶微孢子蟲(chóng)類枯草桿菌蛋白酶Nbslp2與蜜蜂微孢子蟲(chóng)（N. ceranae）、兔腦炎微孢子蟲(chóng)微孢子蟲(chóng)（E. cuniculi）、腸腦炎微孢子蟲(chóng)（E. intestinalis）聚為一支，且親緣關(guān)系較近，暗示slp2在微孢子蟲(chóng)基因組中的進(jìn)化較為保守。

2.4 家蠶微孢子蟲(chóng)類枯草桿菌蛋白酶Nbslp2基因的保守性分析

通過(guò)Western blotting從蛋白水平分析Nbslp2在家蠶微孢子蟲(chóng)（N. bombycis）、柞蠶微孢子蟲(chóng)（N. antheraeae）以及納卡變形微孢子蟲(chóng)（Vairimorpha necatrix）中的表達(dá)特征，結(jié)果如圖4所示。Nbslp2在家蠶微孢子蟲(chóng)和柞蠶微孢子蟲(chóng)中有表達(dá)，且在柞蠶微孢子蟲(chóng)中檢測(cè)到2條大小位置不一的條帶，而在納卡變形微孢子蟲(chóng)中未檢測(cè)到雜交信號(hào)，因此，可將Nbslp2作為區(qū)分上述3種微孢子蟲(chóng)的靶標(biāo)。

2.5 家蠶微孢子蟲(chóng)類枯草桿菌蛋白酶Nbslp2基因的轉(zhuǎn)錄活性分析

利用RT-PCR研究家蠶微孢子蟲(chóng)類枯草桿菌蛋白酶Nbslp2基因在感染家蠶后的轉(zhuǎn)錄情況。結(jié)果如圖5所示，Nbslp2在感染家蠶微孢子蟲(chóng)后72 h檢測(cè)到轉(zhuǎn)錄活性，并且該轉(zhuǎn)錄活性會(huì)隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)有逐漸減弱的趨勢(shì)，說(shuō)明Nbslp2可能在家蠶微孢子蟲(chóng)感染家蠶早期發(fā)揮作用。

3 結(jié)論與討論

自1954年第1個(gè)枯草桿菌分泌的蛋白酶被鑒定以來(lái)[13]，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)subtilisin進(jìn)行了深入而廣泛的研究，截止到目前為止NCBI中已收錄了17 868條蛋白質(zhì)序列，11 135 條基因序列，其中389個(gè)subtilisin的三維結(jié)構(gòu)已被解析。本研究主要是在已鑒定的3個(gè)家蠶微孢子蟲(chóng)類枯草桿菌蛋白酶基因Nbslp1、Nbslp2-1和Nbslp2-2基礎(chǔ)上，結(jié)合家蠶微孢子蟲(chóng)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)和生物信息學(xué)方法對(duì)其中的Nbslp2-1（Nbslp2）基因序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。通過(guò)共線性、多重序列比對(duì)以及系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，Nbslp2在Nosema屬微孢子蟲(chóng)基因組中的位置較為保守。通過(guò)Western blotting對(duì)Nbslp2的保守性進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在家蠶微孢子蟲(chóng)（N. bombycis）和柞蠶微孢子蟲(chóng)（N. antheraeae）有該蛋白的存在，而在納卡變形微孢子蟲(chóng)（V. necatrix）中沒(méi)有，因此，可以利用Nbslp2作為區(qū)分家蠶微孢子蟲(chóng)和納卡變形微孢子蟲(chóng)的分子靶標(biāo)。同時(shí)，免疫印跡的結(jié)果還顯示，Nbslp2抗體在柞蠶微孢子蟲(chóng)中出現(xiàn)2個(gè)雜交信號(hào)，且大小位置不一，以此可以作為區(qū)分家蠶微孢子蟲(chóng)和柞蠶微孢子蟲(chóng)的靶標(biāo)。因此，可將Nbslp2作為蠶業(yè)生產(chǎn)上潛在的檢測(cè)靶標(biāo)。endprint

研究人員對(duì)兔腦炎微孢子蟲(chóng)中2個(gè)類枯草桿菌蛋白酶（slp1和slp2）轉(zhuǎn)錄活性分析后發(fā)現(xiàn)，由芽體分化為母孢子的過(guò)程中它們的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)3倍[14]；同樣對(duì)家蠶微孢子蟲(chóng)在感染家蠶不同時(shí)期Nbslp1的轉(zhuǎn)錄活性進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)Nbslp1在家蠶微孢子蟲(chóng)感染家蠶1 d后就有轉(zhuǎn)錄，暗示其可能在侵染初期發(fā)揮作用[12]；據(jù)此推測(cè)家蠶微孢子蟲(chóng)類枯草桿菌蛋白酶Nbslp2在微孢子蟲(chóng)的增殖發(fā)育過(guò)程中可能也發(fā)揮重要作用。隨后的轉(zhuǎn)錄活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Nbslp2在感染家蠶微孢子蟲(chóng)后72 h檢測(cè)到轉(zhuǎn)錄，并且該轉(zhuǎn)錄活性會(huì)隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)有逐漸減弱的趨勢(shì)，這一結(jié)果暗示著Nbslp2可能在家蠶微孢子蟲(chóng)感染家蠶早期發(fā)揮重要作用。鑒于上述的預(yù)測(cè)和分析結(jié)果，后續(xù)將開(kāi)展對(duì)Nbslp2基因的研究。

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