羅 力 李 偉 羅 丹 安 宇 袁 軍

(貴州醫(yī)科大學免疫學教研室，貴陽 550004)

雌激素受體1基因rs2046210位點多態(tài)性與乳腺癌患病風險性關系初步研究①

羅 力 李 偉②羅 丹 安 宇 袁 軍③

(貴州醫(yī)科大學免疫學教研室，貴陽 550004)

目的探討雌激素受體1基因(Estrogen receptor 1，ESR1)周圍區(qū)域單核苷酸多態(tài)(Single nucleotide polymorphism，SNP)位點rs2046210 與女性乳腺癌發(fā)生的相關性。方法選取114例乳腺癌患者的組織切片和141 例健康對照者的外周血，抽提基因組DNA，采用Taqman 探針法檢測SNP位點rs2046210的基因型，計算基因型與基因頻率，先檢測Hardy-Weinberg平衡性，然后采用χ2檢驗進行組間比較。結(jié)果經(jīng)檢測rs2046210等位位點T、C及其三種基因型CC、TC、TT 均符合Hardy-Weinberg平衡性定律，具有群體代表性(χ2值分別為2.78、 2.95，v=1,P均>0.05)。等位位點T、C在乳腺癌組的分布頻率為43.40%、56.60%，在健康組的分布頻率為38.30%、61.70%。兩組比較差異無統(tǒng)計學意義(P<0.05)，該位點等位基因在病例組與對照組的分布無明顯差別。多態(tài)性位點的三種基因型CC、TC、TT在乳腺癌的頻率分別為35.75%、11.35%和53.90%，對照組35.96%、22.81%和41.22%，兩組間比較差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.05)。進一步比較發(fā)現(xiàn)，基因型CC/TT在兩組中分布差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),相對風險比值OR為1.94(0.92～4.1,95%CI)，基因型CC/TC在兩組中分布差異無統(tǒng)計學意義(P=0.228>0.05),相對風險比值OR為0.74(0.43～1.28,95%CI),而基因型TT/TC在兩組中分布差異有顯著統(tǒng)計學意義(P=0.008<0.05)。結(jié)論在貴州地區(qū)人群，雌激素受體1基因rs2046210位點的單核苷酸多態(tài)性可能與乳腺癌的遺傳易感性相關，特別是rs2046210 TT基因型可能增加個體患乳腺癌的風險，而CC基因型降低了乳腺癌的患病風險。

rs2046210；單核苷酸多態(tài)性；乳腺癌；遺傳易感性X

乳腺癌是危害婦女健康的常見惡性腫瘤之一，居全球女性腫瘤的首位。ESR1是核受體超家族的成員，參與雌激素靶細胞中抗雌激素與雌激素之間的作用。ESR1還能與雌激素結(jié)合后轉(zhuǎn)移到乳腺癌細胞核，促進乳腺癌細胞的生長，ESR1受BRCA1和BRCA2的共同調(diào)節(jié)，并調(diào)控著乳腺癌細胞的生長與凋亡，ESR1與BRCA1和BRCA2一起成為乳腺癌致病過程中重要的易感基因[1-2]。已證實ESR1中的一些易感基因位點與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展有一定相關性[3]。本次研究的易感基因位點是通過研究GWAS篩選出的rs2046216位點。目前國內(nèi)外關于該位點與貴州省女性乳腺癌的關系無相關報道，因此，本課題通過探討rs2046216位點與貴州省女性乳腺癌患病風險的關系，為進一步研究乳腺癌的基因發(fā)病機制，甄選乳腺癌快速診斷基因芯片位點，健全乳腺癌風險評估平臺，尋找乳腺癌的監(jiān)測、治療、診斷和預防等分子標志物提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1研究對象

1.1.1健康對照者 對照組采用141名健康人全血。健康對照組人群年齡范圍為8～62歲，平均年齡為35歲，具體年齡分布如圖1所示。臨床和實驗室檢查均正常，通過咨詢和調(diào)查，其直系三代無腫瘤病史。對所有參加對照組的人群均通過倫理學宣講，所有參加本研究者均簽署知情同意書，本試驗符合1983 年頒布的赫爾辛基宣言，獲得貴州省人民醫(yī)院倫理委員會批準。并填寫《健康信息調(diào)查表》注明年齡和受調(diào)查人、直系親屬腫瘤調(diào)查信息等。

圖1 141名健康對照組人群年齡分布圖(%)Fig.1 141 healthy people with different age distribution graph(%)

1.1.2乳腺癌患者 收集貴州省人民醫(yī)院和貴陽市第一人民醫(yī)院2003年到2011年間無血緣關系的114例女性乳腺癌患者和對照者的標本。乳腺癌組采用衛(wèi)生部制定的診斷標準，其中包含：①乳腺的X線診斷；②乳房檢查；③病史；④磁共振檢查；⑤乳腺導管鏡的檢查。最終通過針刺細胞活檢，由病理切片確診。標本的癌型共4種，即浸潤性非特殊型癌、浸潤性特殊型癌、非浸潤性癌及早期浸潤性癌(圖2)。

1.1.3標本收集 標本收集時，健康組采取血液3～5 ml加入真空采血管(肝素抗凝)。收集好的標本，編號后保存在-20℃低溫冷凍冰箱。病例組收集石蠟切片。

1.2實驗方法

1.2.1基因提取 外周血標本采用TIANGEN公司的血液基因組DNA提取試劑盒按說明書進行DNA抽提。石蠟切片標本的DNA抽提采用OMEGA公司生產(chǎn)的石蠟切片DNA抽提試劑盒按說明書進行操作。回收得到的DNA片段采用紫外分光光度計檢測DNA的濃度和純度。定量后的DNA置于-80℃保存。

1.2.2基因型檢測 本研究采用Taqman 探針法，美國ABI公司設計的rs2046210基因探針，ABI STEP ONE PLUS熒光定量PCR儀對rs2046210位點進行檢測，對rs2046210位點進行基因分型。PCR反應體積為10 μl，反應條件為：95℃ 10 min預變性，95℃ 15 s變性，60℃ 1 min退火，共40個循環(huán)。

1.3統(tǒng)計學分析 用SPSS19.0軟件包進行統(tǒng)計學分析，基因型分布用 Hardy-Weinberg 平衡檢驗進行分析；用χ2檢驗、比值比(OR)和95%置信區(qū)間(CI)分析各組基因數(shù)和基因型頻率分布和乳腺癌易感性的關系。所有統(tǒng)計學檢驗均為雙側(cè)概率檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

圖2 114名乳腺癌患者四種類型癌所占比例圖(%)Fig.2 114 breast cancer patients with four types of cancer accounts for example graph(%)

2 結(jié)果

2.16q25.1的rs2046210等位基因SNPs分型的結(jié)果 rs2046210位點等位基因頻率在確認的114例乳腺癌患者和141名健康對照者中的分布，見表1。

2.2rs2046210等位基因和基因型在健康組和乳腺癌組中的遺傳平衡性檢驗 rs2046210等位基因在健康組和乳腺癌組中的遺傳平衡性檢驗，即是否符合Hardy-Weinberg平衡定律。根據(jù)鐘克波等[4]提供的方法計算出統(tǒng)計量χ2為0.71，當自由度為1時，P>0.05。經(jīng)統(tǒng)計分析說明等位基因T和等位基因C遺傳性分布在群體中無顯著性差異，具有群體代表性(表2)。rs2046210基因型在健康對照組和乳腺癌組的分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05),表明研究對象具有群體代表性(表3)。

2.36q25.1 rs2046210基因型頻率在健康組和乳腺癌組患病風險研究 如表4所示，6q25.1 rs2046210基因型頻率在健康組和乳腺癌組間的比較。兩組基因型經(jīng)統(tǒng)計分析P<0.05，兩組間差別有

表1rs2046210等位基因頻率在健康組和乳腺癌組中的分型結(jié)果

Tab.1rs2046210alleledistributionintwogroups

GroupsnAllelenumber[Allelefrequency(%)]TCHealthy14192(42.40)125(57.60)Patients11473(45.34)88(54.66)

表2等位基因在健康組和乳腺癌組中的遺傳平衡性檢驗

Tab.2Geneticequilibriumtestofallelesintwogroups

Groupsn[Allelefrequency(%),Theoreticalfrequency(%)]TCχ2P(v=1)Healthy14192(42.40,38.3)125(57.60,61.7)0.710.5>P>0.25Patients11473(45.34,43.4)88(54.66,56.6)0.150.9>P>0.75

統(tǒng)計學意義。說明基因型CC、基因型TT和基因型TC在健康組和乳腺癌組間存在差別。

進一步比較純合子CC基因型、純合子TT基因型和雜合子TC基因型在健康對照組和乳腺組的分布差異，兩兩比較結(jié)果見表5。結(jié)果表明雜合子TC與純合子TT在健康組和病例組間差異有統(tǒng)計學意義(P=0.008 <0.05)。而在其他兩組間的比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。在基因型的組間比較中，OR>1，表明TT基因型的增加能增加患病風險，而CC基因型的增加，則降低乳腺癌的發(fā)病風險。

3 討論

乳腺癌是女性發(fā)病率較高的惡性腫瘤，約占所有惡性腫瘤的7%～10%。我國的城市女性乳腺癌發(fā)病率一直穩(wěn)居腫瘤首位，達到49.25/100 000[5]。乳腺癌易感基因位點的多態(tài)性是近年的研究熱點，多國學者都在尋找與乳腺癌發(fā)病最為相關的或與本國婦女的乳腺癌發(fā)病相關的位點，以期在乳腺癌的預防、治療、監(jiān)測上發(fā)揮效應。在不同種族、不同地區(qū)、不同環(huán)境，不同的SNPs位點對乳腺癌的患病風險都存在不同的影響。因此，尋找乳腺癌中SNPs突變位點成為眾多研究者的熱點[6]。其中中國學者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)SNP rs2046210與中國婦女乳腺癌發(fā)病的一些相關性[7]。SNP rs2046210 位于6號染色體第97開放閱讀框架(the chromo-ome 6 open reading frame 97，C6orf97)下游，C6orf97編碼蛋白C端具有一個染色體結(jié)構維護區(qū)域，該區(qū)域與染色體的動態(tài)平衡密切相關，其編碼的ERα蛋白可以通過與雌激素相結(jié)合從而調(diào)節(jié)雌激素代謝，在乳腺癌的發(fā)病中發(fā)揮重要作用。rs2046210作為乳腺癌的風險基因位點，Zheng等[8]發(fā)現(xiàn)rs2046210位點對于乳腺癌有強烈的提示作用，而且在乳腺癌的三個病程階段中都能全程檢測出來，但是rs2046216位點與貴州省女性患乳腺癌的風險的關系并不清楚。本研究樣本rs2046210位點基因和基因型經(jīng)Hardy-Weinberg遺傳性平衡定律檢驗，P>0.05，說明本研究樣本具有良好群體代表性。rs2046210位點中等位基因T和C的頻率在人群中的分布無差異。rs2046210位點的三種基因型CC、TC、TT健康人群和乳腺癌患病人群中的分布有差異，基因型CC人群乳腺癌的患病風險較低，而基因型TT人群乳腺癌的患病風險較高。

表4rs2046210基因型頻率在健康組和乳腺癌組間的比較

Tab.4Comparisonofgenotypefrequencyofrs2046210betweentwogroups

GroupsnGenetypeCCTTTCPHealthy1414916760.028Patients114412647

表5rs2046210基因型在健康組和乳腺癌組間比較及患病風險

Tab.5Comparisonofrs2046210genotypebetweentwogroupsandriskdetection

GroupsCC/TTCC/TCTT/TCOR(95%CI)1.94(0.92-4.10)0.74(0.43-1.28)/P0.080.2820.008

Note：Taking the CC allele for reference,the OR (95%CI) andPvalue are results by comparing the healthy group with patients group.

表3rs2046210基因型頻率在健康組和病例組中的Hardy-Weinberg平衡定律檢驗

Tab.3Geneticequilibriumtestofgenotypefrequencyofrs2046210intwogroups

Groupsn[Allelefrequency(%),Theoreticalfrequency(%)]CCTTTCχ2P(v=1)Healthy14149(34.75,53.68)16(11.35,20.68)76(55.90,66.64)2.780.10>P>0.05Patients11441(35.96,36.52)26(22.81,21.47)47(41.23,56.01)2.950.10>P>0.05

總之，乳腺癌的易感基因與腫瘤的臨床病理特征、相關基因以及種族、地域等都有聯(lián)系。本研究結(jié)果與相關資料表明：6q25.1的rs2046210位點基因多態(tài)性與乳腺癌的患病風險相關，并且在病程的全程都能監(jiān)測到，有可能作為貴州女性乳腺癌監(jiān)控的候選基因位點，對乳腺癌的預防、早期篩查、臨床診治及預后監(jiān)測可能有積極作用，但其是否適用于所有中國女性，尚需國內(nèi)更多大樣本研究的數(shù)據(jù)支持和驗證，并需對該位點多態(tài)性與乳腺癌易感性相關的作用機制做進一步的探討。

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[收稿2017-07-04]

(編輯 張曉舟)

Relationshipbetweenestrogenreceptor1rs2046210polymorphismandsusceptibilitytobreastcancer

LUOLi，LIWei,LUODan,ANYu,YUANJun.

DepartmentofImmunology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China

Objective:To investigate the association of a single nucleotide polymorphism (SNP),rs2046210 of the peripheral region of the estrogen receptor 1 gene(ERS1)with women breast cancer.MethodsGenomic DNA from 255 individuals of Guizhou women,including 114 tissue slices of diagnosis of breast cancer patients and 141 healthy people,and their peripheral blood were analyzed for the SNP rs2046210 of the ESR1 gene.rs2046210 was genotyped by polymerase chain reaction.A Chi-square test was used to determine the association of SNP with breast cancer.ResultsThe results showed that rs2046210 genotype in healthy and breast cancer cluster distributions were consistent with Hardy-Weinberg equilibrium(χ2value 2.78 and 2.95 respectively,v=1,P>0.05),and the research objects were group representation.The frequency of C and T allele were 56.60% and 43.40% respectively in breast cancer patients，while 61.70% and 38.30% in healthy controls.There was no significant difference between these two groups(P>0.05).The frequencies of genotypes CC，CT and TT of SNP rs20462101 were 35.96%,22.81% and 41.22% respectively in breast cancer，which were different from controls,35.75%,11.35% and 53.90% respectively(P<0.05).Further comparisons revealed that genotype CC/TT in the two group distribution was not different(P>0.05)and the relative risk ratio OR was 1.94(0.92-4.1,95%CI).Genotype CC/TC in the two group distribution was not different(P=0.228>0.05)and relative risk ratio was 0.74(0.43-1.28,95%CI),while the genotype TT/TC in the two group distribution was significant difference(P=0.008<0.05).Conclusionrs2046210 polymorphism has a potential to be a susceptibility factor for women breast cancer，and rs2046210 TT genotype may increase an individual′s risk of breast cancer,while the CC genotype increment may reduce the risk of breast cancer.

rs2046210;Single nucleotide polymorphism;Breast cancer;Genetic susceptibility

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.11.018

①本文受貴州省科學技術基金(黔科合基礎[2016]1093)、貴州省科技廳聯(lián)合基金(黔科合[2015]7167)、貴州省人民醫(yī)院博士基金(GZSYBS[2015]04)和貴州省科技廳院士工作基金[黔科合院士站([2015]4015)]資助。

②并列第一作者。

③金陽醫(yī)院檢驗科，貴陽 550081。

R392.2

A

1000-484X(2017)11-1685-04

羅 力(1992年-)，女，在讀碩士，主要從事腫瘤免疫方面的研究，E-mail：514884295@qq.com。

及指導教師：袁 軍(1970年-)，女，博士，教授，主要從事腫瘤免疫方面的研究，E-mail:junyuan99430@163.com。