李艷珍 和榮麗 陸 利

(山西醫(yī)科大學(xué)汾陽(yáng)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系,汾陽(yáng) 032200)

米力農(nóng)對(duì)LPS誘導(dǎo)下人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響①

李艷珍 和榮麗②陸 利②

(山西醫(yī)科大學(xué)汾陽(yáng)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系,汾陽(yáng) 032200)

目的觀察米力農(nóng)對(duì)LPS誘導(dǎo)下人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(HCAEC)炎癥反應(yīng)及NF-κB的影響。方法體外培養(yǎng)HCAEC，分為正常組、LPS組(1 μg/ml)、米力農(nóng)50 μmol/L組和米力農(nóng)200 μmol/L組，后兩組均與LPS共同孵育24 h。分別采用qRT-PCR和ELISA檢測(cè)IL-6、IL-8、TNF-α的mRNA和蛋白水平，分別采用Western blot和免疫熒光法檢測(cè)NF-κB活化和核移位。結(jié)果與LPS組相比，米力農(nóng)顯著降低HCAEC的IL-6、IL-8、TNF-α的mRNA和蛋白表達(dá)；抑制NF-κB活化和核移位(P<0.05)，且呈一定量效關(guān)系。結(jié)論米力農(nóng)可通過(guò)抑制NF-κB活化而降低LPS誘導(dǎo)的HCAEC 釋放炎癥因子。

米力農(nóng)；HCAEC；炎癥；NF-κB

心力衰竭(簡(jiǎn)稱(chēng)“心衰”)是各種器質(zhì)性心臟疾病發(fā)展的終末階段，是心臟病患者主要死亡因素之一。對(duì)于心衰發(fā)病機(jī)制的探討，目前尚無(wú)定論，但有研究表明神經(jīng)體液激活、心肌細(xì)胞凋亡、心室重構(gòu)、炎癥等均在此過(guò)程中扮演了重要角色。其中，炎癥因子具有促進(jìn)心室重構(gòu)、負(fù)性肌力等作用，可影響心肌代謝、誘發(fā)和加重心衰，是心力衰竭患者死亡的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子[1-3]。因此，抗炎也是心衰的重要手段之一。

米力農(nóng)是一種磷酸二酯酶抑制劑，具有增加心排量、減輕前后負(fù)荷、擴(kuò)張血管等多重作用，可用于多種心衰的治療[4，5]。也有少量報(bào)道發(fā)現(xiàn)其可減少心衰患者炎癥因子的釋放[6，7]，但具體機(jī)制不明。本文觀察了米力農(nóng)對(duì)LPS誘導(dǎo)下人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(HCAEC)炎癥反應(yīng)的影響，并探討可能的機(jī)制，以期為其臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株 原代人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(HCAEC)購(gòu)自美國(guó)ScienCell公司。實(shí)驗(yàn)中使用傳到5～6代的細(xì)胞。

1.1.2主要儀器 WATER JACKET二氧化碳培養(yǎng)箱(ASTEC公司)；AX10 vert A1熒光顯微鏡(Carl Zeiss AG公司)；ELX800多功能酶標(biāo)儀(Bio-TEK公司)；Bio-Rad電泳系統(tǒng)、Bio-Rad轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)(Bio-Rad Laboratories)；Heto Ultra Freeze超低溫冰箱(Thermo Scientific公司)；CR-21高速冷凍離心機(jī)(Hitachi公司)；7500 型實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems公司)。

1.1.3主要試劑 米力農(nóng)、LPS(Sigma公司)；ECM、胎牛血清、胰酶(Gibco公司)；Trizol、PremixTaqTM、One Step Prime Script RT-PCR Kit(日本TaKaRa公司)；IL-6、IL-8、TNF-α ELISA試劑盒(R&D公司)P-NF-kappaB p65 mAb、NF-kappaB p65 mAb、GAPDH mAb(Abcam公司)。

1.1.4細(xì)胞培養(yǎng)和分組 HCAEC培養(yǎng)于含10%胎牛血清的ECM培養(yǎng)液中，在37℃、5%CO2的飽和濕度孵箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCAEC，以1×105個(gè)/ml細(xì)胞濃度接種于6孔板，分為正常組、LPS組(1 μg/ml)、米力農(nóng)50 μmol/L組、米力農(nóng)200 μmol/L組，后兩組均與LPS共同孵育。加入不同藥物后均培養(yǎng)24 h。

1.2方法

1.2.1qRT-PCR Trizol法抽提細(xì)胞總RNA，所有樣品A260/A280比值為1.8～2.0?？俁NA定量后，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，-80℃凍存。參照文獻(xiàn)[8]，相關(guān)因子引物/探針序列見(jiàn)表1，由華大基因合成。所有樣品熱變性30 s，40個(gè)循環(huán)，包括95 ℃ 5 s、60 ℃ 40 s。以GAPDH為內(nèi)參，應(yīng)用2-ΔΔCT法計(jì)算各因子基因表達(dá)相對(duì)量的變化。

表1IL-6、IL-8、TNF-α引物/探針序列

Tab.1Specificprimers/probesequencesofIL-6,IL-8andTNF-α

GenePrimer/probesequencesIL-6Forwardprimer5'-CGGGAACGAAAGAGAAGCTCTA-3'Reverseprimer5'-CGCTTGTGGAGAAGGAGTTCA-3'Probe5'-FAM-TCCCCTCCAGGAGCCCAGCT-3'TAMRAIL-8Forwardprimer5'-TTGGCAGCCTTCCTGATTTC-3'Reverseprimer5'-TATGCACTGACATCTAAGTTCTTTAGCA-3'Probe5'-FAM-CCTTGGCAAAACTGCACCTTCACACA-3'TAMRATNF-αForwardprimer5'-AACATCCAACCTTCCCAAACG-3'Reverseprimer5'-GACCCTAAGCCCCCAATTCTC-3'Probe5'-FAM-CCCCCTCCTTCAGACACCCTCAACC-3'TAMRAGAPDHForwardprimer5'-CAAGCAGAAGTGGGTTCAGGAT-3'Reverseprimer5'-AGTGAGTGTTCAAGTCTTCGGAGTT-3'Probe5'FAM-CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC-3'TAMRA

1.2.2ELISA 收集細(xì)胞上清液，離心棄沉淀，ELISA法檢測(cè)其中IL-6、IL-8、TNF-α蛋白含量。嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。

1.2.3Western blot 吸去上清，使用蛋白裂解液冰上充分裂解、提取總蛋白。BCA法蛋白定量，固定上樣量為30 μg，SDS-PAGE電泳分離、轉(zhuǎn)膜至PVDF膜、封閉。一抗溶液(1∶1 000)4℃孵育過(guò)夜；TBST洗滌，二抗溶液(1∶5 000)室溫孵育1 h，TBST洗滌。曝光、顯影、定影，采用phosphor-圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行灰度掃描分析。

1.2.4免疫熒光 吸去上清，PBS洗滌，4%多聚甲醛固定；0.5%Triton(X-100)打孔；置5%BSA濕盒室溫封閉30 min；吸去封閉液，加入一抗(1∶100)，4℃孵育過(guò)夜；滴加FITC標(biāo)記的二抗，37℃避光孵育1 h；DAPI染細(xì)胞核10 s；甘油封片，鏡下拍照。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS21.0軟件包進(jìn)行處理，計(jì)量資料采用t或F檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1米力農(nóng)對(duì)相關(guān)因子mRNA表達(dá)的影響 以米力農(nóng)共同孵育，可顯著抑制LPS誘導(dǎo)的IL-6、IL-8、TNF-α mRNA的表達(dá)(P<0.05)，且這種抑制作用具有劑量依賴(lài)性。如圖1所示。

2.2米力農(nóng)對(duì)相關(guān)因子蛋白含量的影響 以米力農(nóng)共同孵育，可顯著抑制LPS誘導(dǎo)的IL-6、IL-8、TNF-α 蛋白的釋放(P<0.05)，且這種抑制作用具有劑量依賴(lài)性。如表2所示。

2.3米力農(nóng)對(duì)NF-κB的影響 LPS可促進(jìn)pNF-κB p65移位進(jìn)入HCAEC胞核，誘導(dǎo)pNF-κB p65高表達(dá)。以米力農(nóng)共同孵育，可顯著抑制上述作用(P<0.05)，且具有劑量依賴(lài)性。如圖2所示。

圖1 各細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平比較Fig.1 Comparison of cytokine mRNA expressionsNote: A.IL-6；B.IL-8；C.TNF-α；compared with LPS group,*.P<0.05.

GroupsIL-6IL-8TNF-αNormalgroup8.50±1.212)25.68±7.392)15.32±4.282)LPSgroup46.63±7.331)94.48±28.471)207.11±31.541)Milrinone(50μmol/L)group37.22±5.501)2)70.77±10.392)136.80±23.852)Milrinone(200μmol/L)group21.58±3.431)2)46.32±6.611)2) 86.22±10.121)2)

Note：Compared with normal group,1)P<0.05;compared with LPS group,2)P<0.05.

圖2 米力農(nóng)抑制HCAEC胞內(nèi)NF-κB活化Fig.2 Milrinone inhibited LPS-induced NF-κB activationNote: A.Representative Western blot;compared with LPS group,*.P<0.05;B.Immunofluorescence microscopy analysis was performed for identification of NF-κB p65 translocation.

3 討論

血管內(nèi)皮細(xì)胞是血管壁的重要組成部分，在維持血管張力、調(diào)節(jié)血壓、保持血液的正常流動(dòng)等方面發(fā)揮著重要作用。動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙參與了多種心血管疾病，如動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、心衰等的發(fā)生和發(fā)展。因此，本研究選擇人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(HCAEC)為研究對(duì)象。

已有研究顯示，多種細(xì)胞因子參與了心室重構(gòu)的病理過(guò)程。其中，IL-6是左室重構(gòu)過(guò)程中潛在的重要因素，大鼠體內(nèi)注射IL-6可導(dǎo)致左室心肌肥大，心室肌硬度增加。IL-8 由內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生，對(duì)中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞具有明顯趨化作用。心衰患者血循環(huán)中IL-6水平的持續(xù)增加與左室功能降低密切相關(guān)。作為一種重要的炎癥因子，TNF-α主要由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，在心衰等應(yīng)急狀態(tài)下心肌細(xì)胞也可產(chǎn)生，并引起多種生物學(xué)效應(yīng)，包括加速心肌細(xì)胞中的肌動(dòng)蛋白、肌球蛋白合成并降低分解，引起心肌肥厚等。此外，心力衰竭時(shí)，IL-1β、IL-6、TNF-α等細(xì)胞因子水平上升，參與調(diào)節(jié)心室功能，在心肌重構(gòu)中起到重要的作用[9-11]。

本文結(jié)果顯示，體外以LPS誘導(dǎo)下，可刺激HCAEC產(chǎn)生的IL-6、IL-8、TNF-α的基因及蛋白表達(dá)水平顯著提高，表明此時(shí)細(xì)胞受損較嚴(yán)重。而以米力農(nóng)共同孵育，可明顯降低上述因子mRNA及蛋白含量，且有良好的量效關(guān)系。

作為一個(gè)多功能核轉(zhuǎn)錄因子，NF-κB與心肌細(xì)胞凋亡、平滑肌細(xì)胞增殖和炎癥反應(yīng)等多種生理、病理反應(yīng)關(guān)系密切。NF-κB活化后，可啟動(dòng)多種下游基因轉(zhuǎn)錄，包括TNF-α、IL-6、IL-8等，參與多種生物學(xué)反應(yīng)[12]。持續(xù)激活NF-κB可通過(guò)促炎癥、促纖維化及促凋亡等機(jī)制加速心室重構(gòu)[3，13]。

本文研究發(fā)現(xiàn)，以米力農(nóng)共同孵育，可明顯抑制LPS誘導(dǎo)的HCAEC的NF-κB磷酸化和核移位，且隨著藥物濃度的升高，上述抑制作用明顯增強(qiáng)。推測(cè)通過(guò)抑制NF-κB，米力農(nóng)可下調(diào)多種炎癥因子的表達(dá)，從而減輕心肌損傷、延緩病情。對(duì)于米力農(nóng)對(duì)NF-κB的影響，目前僅有兩篇報(bào)道。Chanani等[14]以LPS或TNF-α刺激原代大鼠心肌細(xì)胞，以米力農(nóng)共同孵育，凝脈電泳遷移率變動(dòng)分析(Gel electrophoretic mobility shift assay，EMSA)研究顯示，米力農(nóng)對(duì)LPS刺激下的NF-κB活化無(wú)作用，但可增強(qiáng)TNF-α刺激下的NF-κB活化。這與本文結(jié)果不一致，可能與所選細(xì)胞不同有關(guān)。Jung等[15]將30只C57BL/6小鼠分為三組，每組10只。其中，S組僅接受右腎切除術(shù)，C組在右腎切除后左腎結(jié)扎缺血30 min，M組在缺血前腹腔注射5 μg/kg米力農(nóng)。灌注24 h后，測(cè)定血肌酐，腎病理及NF-κB、炎癥因子。與S組相比，C組、M組血肌酐均顯著升高，但M組顯著低于C組。C組腎病理?yè)p傷最重，M組明顯改善。與S組相比，C組、M組NF-κB、TNF-α、ICAM-1、MCP-1、MIP-2 mRNA表達(dá)增高(P<0.05)，但M組上述指標(biāo)均顯著低于C組。并推測(cè)米力農(nóng)通過(guò)抑制NF-κB活化而提高腎功能、減輕組織損傷。但米力農(nóng)對(duì)LPS誘導(dǎo)下HCAEC的NF-κB活化的影響，本文為國(guó)內(nèi)外首次報(bào)道。

綜上，體外研究表明米力農(nóng)通過(guò)抑制NF-κB活化而降低HCAEC釋放炎癥因子，且有一定量效關(guān)系。然而細(xì)胞的體外培養(yǎng)不能完全反映正常機(jī)體的情況，因此，后續(xù)擬構(gòu)建動(dòng)物模型進(jìn)一步驗(yàn)證。

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[收稿2017-07-04 修回2017-07-28]

(編輯 倪 鵬)

EffectsofmilrinoneonLPS-inducedinflammationofhumancoronaryarteryendothelialcells

LIYan-Zhen,HERong-Li，LULi.

FenyangCollegeofShanxiMedicalUniversityDepartmentofClinicalMedicine，F(xiàn)enyang032200，China

Objective:To observe the effects of milrinone on LPS-induced inflammation and NF-κB activation of human coronary artery endothelial cells (HCAEC).MethodsHCAEC were cultured in vitro,and were divided into normal group,LPS group (1 μg/ml),milrinone 50 μmol/L group and milrinone 200 μmol/L group,the rear two groups were co-incubated with LPS for 24 h.qRT-PCR and ELISA was applied to detect IL-6,IL-8,TNF-α mRNA and protein,respectively.Western blot and immunofluorescence assay was used to observe the activation and translocation of NF-κB,respectively.ResultsCompared with LPS group,the IL-6,IL-8,TNF-α mRNA and protein;the activation and translocation of NF-κB significantly inhibited after incubation with milrinone (P<0.05) in a dose dependent manner.ConclusionMilrinone inhibited the release of inflammative cytokines induced by LPS of HCAEC in vitro,partly by inactivation of NF-κB.

Milrinone;HCAEC;Inflammation;NF-κB

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.11.023

①本文為山西省高等學(xué)?？萍柬?xiàng)目(No.21021005)。

②山西醫(yī)科大學(xué)，太原 030000。

R453.9

A

1000-484X(2017)11-1709-04

李艷珍(1982年-)，女，碩士，講師，主要從事心血管疾病方面的研究。