王 榮 陸玉蘭 黃華佗 覃海媚 藍 艷 王俊利 劉純宏 韋葉生

(右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院檢驗科，百色 533000)

白細胞介素-13基因錯義突變rs20541C/T多態(tài)性在廣西人群中的分布①

王 榮 陸玉蘭 黃華佗 覃海媚 藍 艷②王俊利 劉純宏 韋葉生

(右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院檢驗科，百色 533000)

目的分析IL-13基因rs20541C/T位點多態(tài)性在廣西人群中的分布特點，同時比較其在不同種群之間的分布差異。方法采用多重單堿基延伸技術(shù)(SNaPshot)和DNA直接測序法對275例廣西人群IL-13基因rs20541C/T進行分型，并分析其基因型及等位基因的分布頻率。檢測結(jié)果與NCBI中人類基因組國際單體圖(HapMap)公布的其他種群(歐洲人、北京人、日本人、非洲人)和文獻報道的天津人的基因型及等位基因數(shù)據(jù)進行比較。結(jié)果IL-13基因rs20541C/T在廣西人群中具有多態(tài)性，CC、CT和TT基因型頻率分別為40.0%、46.2%、13.8%，C和T等位基因頻率分別為63.1%、36.9%。其基因型及等位基因的分布頻率在男女性別之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，其基因型與歐洲、非洲、天津人群作比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，等位基因分布頻率與這5種人群相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)論IL-13基因rs20541C/T基因多態(tài)性在不同種族和地區(qū)間存在著不同程度差異。

IL-13基因；多態(tài)性；錯義突變；種族

白細胞介素-13(Interleukin-13，IL-13)是由Th2細胞、CD8+T細胞、NK細胞等分泌的細胞因子。在全身廣泛分布，具有多種生物學活性。IL-13和其受體緊密結(jié)合后可形成高親和力復合物，并激活Janus蛋白激酶/信號轉(zhuǎn)導子及轉(zhuǎn)錄激活子(JAK/STAT)信號通路，進而影響IgE合成及肥大細胞的生長和發(fā)育，從而在免疫反應過程中發(fā)揮著重要作用[1，2]。最新研究表明，IL-13與銀屑病、類風濕關(guān)節(jié)炎等免疫相關(guān)疾病的發(fā)生過程密切相關(guān)[3，4]。有數(shù)據(jù)顯示，IL-13血清水平在潰瘍性結(jié)腸炎、系統(tǒng)性硬化癥中顯著升高[5，6]，提示 IL-13可能是某些疾病的防治靶標及生物標記。隨著對基因與疾病關(guān)系的深入探討和分子生物技術(shù)的快速發(fā)展，IL-13基因多態(tài)性對疾病的關(guān)系成為近年來研究的熱點。本文研究IL-13基因啟動子區(qū)的錯義突變rs20541C/T位點基因多態(tài)性分布，并與不同種群分型數(shù)據(jù)比較，有助于了解IL-13基因多態(tài)性在不同種族中的分布，也可為進一步研究其與疾病的關(guān)系提供基礎(chǔ)的遺傳學參考資料。

1 對象與方法

1.1研究對象 選自我院體檢中心的健康者275例。男103例，女172例。年齡17～75歲。排除心腦血管、感染性及自身免疫性疾病等。上述研究對象均來自廣西地區(qū)，且無血緣關(guān)系。受試者均簽署知情同意書。本研究獲得本院倫理委員會審批。

1.2方法

1.2.1樣本DNA制備 用EDTA-K2抗凝管抽取研究對象靜脈血3 ml，取200 μl血液樣品按北京天根公司的全血液基因組DNA提取試劑盒說明書提取DNA，-70℃保存待用。

1.2.2引物合成 參考IL-13基因rs20541C/T的序列，運用在線軟件primer3.0(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)設計針對rs20541C/T進行特異性擴增的引物，并交由上海天昊生物科技公司合成。rs20541C/T上游引物：5′-TGGAAAGCCCCTGGT-TTGTG-3′，下游引物：5′-TCCCGCCTACCCAAG-ACATTTT-3′，延伸引物：5′-TTTTTTTTTTTTTTTTTT-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCTTTCGAAGTT-TCAGTTGAAC-3′。

1.2.3PCR反應及基因測序 PCR反應體系總共20 μl,包括：1.0 μl樣本DNA、2.0 μl緩沖液、2.0 μl dNTPs、1 U TapDNA聚合酶及上、下游引物各1.0 μl，剩余體積添加滅菌雙蒸水。使用熱啟動Taq

聚合酶(HotstarTaq,Qiagen公司)進行多重PCR擴增。獲得PCR產(chǎn)物經(jīng)蝦堿酶(SAP，Promega公司)和核酸外切酶Ⅰ(EXO1,Epicentre公司)純化后用ABI公司的SNaPshot Multiplex kit進行延伸反應，用SAP酶純化延伸產(chǎn)物后，應用ABI 3730XL儀器檢測。并用GeneMapper 4.1(Appliedbiosystems)分析。運用DNA測序法驗證上述分型結(jié)果。

1.3統(tǒng)計學分析 數(shù)據(jù)用SPSS17.0軟件分析。基因型和等位基因頻率用直接計數(shù)法統(tǒng)計。χ2檢驗用于比較基因多態(tài)性分布差異。Hardy-Weinberg遺傳平衡定律驗證樣本人群選取是否有代表性。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1rs20541C/T位點基因分型 IL-13基因rs20541C/T位點的長度為282 bp。分型結(jié)果顯示，rs20541C/T存在CC、CT、TT三種基因型。測序證實了我們的分型結(jié)果，見圖1。

2.2廣西人群中rs20541C/T的基因多態(tài)性分布 經(jīng)驗證IL-13基因rs20541C/T基因型分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律(P>0.05)，樣本人群有代表性。在廣西人群中，rs20541C/T位點CC、CT、TT基因型頻率分別為40.0%、46.2%和13.8%，C、T等位基因頻率分別為63.1%，36.9%。其基因型和等位基因分布頻率在男女兩組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

圖1 IL-13基因rs20541C/T測序圖Fig.1 Sequencing map of genotype for IL-13 gene rs20541C/T polymorphismNote: The inverted triangles of panels ①-③ indicated CC，CT and TT genotypes,respectively.

表1廣西人群IL-13基因rs20541C/T基因型及等位基因頻率的分布

Tab.1DistributionofgenotypeandallelefrequenciesofIL-13geners20541C/TinGuangxipopulation

GendernGenotypefrequency(%)CCCTTTAllelefrequency(%)CTMale10343(41.7)45(43.7)15(14.6)131(63.6)75(36.4)Female17267(38.9)82(47.7)23(13.4)216(62.8)128(37.2)Total275110(40.0)127(46.2)38(13.8)347(63.1)203(36.9)

Note：Genotype and allele frequencies of rs20541C/T showed no significant difference between male and female(P>0.05).

表2廣西人群IL-13基因rs20541C/T基因型和等位基因頻率在不同種族人群間的比較

Tab.2ComparisonoffrequencyofIL-13geners20541C/Tpolymorphismindifferentethicandregionalgroups

PopulationsnGenotypefrequency(%)CCCTTTAllelefrequency(%)CTGuangxipeople275110(40.0)127(46.2)38(13.8)347(63.1)203(36.9)HapMap-CEU1)226136(60.2)82(36.3)8(3.5)354(78.3)98(21.7)HapMap-HCB2)8642(48.8)36(41.9)8(9.3)120(69.8)172(30.2)HapMap-JPT2)17288(51.2)66(38.4)18(10.4)242(70.3)102(29.7)HapMap-YRI1)226158(70.0)56(24.8)12(5.2)372(82.3)80(17.7)Tianjinpeople[7]1)750367(48.9)308(41.1)75(10.0)1043(69.5)457(30.5)

Note：1)Genotype and allele frequencies,bothP<0.05,compared with the Guangxi people;2)Allele frequencies,P<0.05;genotype,P>0.05.

2.3rs20541C/T基因多態(tài)性在不同種群的比較 廣西人群中 IL-13基因rs20541C/T位點的基因型與歐洲、非洲及天津人群比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。等位基因分布頻率和歐洲、北京、日本、非洲及天津人群相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

3 討論

IL-13位于人類第5號染色體上(5q23.31)，長度為4 600 bp，由4個外顯子、3個內(nèi)含子組成，轉(zhuǎn)錄片段長度為1 283 bp，編碼含有146個氨基酸殘基的IL-13細胞因子。非糖基化的IL-13分子量為12.4 kD，而糖基化后為17 kD，與小鼠IL-13約有58%的同源性[8]。IL-13的表達失調(diào)可以改變宿主的免疫狀態(tài)，從而參與多種免疫相關(guān)性疾病的病理過程。在哮喘疾病的MAPK途徑中，IL-13首先激活細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK1/2)或絲裂原活化蛋白激酶p38，活化的激酶在平滑肌細胞中可誘導產(chǎn)生Eotaxin，還可在單核細胞中誘導生成15-脂肪氧化,繼而在肺組織中誘導生成炎性化學增活劑及蛋白酶，從而參與哮喘疾病[9]。最近研究發(fā)現(xiàn)，IL-13可上調(diào)和乳腺癌細胞一同培養(yǎng)的成纖維細胞SDF-1和EGF表達，使乳腺癌細胞快速增殖[10]。這提示IL-13可能在乳腺癌發(fā)病中起到重要作用。rs20541C/T位點的C等位基因突變?yōu)門等位基因?qū)е戮彼岜惶鎿Q為谷氨酸，這一突變與疾病相關(guān)性的研究出現(xiàn)結(jié)果不一致的情況。Seyfizadeh等[11]研究IL-13基因rs20541C/T位點多態(tài)性與硬化癥的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)攜帶TT基因型可增加多發(fā)性硬化癥患病風險高達2.9倍，T等位基因增加1.9倍風險。但是，Broen等[12]的研究結(jié)果顯示，rs20541C/T位點的多態(tài)性和硬化癥發(fā)病無關(guān)。上述2個研究中選取的研究對象屬于不同地區(qū)的人群，這有可能導致2個研究人群的遺傳背景有差異，從而使得與IL-13基因rs20541C/T相關(guān)疾病的發(fā)生出現(xiàn)不同的情況。因此，分析 IL-13基因多態(tài)性位點在不同地區(qū)、種群人群中的分布，這將為探討與IL-13基因相關(guān)疾病在不同族群中的易感性差異提供數(shù)據(jù)支持。

前期，我們研究發(fā)現(xiàn)IL-33基因rs10975521A/T、rs1929992A/G位點在廣西人群中有其獨特的多態(tài)性分布[13]。在此基礎(chǔ)上，本課題組研究發(fā)現(xiàn)，廣西人群IL-13基因rs20541C/T位點存在CC、CT、TT三種基因型，頻率分別為40.0%、46.2%和13.8%，C、T等位基因頻率分別為63.1%、36.9%。其基因多態(tài)性分布頻率在男女之間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，說明這個位點的基因多態(tài)性與性別無關(guān)。其多態(tài)性與歐洲、非洲及日本人群比較存在差異(P<0.05)，顯示出明顯的種族差異性。在與天津人、北京人相比也存在差異(P<0.05)，提示多態(tài)性受不同的地區(qū)影響，遺傳疾病的研究對象宜選取本土人群。這可能是由于廣西的地理位置相對偏遠，飲食習慣存在差異；也可能是受地域、種族的差異阻礙了基因交流，發(fā)生累積效應，導致族群之間產(chǎn)生的遺傳差異。靳霞等[7]發(fā)現(xiàn)，IL-13基因rs20541位點多態(tài)性分布頻率在不同種族和地區(qū)之間存在明顯差異。這些結(jié)果說明，IL-13基因多態(tài)性在不同地區(qū)和種族之間有著明顯差異。這可能是導致一些相關(guān)疾病在不同種族、地區(qū)間所反映出不同的發(fā)病率及臨床表現(xiàn)的原因之一。

總之，我們首次開展對廣西人群IL-13基因rs20541C/T位點多態(tài)性研究，并與不同人群進行比較。不僅提供了IL-13基因多態(tài)性在人類的分布資料，同時為其與相關(guān)疾病的研究奠定了遺傳學方面的基礎(chǔ)。這也提示我們，在今后進行基因和疾病的關(guān)系研究中，我們應該考慮種族差異，開展多個地區(qū)的重復研究，為疾病防治帶來更全面更科學的結(jié)論。

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[收稿2017-03-01 修回2017-05-15]

(編輯 倪 鵬)

Distributionofmissensemutationrs20541C/Tpolymorphismofinterleukin-13geneinGuangxipopulation

WANGRong,LUYu-Lan,HUANGHua-Tuo，QINHai-Mei,LANYan,WANGJun-Li，LIUChun-Hong，WEIYe-Sheng.

DepartmentofLaboratoryMedicine,AffiliatedHospitalofYoujiangMedicalUniversityforNationalities,Baise533000,China

Objective:To analyze the distribution characteristics of IL-13 gene rs20541C/T site polymorphism in Guangxi population and compare the distribution differences among different populations.MethodsIL-13 genotypes were examined by using SNaPshot technique and DNA sequencing in 275 Guangxi people and analyzed the distribution frequencies of allele and genotype in this site.The result compared with the allele and genotype of other populations(Europeans，Beijingers，Japanses and Africans).ResultsThe polymorphism of rs20541C/T of IL-13 gene in Guangxi population existed.The genotype frequencies of CC,CT and TT were 40.0%,46.2% and 13.8% respectively.The frequencies of C and T allele were found to be 63.1% and 36.9%.The polymorphism had no significant difference between male and female(P>0.05).Compared rs20541C/T of IL-13 gene with those of HapMap-CEU,HapMap-YRI and Tianjin people,the distribution frequency of genotypes was significantly different(P<0.05).In this site,there were significant differences of allele frequency when compared with the other five populations(P<0.05).ConclusionThere are different degrees of diversity of rs20541C/T polymorphism of IL-13 gene among different races and regions.

IL-13 gene;Polymorphism;Missense mutation;Ethnic

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.11.017

①本文為國家自然科學基金(81560552，81260234)和廣西醫(yī)療衛(wèi)生適宜技術(shù)開發(fā)與推廣應用項目(S201650)。

②右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院皮膚科，百色 533000。

Q347

A

1000-484X(2017)11-1682-04

王 榮(1991年-)，男，在讀碩士，技師，主要從事分子免疫學研究。

及指導教師：韋葉生(1969年-)，男，教授，主任技師，博士生導師，主要從事分子免疫學研究。