熊艷華 高愛中 汪 毅

(湖北省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，武漢 430015)

·免疫學(xué)技術(shù)與方法·

卡洛芬單克隆抗體的制備

熊艷華 高愛中 汪 毅

(湖北省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，武漢 430015)

目的制備卡洛芬單克隆抗體，為研制卡洛芬的免疫學(xué)快速檢測奠定基礎(chǔ)。方法通過活性酯法制備了以牛血清白蛋白(BSA)為載體的免疫抗原卡洛芬-BSA(Carprofen-BSA)和以卵清白蛋白(OVA)為載體的檢測抗原卡洛芬-OVA (Carprofen-OVA)。通過免疫BALB/c小鼠、雜交瘤技術(shù)獲得穩(wěn)定分泌卡洛芬單抗的細(xì)胞株51C3，并通過變異系數(shù)及添加回收率的測定初步建立了卡洛芬的ELISA檢測方法。結(jié)果將該細(xì)胞株注射BALB/c小鼠制備腹水單抗。腹水純化后效價為1∶3.2×105，屬于IgG1型?？宸覇慰沟撵`敏度為0.32 ng/ml，IC50為0.882 ng/ml。單抗與布洛芬、酮洛芬、萘普生、非諾洛芬、吲哚洛芬、芬布芬的交叉反應(yīng)率均小于0.04%。且豬肉樣品中卡洛芬的添加回收率在81.4%～104.4%之間，變異系數(shù)在16.3%～25.8%之間。結(jié)論本研究成功制備了卡洛芬單克隆抗體，該單抗可以成功應(yīng)用于卡洛芬的ELISA快速檢測，為研制卡洛芬的膠體金快速檢測奠定基礎(chǔ)。

卡洛芬；單克隆抗體；ELISA；膠體金

卡洛芬為一類具有解熱、鎮(zhèn)痛藥理作用的丙酸類的非甾體類抗炎藥物，臨床上用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、急性痛風(fēng)、關(guān)節(jié)外風(fēng)濕病等的止痛[1]。但是近年來被很多養(yǎng)殖戶非法大量用于豬牛羊等的飼養(yǎng)中，卡洛芬在體內(nèi)很難代謝排除，這就導(dǎo)致相當(dāng)高濃度的藥物殘留，而隨著人們對肉、蛋、奶等動物源性食品的需求越來越大，食品安全問題層出不窮，美國、歐盟、日本等發(fā)達國家均已開始對動物源性食品中的非甾體抗炎藥進行殘留監(jiān)控，歐盟明確規(guī)定了美洛昔康、氟尼辛、卡洛芬以及托芬那酸的最大殘留限量(MRLs),其中豬肉中四種藥的MRLs分別是20、50、500和50 μg/kg[2]。目前卡洛芬在動物組織中殘留量的檢測方法有：氣相色譜-質(zhì)譜法、液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、薄層色譜法以及毛細(xì)血管電泳法等[3]。而這些儀器方法需要繁瑣的樣品提取，先進高端的檢測設(shè)備，對操作者自身素質(zhì)要求較高，并且不能快速進行大批量檢測，而ELISA檢測具有簡單、高效、廉價等優(yōu)點。本項研究目的就是研制出靈敏度高、特異性強的卡洛芬單克隆抗體，后續(xù)會繼續(xù)研發(fā)制備美洛昔康、氟尼辛以及托芬那酸等非甾體消炎藥類的單抗，旨在為人們的身心健康提供便利快捷的檢測手段。

1 材料與方法

1.1實驗材料、試劑 卡洛芬及其他標(biāo)準(zhǔn)品(純度均在99%以上)均購自德國Dr·Ehrenstorfer GmbH公司；N,N-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、N,N二甲基甲酰胺(DMF)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、卵清白蛋白(OVA)、牛血清白蛋白(BSA)、辣根過氧化物酶羊抗鼠IgG購自Jackson公司；乙腈(色譜純)、甲酸、無水硫酸鈉、正己烷、3,3,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺、PEG 1500(50%)購自羅氏診斷公司；HAT、HT、DMEM培養(yǎng)液來自Gibco公司；Milli-Q超純水儀(美國Millipore公司)。

洗液(PBST)：0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.4)，加入0.05%Tween-20；包被液(CB)：0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液(pH9.6)；稀釋液和封閉液：PBST中加入1% 的BSA；顯色液：TMB的檸檬酸-磷酸溶液；終止液：2 mol/L的硫酸溶液。

小白鼠： 免疫用6～8周齡雌性BALB/c小鼠(SPF級)，制備腹水用12周齡雄性BALB/c小鼠(SPF級)，購自湖北省實驗動物研究中心由本實驗室飼養(yǎng)。

1.2實驗方法

1.2.1抗原合成[4，5]本文采用活性酯法將卡洛芬上的-COOH與載體蛋白(BSA，OVA)上的-NH2通過形成酰胺鍵偶聯(lián)起來合成完全抗原。該方法稱取卡洛芬54.7 mg(20×1×105mol)放在20 ml小瓶中，加入攪拌子，加4 ml DMF中攪拌溶解，稱取NHS 35 mg(30×1×105mol)，EDC 58 mg(30×1×105mol)，加入上述卡洛芬溶液中，室溫攪拌反應(yīng)15 min。即為活化的卡洛芬活性酯。稱取BSA 0.68 g(1×105mol)放入50 ml 燒杯中，加入16 ml純水及攪拌子到燒杯中，放在磁力攪拌器上攪拌使之溶解。同法合成包被抗原卡洛芬-卵清白蛋白(Carprofen-OVA) 。將卡洛芬活性酯緩慢滴入到BSA溶液中，保持?jǐn)嚢?，之后攪拌反?yīng)2 h。停止攪拌，將反應(yīng)后的Carprofen-BSA溶液用針頭濾器過濾，取上清裝入透析袋中，用生理鹽水或常規(guī)PBS放冰箱4℃透析，2次/d透析液，連續(xù)透析3 d 管分裝備用或凍干，每管1 ml。

1.2.2動物免疫[6]動物免疫一般選取6～8周齡雌性BALB/c小鼠(SPF級)，將24只雌性BALB/c小鼠分成3組，每組8只，第1、2組免疫Carprofen-BSA抗原，第3組用作空白對照組。免疫程序分為基礎(chǔ)免疫和加強免疫，為了增強抗原的免疫原性前3次基礎(chǔ)免疫需加用佐劑，將抗原用生理鹽水稀釋成2 mg/ml，然后與佐劑按1∶1體積乳化，免疫方式為腹腔注射，免疫劑量為100 μg/只。具體操作方法如下：第1次免疫：抗原+弗氏完全佐劑乳化(間隔20 d后)；第2次免疫：抗原+弗氏不完全佐劑乳化(間隔14 d后)；第3次免疫：抗原+弗氏不完全佐劑(間隔14 d后)；第4～5次免疫：水劑腹腔注射(每次免疫間隔為7 d)；加強免疫：水劑腹腔注射。

1.2.3小鼠抗體水平監(jiān)測 第2次基礎(chǔ)免疫后第8天采尾血，1 000 r/min離心10 min取上清，用間接ELISA方法檢測抗血清的效價。一般小鼠二免之后效價就可高達1×104，但有的小鼠需要4～5次免疫之后才會達到上萬的效價。選擇抗血清的效價高于1×104的小鼠進行加強免疫，3 d后做細(xì)胞融合。

1.2.4細(xì)胞融合[7-9]細(xì)胞融合的具體步驟：(1)飼養(yǎng)細(xì)胞的制備：取空白的BALB/c小鼠，斷頸處死后放入75%乙醇中浸泡5 min，然后放入超凈臺內(nèi)取左側(cè)臥位，無菌環(huán)境下剪開腹膜取出脾臟，用基本培養(yǎng)基沖洗下然后放入培養(yǎng)皿中(預(yù)先加入20～30 ml DMEM培養(yǎng)液)，再用5 ml的注射器吹出脾細(xì)胞(脾細(xì)胞透明為止)，補加適量的DMEM培養(yǎng)液，移入50 ml塑料離心管中。1 000 r/min離心10 min，用DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞并計數(shù)。(2)SP2/0細(xì)胞的準(zhǔn)備：選取對數(shù)生長期的SP2/0細(xì)胞進行融合，處于對數(shù)期的細(xì)胞渾圓透明、邊緣清晰、大小均一，細(xì)胞分裂速度一般為104～106ml-1，將細(xì)胞移入50 ml塑料離心管中。1 000 r/min離心10 min，用DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞并計數(shù)。(3)免疫脾細(xì)胞懸液的制備：方法同(1)。(4)細(xì)胞融合：將含有SP2/0細(xì)胞與脾細(xì)胞(10∶1)的離心管置于37℃水浴中，用1 ml吸管吸取1 ml PEG，邊加邊輕輕晃動離心管，60 s內(nèi)加完。5 min內(nèi)加入10 ml預(yù)溫至37℃的DMEM培養(yǎng)液，攪拌要溫和，然后離心(1 000 r/min，5 min)，倒掉上清液，取少量HAT培養(yǎng)液將細(xì)胞小心吹散然后移入準(zhǔn)備好的HAT培養(yǎng)液中，一個脾臟大概需要300 ml HAT培養(yǎng)液鋪十塊板)，加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔0.1 ml(預(yù)先制備96孔飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)板)或0.3 ml(已加入融合當(dāng)天制備的飼養(yǎng)細(xì)胞)，放入CO2孵育箱中培養(yǎng)。

1.2.5卡洛芬單抗細(xì)胞株的篩選[7-9]間接ELISA的具體方法：(1)包被：用CB將完全抗原稀釋成0.5 μg/ml然后加入到高吸附性的酶標(biāo)板中，每孔100 μl，放置在37℃ 2 h或者冰箱4℃12 h后，用PBST洗板2次；(2)封閉：每孔加入200 μl的封閉液，然后放置在37℃溫箱中反應(yīng)40 min后取出洗板2次；(3)加一抗：每孔加入100 μl細(xì)胞培養(yǎng)液的上清，溫箱反應(yīng)40 min后取出洗板3次；(4)加二抗：按1∶3 000稀釋羊抗鼠IgG-HRP然后每孔加入100 μl，37℃溫箱中反應(yīng)40 min后洗板5次；(4)顯色：每孔加TMB顯色液100 μl并放置在37℃溫箱中顯色15 min；(5)終止：每孔加入2 mol/L H2SO4終止液50 μl 1 min內(nèi)放入酶標(biāo)儀讀取OD(雙波長)值。OD值大于1的即為陽性孔。再通過間接競爭ELISA進一步做抑制。

間接競爭ELISA方法基本同上，不同的是第3步：每孔加入50 μl細(xì)胞培養(yǎng)液的上清然后再加入50 μl一定濃度的卡洛芬標(biāo)準(zhǔn)品。

1.2.6卡洛芬單抗細(xì)胞株的腹水制備[7-9]腹水制備采用動物體內(nèi)誘生的方法。具體步驟為：在接種雜交瘤細(xì)胞前1～2周，先給BALB/c小鼠腹腔注射弗氏不完全佐劑(0.5 ml/只)。將培養(yǎng)皿中的雜交瘤細(xì)胞離心10 min,去上清后用無血清培養(yǎng)液重新懸浮細(xì)胞沉淀，并將細(xì)胞數(shù)調(diào)至(1～2)×106個/ml，每只小鼠腹腔注射0.5 ml。7～12 d后，可見接種雜交瘤細(xì)胞的小鼠腹部明顯膨大，此時用酒精棉球擦拭小鼠腹部皮膚進行消毒后，用10 ml注射器抽取腹水。將腹水于4℃ 8 000 r/min離心10 min后取上清置-20℃保存。然后采用辛酸-硫酸銨鹽析法純化腹水。

1.2.7單抗免疫學(xué)性質(zhì)測定[7-9](1)效價：首先確定包被抗原的最佳濃度以及抗體的稀釋倍數(shù)，先用CB將抗原稀釋成1.6 μg/ml，然后采用倍比稀釋的方法逐步往下稀釋6個梯度然后橫向包被于96孔酶標(biāo)板上，最后一列包被10 g/L的OVA作為陰性對照。將抗體按1∶104稀釋，然后依次倍比稀釋6個梯度，縱向加入酶標(biāo)板，最后一排加入陰性血清(未免疫的小鼠血清)，根據(jù)間接ELISA的方法，確定OD值為1.0左右所對應(yīng)的抗原濃度和抗體稀釋倍數(shù)就是最適合的抗原包被濃度和抗體稀釋倍數(shù)。

選取最佳抗原濃度包被96孔酶標(biāo)板，將抗體按照1∶1×104，1∶2×104，1∶4×104，1∶8×104等倍比稀釋后縱向加入酶標(biāo)板中，根據(jù)間接ELISA方法測定抗體效價，OD值約為1時，抗體稀釋的最大倍數(shù)就是抗體效價。

采購單抗亞類鑒定試劑盒鑒定51C3細(xì)胞株的亞類。

(2)靈敏度:靈敏度即最低檢測限，它是根據(jù)B0-3SD算出，測定20個陰性樣本(不含卡洛芬藥品)的OD值，取其平均值即為B0，算出其標(biāo)準(zhǔn)差即為SD，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合方程計算出對應(yīng)于OD值為B0-3SD的卡洛芬濃度就是該單抗的靈敏度。

(3)特異度:卡洛芬抗體的特異性是通過與其他非甾體類藥物的交叉反應(yīng)體現(xiàn)，根據(jù)間接競爭ELISA的原理，測出其他非甾體類藥物的IC50(OD值被抑制一半時對應(yīng)的藥物濃度)，并計算交叉反應(yīng)率(CR50),CR50=IC50(卡洛芬)/IC50(受試藥物)×100%。

1.2.8卡洛芬在ELISA檢測中的穩(wěn)定性測試 (1)變異系數(shù)的測定：變異系數(shù)是用來確定方法精密度的，可以通過批內(nèi)變異系數(shù)來表示，批內(nèi)變異系數(shù)：同一批次內(nèi)重復(fù)測定高、中、低三個濃度的吸光值，每個濃度重復(fù)5次，用方差除以平均數(shù)即得變異系數(shù)的范圍。

(2)豬肉中卡洛芬的添加回收率測定[2]：稱取三份豬肉樣品，每份10 g，絞碎之后(經(jīng)儀器方法檢測不含卡洛芬)放入50 ml聚丙烯塑料離心管中，分別按1、2、5 ng/ml的劑量添加卡洛芬標(biāo)準(zhǔn)品，然后加入4 g無水硫酸鈉，用玻璃棒攪勻加入15 ml乙腈，于漩渦混合器上渦旋1 min，4 000 r/min離心5 min，取上清于蒸發(fā)瓶中，殘渣用15 ml乙腈重復(fù)提取一次，渦旋1 min，4 000 r/min離心5 min，合并兩次上清液，加5 ml異丙醇，在45℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干，殘渣先加1 ml乙腈，超聲溶解，然后加3 ml乙腈飽和的正己烷，渦旋30 s，轉(zhuǎn)移至10 ml離心管中，4 000 r/min離心5 min，取上清通過間接競爭ELISA測出OD值，計算抑制率，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程并根據(jù)以下公式計算添加回收率：添加回收率(%)=添加值(ng/g)/測定值(ng/g)×100%。

圖1 卡洛芬完全抗原紫外掃描圖譜Fig.1 Ultraviolet spectrum of Carprofen complete antigen

2 結(jié)果

2.1免疫抗原合成 將Carprofen，BSA和偶聯(lián)物通過紫外分光光度計在200 nm～450 nm之間掃描，結(jié)果見圖1。BSA在280 nm處有一特征吸收峰，Carprofen在200 nm、240 nm和320 nm左右有3個吸收峰，其中320 nm處的吸收峰可以作為判定的特征吸收峰，從圖1A可以看出，Carprofen-BSA的圖譜在280 nm，320 nm處各有一吸收峰，表明Carprofen已經(jīng)偶聯(lián)在BSA上了。同理分析Carprofen-OVA的偶聯(lián)也是成功的(圖1B)。

2.2免疫過程抗血清效價的監(jiān)控 采用間接ELISA方法，第1次免疫后，抗體的效價慢慢上升，約30 d后抗體的效價維持不變，第2次免疫后，抗體的效價快速升高，結(jié)果見圖2。

2.3抗體的效價 根據(jù)1.2.7的方法可知卡洛芬-OVA的最適包被濃度為0.2 mg/L，用該濃度的抗原包被檢測，純化后的單抗效價為1∶3.2×105結(jié)果見表1。

按亞類鑒定試劑盒說明書中抗原介導(dǎo)的ELISA法進行鑒定測得卡洛芬51C3細(xì)胞分泌的單抗亞類為IgG1型。

圖2 免疫過程中抗體效價監(jiān)測圖Fig.2 Antibody titer monitoring chart in immune process

2.4單抗的靈敏度及標(biāo)準(zhǔn)曲線 用PBS將卡洛芬標(biāo)準(zhǔn)品按梯度稀釋成0、0.1、0.3、0.9、2.7、8.1 ng/ml 5個濃度，采用間接競爭ELISA的方法。以卡洛芬的濃度對數(shù)為X軸，以B/B0為Y軸擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖3。線性回歸方程為y=-0.456 9x+0.475 1(R2=0.990 2)。根據(jù)1.2.7中的方法，可以計算出卡洛芬單抗的靈敏度為0.32 ng/ml，根據(jù)線性回歸方程計算得出單抗的IC50為0.882 ng/ml。

2.5交叉反應(yīng) 用卡洛芬的IC50除以其他非甾體類藥物的IC50得到交叉反應(yīng)率，結(jié)果見表2。根據(jù)結(jié)果表明該卡洛芬單抗對表中其他非甾體類的交叉反應(yīng)率均小于0.04%，說明該卡洛芬單抗具有很好的特異性。

圖3 卡洛芬間接競爭ELISA的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Carprofen indirect competitive ELISA curve

表251C3單抗與其他非甾體類藥物的交叉反應(yīng)率

Tab.2Cross-reactivityofmonoclonalantibody51C3withvariousdrugs

DrugsIC50(μg/L)CR50(%)Carprofen0.882100Ibuprofen>2000<0.04Ketoprofen>2000<0.04Naproxen>2000<0.04Feinuoluofen>2000<0.04Indoprofen>2000<0.04Fenbufen>2000<0.04

表151C3單抗方陣滴定結(jié)果

Tab.1Resultsofcheckerboardtitration(51C3ascitesantibody)

51C3purifiedascitesdilution(×104)Carprofen-OVAcoatingconcentration(mg/L)1.60.80.40.20.10.0510g/LOVA14.0513.8693.6542.9232.0811.6350.06023.9323.2313.1322.1911.7131.1820.04043.6822.9652.5361.8651.3010.9920.05082.9842.1611.9651.4531.1120.7240.060162.1821.8691.5631.2380.7100.5010.040321.9231.5311.4201.0820.3700.2510.050Negativeserum0.0510.0520.0610.0530.0400.0500.040

表3卡洛芬回收率及變異系數(shù)

Tab.3RecoveryrateandCVofCarprofeninpork

CarprofenAddcontent(ng/ml)Measuredvalue(ng/ml)Recoveryrate(%)Coefficientofvariation(%)10.816±0.20781.625.4Sample121.875±0.38493.820.555.218±0.849104.416.310.814±0.20881.425.6Sample221.884±0.37994.220.155.068±0.854101.416.910.848±0.21984.825.8Sample321.896±0.38194.820.155.114±0.851102.316.6

2.6回收率及變異系數(shù) 本研究通過對豬肉樣品進行卡洛芬的添加回收測定，測得回收率為81.4%～104.4%，變異系數(shù)為16.3%～25.8%，具體結(jié)果見表3。

3 討論

關(guān)于抗原合成，在小分子與載體蛋白的偶聯(lián)中，我們采用活性酯法將卡洛芬與載體蛋白按20∶1的摩爾比進行偶聯(lián)，偶聯(lián)后的完全抗原通過紫外掃描以及對小鼠尾尖血進行免疫學(xué)檢測，獲得很高的抗體效價，說明抗原偶聯(lián)是成功的；關(guān)于卡洛芬單抗特性的分析，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合方程計算，本文制備的單抗靈敏度為 0.882 ng/ml，且與其他非甾體類抗炎藥交叉反應(yīng)率極低(小于0.04%)，表明該單抗不但可以檢測樣品中極低的卡洛芬添加量而且不易受樣品中其他添加劑的干擾，不會造成假陽性，特異性強；關(guān)于ELISA檢測方法穩(wěn)定性的驗證，本文通過對多份豬肉樣品添加不同劑量的卡洛芬藥品并進行回收率的測定，從ELISA結(jié)果來看，變異系數(shù)為16.3%～25.8%，說明該方法具有一定的精確度，藥品添加回收率均在80%以上，充分說明本文建立的ELISA檢測驗證方法是穩(wěn)定有效的。

隨著人們對動物源性食品的需求日益增大，各種食品安全問題層出不窮，很多養(yǎng)殖戶的低文化水平以及利欲熏心導(dǎo)致獸藥非法添加、人藥獸用越演越烈，卡洛芬、氟尼辛等非甾體類藥物由于具有解熱、鎮(zhèn)痛、消炎等作用已經(jīng)成為很多豬牛羊養(yǎng)殖戶的首選用藥，人們長期被動攝入這些殘留在動物源性食品(雞蛋、奶品、肉品)中的非甾體類藥物，一方面會導(dǎo)致耐藥性，另一方面會導(dǎo)致上消化道出血[10，11]，目前市面上用于檢測這類非甾體類藥物的只有化學(xué)儀器方法，無法普及推廣，本文制備的卡洛芬單抗可以用于ELISA試劑盒及膠體金試紙條的制備，方便監(jiān)督檢查人員和檢測人員進行現(xiàn)場檢測，快速高效判斷結(jié)果，節(jié)省人力物力大大提高工作效率。為遏制獸藥濫用及人藥獸用貢獻一份力量。

[1] 邱 梅，郝智慧，沈 巍，等.卡洛芬注射液抗炎、鎮(zhèn)痛效果及皮膚刺激性觀察[J].中國獸藥雜志，2012，46(6)：23-26.

[2] 李 娜，張玉婷，劉 磊，等.超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定豬肉中非甾體抗炎藥殘留量[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2014，30(27)：299-303.

[3] 胡 婷，彭 濤，鄧曉軍，等.非甾體抗炎藥殘留檢測方法研究進展[J].中國獸藥雜志，2010，44(8)：42-47.

[4] Hermanson GT.Bioconjugate Techniques[J].2th ed.USA:Academic Press,2008:171-172.

[5] 周大勇，戚曉玉.諾氟沙星與牛血清白蛋白及卵清蛋白結(jié)合物的合成[J].上海水產(chǎn)大學(xué)學(xué)報，2002，11(4)：362-366.

[6] 頡東旭，陳新民，于 蘭.利用超聲波粉碎機快速乳化佐劑、抗原混合物[J].中國免疫學(xué)雜志，1993，9(3)：143.

[7] 楊廷彬，尹學(xué)念主編.實用免疫學(xué)[M].長春：長春出版社，1994：365-381.

[8] 朱立平，陳學(xué)清主編.免疫學(xué)常用實驗方法[M].北京：人民軍醫(yī)出版社，2000：1-74.

[9] Nelson PN,Reynolds GM,Waldron EE，etal.Monoclonal antibodies [J].Mol Pathol,2000,53(3) :111-117.

[10] 章谷生，容秉培.單克隆抗體在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用[M].上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1987：91-110.

[11] 張 彭，潘 珅，楊 穎，等.非甾體類抗炎藥致上消化道出血的臨床分析[J].實用藥物與臨床，2010，13(2)：111-112.

[收稿2017-07-12 修回2017-08-03]

(編輯 張曉舟)

PreparationofmonoclonalantibodiesagainstCarprofen

XIONGYan-Hua,GAOAi-Zhong,WANGYi.

HospitalofIntegratedChineseandWesternMedicineinHubeiProvince，Wuhan430015,China

Objective:Preparation of monoclonal antibodies against Carprofen,which lays a foundation for the rapid detection of Carprofen.MethodsVia an active ester method,Carprofen was conjugated to bovine serum albumin (BSA) as immune antigen and ovalbumin (OVA) as detection antigen,respectively.Hybridomas were obtained by fusing mouse myeloma cells SP2/0 with splenocytes from the mice immunized with Carprofen-BSA.Hybridomas 51C3 secreting antibodies against Carprofen were obtained and subcloned.ResultsAscites of monoclonal antibodies (McAb) were prepared by injecting cells of hybridoma 51C3 into mice abdomen.The titer of purified McAb was 3.2×105and the McAb was IgG1 subtype.McAb was highly specific for Carprofen and the cross-reactivity (CR50%) was less than 0.04% with Ibuprofen,Ketoprofen,Naproxen,Feinuoluofen,Indoprofen,Fenbufen respectively.The sensitivity of the McAb to carprofen was 0.32 ng/ml and the IC50value was 0.882 ng/ml.The recoveries of Carprofen in the pork samples were from 81.4% to 104.4 % and coefficients of variation were from 16.3% to 25.8%.ConclusionAll results indicate that the McAb 51C3 is suitable to develop an immunoassay colloidal gold rapid dipstick test.

Carprofen;Monoclonal antibody;ELISA;Colloidal gold

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.11.015

R392

A

1000-484X(2017)11-1673-05

熊艷華(1987年-)，女，碩士，醫(yī)師，主要從事胃腸道疾病方面的研究，E-mail：461171887@qq.com。

及指導(dǎo)教師：汪 毅(1963年-)，男，博士，主任醫(yī)師，主要從事消化肝病方面的研究，E-mial：13971404670@163.com。