吳 瑕 何 君 王文軍

(綿陽市第三人民醫(yī)院腫瘤科 ，綿陽 621000)

miR-107靶向NID2通過Notch信號通路調(diào)控肺癌細胞的增殖侵襲

吳 瑕 何 君①王文軍②

(綿陽市第三人民醫(yī)院腫瘤科 ，綿陽 621000)

目的miR-107靶向NID2調(diào)控Notch信號通路影響肺癌的侵襲和增殖。方法免疫組化檢測NID2在肺癌組織和正常肺組織中的表達；PCR檢測miR-107在肺癌組織中的表達；雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測miR-107對NID2轉(zhuǎn)錄活性的影響；腫瘤細胞成球?qū)嶒灆z測miR-107的表達對肺癌細胞A549的增殖能力的影響；Transwell侵襲實驗檢測miR-107的表達對肺癌A549細胞的侵襲能力的影響；劃痕試驗檢測miR-107的表達對肺癌A549細胞的遷移能力的影響；Western blot檢測過表達miR-107后Notch信號通路的蛋白表達水平。結(jié)果和正常肺組織比較，NID2在肺癌組織中表達較高；miR-107在肺癌組織中表達明顯降低；雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測結(jié)果顯示，miR-107可以直接調(diào)控NID2的轉(zhuǎn)錄活性；過表達miR-107后，肺癌細胞A549的增殖、侵襲和遷移能力明顯降低；過表達miR-107后，Notch1、hes-1、presenilin1蛋白表達下調(diào)。結(jié)論miR-107靶向NID2的表達，通過Notch通路調(diào)控肺癌細胞的增殖和侵襲能力。

miR-107；肺癌；Notch；A549；侵襲；遷移

肺癌是世界上發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，近年來，隨著人口老齡化、環(huán)境污染加劇以及煙草等原因，肺癌發(fā)病率和死亡率都在呈上升趨勢，尤其在中國等發(fā)展中國家[1]。由于患者早期沒有明顯癥狀，肺癌細胞的高侵襲性和高轉(zhuǎn)移性，多數(shù)患者確診時已經(jīng)進入晚期，并且出現(xiàn)多處轉(zhuǎn)移。肺癌轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致肺癌患者死亡的主要原因。隨著手術(shù)、放化療以及靶向治療等綜合治療進步明顯，但是肺癌患者尤其是晚期肺癌患者的五年生存率仍然很低[2]。故研究肺癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)機制，尋找與肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子標記物尤為重要。

微小RNA(microRNA，miRNA)是真核生物中廣泛存在的一種小分子RNA，通過抑制核糖體功能，降解5′帽結(jié)構(gòu)和去腺苷酸化ploy尾，從而負性調(diào)節(jié)mRNA的翻譯[3]。miRNA廣泛參與調(diào)控基因表達、細胞周期和生物體發(fā)育等[4]。許多研究表明miRNA與多種腫瘤關(guān)系密切，并且跟腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，如乳腺癌、肝癌、結(jié)腸癌、肺癌等[4-6]。miR-107廣泛在人體內(nèi)表達，近年來研究表明miR-107的表達異常與腫瘤細胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為有關(guān)[7]。Lee等[8]研究表明，miR-107可以抑制胰腺癌細胞的增殖。Li等[9]研究表明，miR-107能夠靶向抑制CDK8從而抑制乳腺癌細胞的增殖和侵襲作用。

巢蛋白(Nidogen,NID)家族包括NID1，NID2，是基底膜的主要構(gòu)成成分之一，對于維持基底膜穩(wěn)定性具有非常重要的作用[10]。研究表明，NID除了維持基底膜穩(wěn)定性，在腫瘤細胞黏附、腫瘤血管形成、腫瘤細胞轉(zhuǎn)移過程中也起重要作用[11]。本研究擬通過研究NID2和miR-107在肺癌中的表達情況，并進一步探討miR-107的相互作用關(guān)系，明確miR-107在肺癌增殖和侵襲過程中的作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1臨床標本采集及處理 收集2015年3月-2016年5月在我院收治的122例肺癌患者，其中男性76例，女性46例；年齡(56.6±4.2)歲。所有患者術(shù)前無化療或放療，全部患者術(shù)后病理分期均經(jīng)兩名副高以上病理科醫(yī)師共同閱片確定，根據(jù)肺癌TNM分期標準，Ⅰ級45例、Ⅱ級24例、Ⅲ級42例、Ⅳ級11例。低分化33例，中分化38例，高分化51例。56例發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，66例未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。腫瘤組織離體后分三塊，一塊迅速投入RNA保存液中，另一塊用經(jīng)焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的冷磷酸緩沖液沖洗，去除血跡，迅速投入液氮凍存，一塊放入福爾馬林固定。

1.1.2細胞株與主要試劑 人肺癌細胞株A549購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。細胞培養(yǎng)條件：含10%胎牛血清的RPMI1640，37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)。胎牛血清，RPMI1640培養(yǎng)基均購自Hyclone公司。NID2、Notch1、hes-1、presenilin1一抗購自Abcam。Transwell小室購自美國Millipore公司，Matrigel購自美國BD公司。脂質(zhì)體Lipofectamine 2000、miR-107-mimic購自上海吉凱基因，Trizol購自美國Ambion公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(FSQ-101)購自日本ToYoBo公司，PCR試劑盒購自美國Kapa公司。熒光素酶活性檢測試劑盒、熒光素酶報告載體由Promega公司合成。

1.2方法

1.2.1qPCR檢測miR-107的表達 按照Trizol說明書提取組織中總RNA，超微量分光光度計測定RNA濃度，復(fù)能基因有限公司設(shè)計miR-107引物，上游引物：5′-AGCAGCAUUGUACAGGGCUAUCA-3′；下游引物：3′-AUAGCCCUGUACAAUGCUGCUUU-5′。以100 ng總RNA為模版，逆轉(zhuǎn)錄cDNA，反應(yīng)條件為：37℃ 15 min，98℃ 5min。后根據(jù)Kapa PCR試劑盒說明書進行PCR反應(yīng)。獲得數(shù)據(jù)以RQ=2-ΔΔCT計算mRNA表達量。實驗重復(fù)3次。

1.2.2免疫組化檢測肺癌組織中NID2的表達 石蠟包埋結(jié)腸癌組織，切片厚4 μm。免疫組化實驗步驟按免疫組化S-P試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)說明書操作：組織脫蠟、然后水化。在枸櫞酸鹽緩沖液中使用微波爐抗原修復(fù)30 min，冷卻至室溫。然后PBS緩沖液洗3 min×3次，3%H2O237℃孵育15 min，PBS緩沖液洗3 min×3次，一抗過夜，PBS緩沖液洗3 min×3次，辣根過氧化物酶標記的驢抗兔IgG，PBS緩沖液洗3 min×3次，辣根酶標記鏈酶卵白素工作液(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)37℃水浴20 min，PBS緩沖液洗3 min×3次，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。陰性對照運用PBS代替一抗。所有切片的閱片經(jīng)兩名病理科醫(yī)生獨立完成，每個人選擇22個具有代表性的高倍視野(10×40倍)，同時計數(shù)每個標本陽性細胞數(shù)的比例，陽性結(jié)果的判定按照De Falco M等描述的方法判定并評分：0分(陽性細胞數(shù)不到1%)；1分(陽性細胞數(shù)占1%到20%)；2分(陽性細胞數(shù)占21%到40%)；3分(陽性細胞數(shù)占41%到60%)；4分(陽性細胞數(shù)超過61%)。

1.2.3細胞轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期的肺癌細胞A549細胞，按照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書將miR-107-mimic和陰性對照轉(zhuǎn)染細胞。轉(zhuǎn)染后qPCR檢測miR-107的表達情況。

1.2.4熒光素酶活性檢測 將熒光素酶報告載體與miR-107-mimic共轉(zhuǎn)染A549細胞。以轉(zhuǎn)染pRL-TK作為標準內(nèi)質(zhì)控。轉(zhuǎn)染36 h后，收獲細胞。按Promega公司熒光素酶活性檢測試劑盒說明書檢測A549細胞熒光素酶活性。相對熒光素酶活性=螢火蟲熒光素酶活性值/海腎熒光素酶活性值。實驗重復(fù)3次。

1.2.5Transwell侵襲實驗檢測miR-107對肺癌細胞侵襲能力的影響 所有試劑及器材均于冰上預(yù)冷，將Transwell小室置于24孔板內(nèi)，將Transwell小室內(nèi)膜均勻涂抹Matrigel膠 50 μl(0.2 μg/μl)，37℃孵育15 min，使膠凝固；消化、離心、計數(shù)細胞后，按照2.5×104個/ml用無血清培養(yǎng)基稀釋細胞，制成細胞懸液；按照每孔200 μl，將細胞懸液加入Transwell上室，同時在Transwell下室加入10%FBS+培養(yǎng)基500 μl，放入37℃孵箱培養(yǎng)；甲醛固定，結(jié)晶紫染色15 min，然后用棉簽輕輕擦拭內(nèi)膜上的細胞。顯微鏡下技術(shù)，計數(shù)4個高倍視野(×40)下穿過濾膜的細胞數(shù)。實驗重復(fù)3次。

1.2.6劃痕實驗檢測miR-107對肺癌細胞遷移能力的影響 劃痕實驗：將A549細胞接種于6孔板，待細胞融合度生長在90%時，用200 μl消毒槍頭從上而下劃線，并在顯微鏡下觀察，測量劃痕的初始距離(0 time)；在24、48、72 h后，分別測量劃痕的距離，并拍照，計算細胞的遷移率。實驗重復(fù)3次。

1.2.7Western blot檢測細胞轉(zhuǎn)染后中Notch1、hes-1、presenilin1的表達 取轉(zhuǎn)染miR-107-mimic 48 h后的細胞蛋白，BCA法測定蛋白濃度，加入loading buffer后變性蛋白。配制10%SDS-PAGE，每孔加入20 μg蛋白樣品。使用濕轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，1∶1 000 TBST稀釋一抗，4℃過夜；加入羊抗兔二抗1∶5 000稀釋，室溫孵育2 h；ECL發(fā)光。實驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1肺癌組織和正常肺組織中miR-107和NID2 的表達 IHC結(jié)果表明(圖1A)：與正常肺組織相比，肺癌組織中NID2的水平明顯增高。

qPCR結(jié)果表明：(圖1B)與正常肺組織相比，肺癌組織中miR-107 mRNA表達水平明顯降低[(86.3±8.23)vs(18.8±2.79),P<0.05]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(表1)。

2.2miR-107和NID2表達與臨床病理資料的關(guān)系 統(tǒng)計分析表明(表2)：miR-107的表達水平隨肺癌病理分期的增加而降低；隨分化程度的降低，miR-107的表達水平逐漸降低；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌組織中，miR-107的表達明顯降低；NID2的表達水平隨肺癌病理分期的增加而增高；隨分化程度的降低，NID2的表達水平逐漸增高；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌組織中，NID2的表達明顯增高。

miR-107和NID2的表達水平與年齡和性別無關(guān)。結(jié)果表明：miR-107和NID2與肺癌病理分期分級及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否有關(guān)，而與性別、年齡等無關(guān)。

2.3熒光素酶報告基因檢測NID2和miR-107的作用關(guān)系 為明確miR-107能否與NID2 3′UTR結(jié)合，我們將miR-107-mimic與NID2 -Wt、NID2 -Mut共轉(zhuǎn)染到肺癌A549細胞中。熒光素酶報告基因結(jié)果顯示：miR-107-mimic可以明顯抑制NID2 -Wt的熒光素酶活性(圖2)；miR-107-mimic對NID2 -Mut的熒光素酶無明顯抑制作用。結(jié)果表明，miR-107能與NID2的3′UTR特異性結(jié)合。

2.4轉(zhuǎn)染miR-107-mimic后肺癌細胞A549的增殖能力變化 有研究表明：腫瘤細胞易呈懸浮球狀生長并且可連續(xù)增殖，在傳代的后期更易出現(xiàn)懸浮球狀生長且增殖速度加快；此外，通過有限稀釋實驗和亞克隆培養(yǎng)分析發(fā)現(xiàn)所有親本腫瘤球制成的細胞懸液都再次形成腫瘤球，且與親本腫瘤球完全相同，提示腫瘤細胞具有自我更新和無限增殖能力；腫瘤細胞的增殖能力可以用細胞球的體積大小來反映。我們研究顯示，細胞成球?qū)嶒烇@示，miR-107-mimic實驗組的腫瘤細胞球體積相比NC對照組明顯減小[(38.8±5.3)μm3vs (170.6±16.3)μm3，P<0.05]，可以認為實驗組的腫瘤球體積與對照組有統(tǒng)計學(xué)差異，表明過表達miR-107后，肺癌A549細胞的成球能力受到了抑制，所以miR-107可以抑制肺癌A549細胞的增殖能力。

圖1 NID和miR-107在肺癌組織和細胞中的表達情況Fig.1 Expression of NID and miR-107 in lung cancer tissues and cellsNote: The protein expression of miR-107 were detected by IHC in lung cancer tissue and normal lung tissue.B.The mRNA expression of miR-107 were detected by qPCR in lung cancer tissue and normal lung tissue.Error bars represent standard error.*.P<0.05.

表1肺癌組織與正常肺組織中miR-107和NID2的表達比較

Tab.1ComparisonexpressionofmiR-107andNID2betweenlungcancerandnormallungtissues

TissuespecimensNumberHighexpressionofNID2[n(%)]HighexpressionofmiR-107[n(%)]Lungcancer1228468.9%1)3730.4%1)Normalcancer1223831.1%8569.6%

Note：Compared with normal lung tissue，1)P<0.05.

表2miR-107表達與肺癌臨床病理特征的關(guān)系

Tab.2RelationshipbetweenmiR-107expressionandclinicopathologicalfeaturesoflungcancer

ClinicopathologicaldataNumberLowexpressionofNID2HighexpressionofNID2PvalueHighexpressionofmiR-107LowexpressionofmiR-107PvalueGender0.7220.813Male7637393838Female4624222125Age(year)0.0810.072≤606431333133>605828303127Differentiation0.0210.026High5120312031Middle3814241226Low33429528Pathologicalstaging0.0210.022Ⅰ4533122025Ⅱ2413111014Ⅲ421329537Ⅳ41932239Lymphnodemetastasis0.0150.016No6631343234Yes56650551

圖2 熒光素酶報告基因檢測NID2是miR-107的直接靶點Fig.2 NID2 direct target of miR-107 detected by Luciferase report gene

2.5miR-107可以抑制人肺癌細胞A549的侵襲能力 細胞侵襲穿過Matrigel的能力可以反映細胞的侵襲能力。Transwell結(jié)果顯示：NC組通過Matrigel基質(zhì)膠的細胞數(shù)量為(342.5±28.7)，明顯多于miR-107-mimic組(51.9±16.8)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。表明miR-107可以抑制人肺癌細胞A549的侵襲能力(圖3)。

2.5miR-107可以抑制人肺癌細胞A549的遷移能力 在顯微鏡下分別測量0、24、48、72 h時，各組細胞任意三個部位的劃痕的寬度，遷移率=[D(t=24，48，72 h)-D(t=0 h)]/D(t=0 h)。劃痕實驗結(jié)果表明：與NC組相比，在24、48、72 h時，miR-107-mimic組遷移率明顯降低[24 h(24.54±3.23)% vs(58.02±1.12)%,P<0.05;48 h(33.42±5.35)% vs(72.19±2.27)%,P<0.05;72 h(47.15±7.37)% vs(83.26±4.17)%,P<0.01]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。表明miR-107可以抑制人肺癌細胞A549的遷移能力(圖5)。

2.6miR-107可以調(diào)節(jié)Notch1、Hes-1、presenilin1的表達 Notch信號通路在人類很多惡性腫瘤中被激活，包括乳腺癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌和子宮內(nèi)膜癌等，故進一步探討miR-107調(diào)控肺癌A549細胞是否和Notch信號通路相關(guān)。Western blot結(jié)果顯示：與NC組相比，miR-107-mimic組中Notch1、Hes-1、presenilin1表達水平明顯下降[Notch1(12.6±1.9)% vs(72.3±5.9)%;Hes-1(20.6±3.2)% vs(80.1±6.2)%；presenilin1(12.2±3.2)% vs(77.2±8.3)%,P<0.05]，表明miR-107可以調(diào)節(jié)Notch1、Hes-1、presenilin1的表達，進而表明，miR-107可以通過Notch信號通路從而調(diào)節(jié)肺癌細胞的生物學(xué)行為(圖6)。

圖3 腫瘤細胞成球?qū)嶒灆z測miR-107對肺癌細胞A549的增殖能力的影響(結(jié)晶紫染色，×40)Fig.3 Effect of miR-107 on proliferation ability of lung cell were detected by tumor into ball assays(Crystal violet，×40)Note: Error bars represent standard error.*.P<0.05.

圖4 Transwell侵襲實驗檢測miR-107對人肺癌細胞A549侵襲能力的影響Fig.4 Effect of miR-107 on invasion ability of A549 cells were detected by Transwell matrigel invasion assaysNote: Error bars represent standard error.*.P<0.05.

3 討論

miRNA是近年來新發(fā)現(xiàn)的基因調(diào)控因子，可通過與靶mRNA結(jié)合，從而抑制靶mRNA的翻譯，抑制靶基因編碼蛋白的表達，也可以直接參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移和耐藥等生物學(xué)行為[12-13]。miRNAs既可以作為抑癌因子，相反地，也可以作為促癌因子。在腫瘤中表達明顯增高的miRNA起促癌作用；腫瘤中表達明顯降低的miRNA起抑癌作用[14]。

miR-107位于人染色體10q23.31，是染色質(zhì)頻繁發(fā)生突變的區(qū)域，在人體腦、肝、脾、心臟等組織中廣泛表達，研究表明miR-107在直腸癌、膀胱癌等腫瘤中表達下調(diào)。本研究通過PCR檢測肺癌組織和正常肺組織中miR-107的表達，miR-107在肺癌組織中表達明顯降低，miR-107的表達水平隨肺癌病理分期的增加而降低；隨分化程度的降低，miR-107的表達水平逐漸降低；在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌組織中，miR-107的表達明顯降低。

NID是第Ⅳ類中間絲蛋白，是一種連接蛋白，參與細胞骨架的構(gòu)成。研究表明，NID與細胞受體相互作用，參與控制腫瘤細胞的侵襲和遷移[15]。本研究通過免疫組化檢測NID2在肺癌組織和正常肺組織中的表達發(fā)現(xiàn)，NID2在肺癌組織中表達明顯增高，NID2的表達水平隨肺癌病理分期的增加而增高；隨分化程度的降低，NID2的表達水平逐漸增高；在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌組織中，NID2的表達明顯增高；通過Transwell和劃痕試驗表明，miR-107可以抑制腫瘤細胞侵襲和遷移；通過腫瘤成球?qū)嶒灡砻?，miR-107可以抑制肺癌細胞增殖。

Notch信號通路是經(jīng)典信號通路之一，Notch信號通路的異常激活與腫瘤侵襲和遷移密切相關(guān)。Notch信號通路主要由Notch受體和Notch配體構(gòu)成，Notch受體蛋白有4個同源Notch受體：Notch1～4。NICD是Notch受體蛋白的活性形式[16]。目前認為，Notch受體與配體結(jié)合后，經(jīng)過三次裂解反應(yīng)后，釋放出NICD，之后NICD進入細胞核，調(diào)節(jié)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達，從而進一步影響細胞或者腫瘤細胞的生物學(xué)行為[17]。Ma等[18]研究表明，Notch信號通路的相關(guān)因子在骨肉瘤組織中異常表達，且Notch-1表達水平跟骨肉瘤分期分級以及遠處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Dailey等[19]通過檢測不同侵襲性骨肉瘤細胞株LM7和SAOS2中Notch信號活性發(fā)現(xiàn)，高侵襲性骨肉瘤細胞株LM7中Notch信號通路活性明顯增高，并且發(fā)現(xiàn)，Notch信號通路靶基因Hes-1在骨肉瘤侵襲和遷移過程中起重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)miR-107在肺癌細胞侵襲和遷移過程中起重要作用，通過Western blot檢測Notch信號通路Notch1、Hes-1、presenilin1的表達水平發(fā)現(xiàn)，miR-107可能通過Notch信號通路影響肺癌細胞的侵襲、遷移和增殖能力。本研究通過檢測miR-107和NID2在肺癌和正常肺組織中的表達情況；使用miRNA類似物過表達miR-107，進一步探討過表達miR-125a后肺癌細胞侵襲和遷移能力的改變及其相關(guān)機制。研究發(fā)現(xiàn)miR-107靶向NID2通過Notch信號通路抑制肺癌細胞的侵襲、遷移和增殖能力，提示miR-107可能參與肺癌細胞侵襲、遷移和增殖過程，有可能成為預(yù)測肺癌進展、預(yù)后和監(jiān)測治療效果的標志物。

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[收稿2017-05-04]

(編輯 許四平 劉格格)

MiR-107targetNID2regulatinginvasionandproliferationoflungcancerbyJAK/STATsignalingpathway

WUXia，HEJun,WANGWen-Jun.

TheDepartmentofTumor，ThirdPeopleHospitalofMianyangCity,Mianyang621000,China

Objective:To investigate the effect of miR-107 targeting NID2 on Notch signaling pathway on invasion and proliferation of lung cancer.MethodsThe expression of NID2 in lung cancer and normal tissues was detected by immunohistochemistry.The expression of miR-107 in lung cancer cell line was detected by PCR.The effect of miR-107 on the expression of NID2 was examined by the dual luciferase gene system.Effect of miR-26 on the proliferation ability of H1650 were detected by tumor in ball assays.Transwell invasion assay was used to detect the ability of invasion in the lung cancer cell line A549 after overexpression the miR-107.Scratch test was used to detect the ability of migration in the lung cancer cell line A549 after overexpression the miR-107.Western blot was used to detect the protein expression of Notch signal pathway after overexpression miR-107.ResultsThe expression of NID2 in lung cancer tissues was significantly higher than that in normal lung tissues.The expression of miR-107 in lung cancer tissues was significantly lower than that in normal lung tissues.The dual luciferase reporter gene system showed that miR-107 could directly regulate the transcriptional activity of NID2.After miR-107 overexpression,the proliferation,invasion and migration ability of lung cancer cell A549 were significantly decreased.The expression of miR-107 protein could down-regulate the expression of Notch1,hes-1 and presenilin1 protein.ConclusionmiR-107 targets the expression of NID2 and regulates the invasion and proliferation of lung cancer cells by Notch pathway.

miR-107；Lung cancer；Notch；A549；Invasion；Migration

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.11.013

①綿陽市第三人民醫(yī)院消化內(nèi)科，綿陽 621000。

②綿陽江油市人民醫(yī)院兒科，江油 621700。

R563

A

1000-484X(2017)11-1662-06

吳 瑕(1983年-),女,在讀碩士,主治醫(yī)師,主要從事呼吸內(nèi)科方面的研究，E-mail：23136190@qq.com。