魏海峰 米旭光 劉 磊 蘆小單 李首慶 譚 巖 方艷秋

(吉林省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)診治實(shí)驗(yàn)中心，長(zhǎng)春 130021)

·生物治療·

miR-126對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其在調(diào)控結(jié)腸癌EMT轉(zhuǎn)化中的作用①

魏海峰 米旭光 劉 磊 蘆小單 李首慶 譚 巖 方艷秋

(吉林省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)診治實(shí)驗(yàn)中心，長(zhǎng)春 130021)

目的觀察miR-126在不同轉(zhuǎn)移潛能的人結(jié)腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況及其對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響并探討可能的作用機(jī)制。方法采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)腸癌細(xì)胞系(SW480、SW620及HCT116)中miR-126的表達(dá)量。通過(guò)脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染法將miR-126過(guò)表達(dá)(miR-126 mimics)，并設(shè)置陰性對(duì)照組，然后采用CCK8法檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力，Transwell侵襲小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力，Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)E-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)量的變化。結(jié)果相對(duì)于低轉(zhuǎn)移潛能的結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480，miR-126在高轉(zhuǎn)移潛能的SW620和HCT116細(xì)胞中的表達(dá)降低。過(guò)表達(dá)miR-126可使SW620細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力降低，E-cadherin蛋白表達(dá)增加，Vimentin蛋白表達(dá)降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論低表達(dá)的miR-126與結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，miR-126影響結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的作用可能是通過(guò)調(diào)控EMT進(jìn)程實(shí)現(xiàn)的。

miR-126；結(jié)腸癌；上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化；腫瘤生物治療

結(jié)腸癌是臨床上常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率也正逐年升高。早期結(jié)腸癌患者通過(guò)手術(shù)治療預(yù)后較好，但是晚期患者的5年生存率僅有20%左右，治療效果不佳，其死亡的主要原因是腫瘤的轉(zhuǎn)移[1]。結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制非常復(fù)雜，這一過(guò)程涉及癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換、侵襲黏附能力、血管生成等作用[2,3]，其中上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial mesenchymal transition,EMT)是腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵啟動(dòng)步驟，在結(jié)腸癌進(jìn)展中發(fā)揮著主導(dǎo)作用。然而，EMT相關(guān)信號(hào)通路涉及多個(gè)分子、多條信號(hào)通路，任何針對(duì)單個(gè)分子的干預(yù)方法，都難以達(dá)到理想的逆轉(zhuǎn)效果。因此，有必要尋找新的手段和策略。最近研究表明，miRNA可以通過(guò)負(fù)性調(diào)控EMT相關(guān)基因的表達(dá)，在腫瘤轉(zhuǎn)移中起著重要的作用[4,5]。到目前為止，僅有少數(shù)miRNA被證實(shí)參與了腫瘤EMT的發(fā)生，miRNA在腫瘤尤其是結(jié)腸癌EMT中所起的作用及其分子機(jī)制還遠(yuǎn)未闡明。本研究通過(guò)觀察miR-126的過(guò)表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、遷移和侵襲的影響及EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的變化，觀察miR-126在結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)中的作用并探討可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480、SW620及HCT116為本實(shí)驗(yàn)室凍存；胎牛血清、RPMI medium 1640、DMEM培養(yǎng)基(Gibco，美國(guó))；Trizol、LipofectamineTM2000(Life Technologies，美國(guó))；Has-miR-126 mimics及陰性對(duì)照Cel-miR-67 mimics(上海百奧邁科，中國(guó))；miR-126、U6引物(上海生工，中國(guó))；RT-PCR試劑盒(Promega，美國(guó))；SYBR Green Master(Roche，瑞士)； Matrigel基質(zhì)膠、Transwell小室(Coming公司);CCK8試劑(北京碧云天公司);E-cadherin、Vimentin及GAPDH抗體(Santa Cruz公司)。其他常規(guī)試劑產(chǎn)自北京化工。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清和1%青-鏈霉素雙抗的RPMI1640在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，常規(guī)換液、傳代。

1.2.2脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 按照LipofectamineTM2000說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，用于轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染前一天選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)且狀態(tài)良好的細(xì)胞，胰酶消化，以1×105個(gè)/孔接種細(xì)胞數(shù)接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。轉(zhuǎn)染當(dāng)天細(xì)胞豐度可達(dá)60%～70%。每孔轉(zhuǎn)染miRNA mimics 5 μl(終濃度為50 nmol/L)，轉(zhuǎn)染后48 h，留取細(xì)胞、提取RNA或蛋白用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3總RNA提取和qRT-PCR檢測(cè) Trizol法提取結(jié)腸癌細(xì)胞株總RNA。紫外分光光度計(jì)測(cè)量純度和濃度。按逆轉(zhuǎn)錄說(shuō)明書(shū)將1 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。將得到的cDNA 5倍稀釋用于熒光定量PCR反應(yīng)。使用2×SYBR Green Master在ABI7500熒光定量PCR儀上測(cè)定。miRNA表達(dá)以U6作為內(nèi)參。引物序列：hsa-miR-126:頸環(huán)引物5′-GTCGTA TCCAG TGCAG GGTCC GAGGT ATTCG CACTG GATAC GACCG CATT-3′，miR-126-3p forward primer:5′-GTCTC GTACC GTGAG TAAT-3′，miRNA Universal primer:5′-GTGCA GGGTC CGAGGT-3′；U6 forward primer:5′-CTCGC TTCGG CAGCA CA-3′，reverse primer:5′-AACGC TTCAC GAATT TGCGT-3′。以2-ΔΔCt法計(jì)算每組細(xì)胞miR-126的表達(dá)量。

1.2.4CCK-8實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞以5×103個(gè)/孔接種于96孔板，連續(xù)培養(yǎng)4 d后，每孔加入10 μl CCK8試劑與90 μl培養(yǎng)液，培養(yǎng)箱內(nèi)反應(yīng)2 h后，酶標(biāo)儀測(cè)定在490 nm處波長(zhǎng)的吸光度(A)，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，計(jì)算平均值，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.2.5細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞以5×105個(gè)/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿至80%時(shí)，用10 μl微量移液頭消毒后在細(xì)胞板上垂直劃痕，PBS洗滌細(xì)胞3次，去除脫落的細(xì)胞，加入無(wú)血清培養(yǎng)基。于實(shí)驗(yàn)第1天及培養(yǎng)48 h后倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞的遷移情況。

1.2.6Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 接種前2 h用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋Matrigel膠，以50 μl/孔的體積鋪于小室上，放置于培養(yǎng)箱內(nèi)2 h，細(xì)胞饑餓24 h后調(diào)整濃度為5×105ml-1，上室接種200 μl細(xì)胞懸液，下室加入600 μl含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后取出Transwell小室，棄去孔中培養(yǎng)液，F(xiàn)BS洗滌，4%多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，用棉簽擦去上室Matrigel膠和未穿過(guò)膜的細(xì)胞，PBS清洗、干燥。倒置顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野計(jì)數(shù)穿過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)，計(jì)算平均值，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.2.7Western blot實(shí)驗(yàn) 提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量，電泳、轉(zhuǎn)膜、脫脂奶粉封閉后，加入目標(biāo)蛋白一抗4℃孵育過(guò)夜，與辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記二抗室溫反應(yīng)、孵育后，利用膠片曝光、顯影、定影，圖像分析儀行膠片掃描，分析灰度值。

2 結(jié)果

2.1不同結(jié)腸癌細(xì)胞中miR-126的表達(dá)水平 如圖1所示，相對(duì)于結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480，miR-126在結(jié)腸癌細(xì)胞SW620和HCT116中的表達(dá)明顯更低。

2.2結(jié)腸癌細(xì)胞SW620轉(zhuǎn)染miRNA mimics后miR-126的表達(dá)情況 以脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染miR-126 mimics入SW620細(xì)胞中，終濃度為50 nmol/L，Cel-mir-67 mimics為陰性對(duì)照(Negative control,NC)，以U6為內(nèi)參。數(shù)據(jù)以2-ΔΔCt方式表示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖2)，轉(zhuǎn)染miRNA mimics 48 h后，可使低表達(dá)miR-126的結(jié)腸癌細(xì)胞株SW620中此miRNAs的表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01)。

圖1 miR-126在不同結(jié)腸癌細(xì)胞中的表達(dá)差異Fig.1 Expression of miR-126 in different colon cancer cells

圖2 結(jié)腸癌細(xì)胞SW620轉(zhuǎn)染miRNA mimics 后miR-126的表達(dá)Fig.2 Expression of miR-126 in colon cancer cell SW620 after mimics transfectedNote: Compared with NC group，**.P<0.01.

2.3過(guò)表達(dá)miR-126對(duì)細(xì)胞增殖的影響 CCK8法結(jié)果顯示：隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，過(guò)表達(dá)miR-126組結(jié)腸癌細(xì)胞SW620的增殖能力從第3天后開(kāi)始比陰性對(duì)照組下降，至第4天時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明miR-126具有抑制結(jié)腸癌細(xì)胞SW620增殖的能力(圖3)。

2.4劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-126對(duì)細(xì)胞遷移能力影響 對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞SW620進(jìn)行劃痕處理后，48 h后觀察細(xì)胞的遷移情況，陰性對(duì)照組及miR-126 mimics轉(zhuǎn)染組劃痕區(qū)域相對(duì)寬度分別為(44.67±2.34)%及(62.47±3.16)%。miR-126 mimics轉(zhuǎn)染組劃痕細(xì)胞斷端的距離較陰性對(duì)照組顯著寬大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明miR-126可抑制SW620細(xì)胞的遷移能力。

圖3 miR-126 mimics對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞SW620增殖能力的影響Fig.3 Effect of miR-126 mimics on proliferation of colon cancer cell SW620 after mimics transfectedNote: Compared with NC group，*.P<0.05.

圖4 Western blot檢測(cè)SW620細(xì)胞E-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)Fig.4 Expression of E-cadherin and Vimentin protein in SW620 cells

2.5Transwell小室檢測(cè)miR-126對(duì)細(xì)胞侵襲能力影響 Transwell小室結(jié)果顯示，miR-126 mimics轉(zhuǎn)染組穿過(guò)濾膜遷移至下室的細(xì)胞個(gè)數(shù)為(74.00±6.58)個(gè)，較陰性對(duì)照組(186.40±9.74)個(gè)顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明miR-126具有抑制結(jié)腸癌SW620細(xì)胞侵襲的作用。

2.6Western blot檢測(cè)細(xì)胞E-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)情況 Western blot結(jié)果顯示(圖4)，與陰性對(duì)照組相比，miR-126 mimics轉(zhuǎn)染組SW620細(xì)胞E-cadherin的表達(dá)增加，而Vimentin表達(dá)降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

EMT是指上皮細(xì)胞通過(guò)特定程序轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細(xì)胞的生物學(xué)過(guò)程，是導(dǎo)致上皮來(lái)源的惡性腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟，因此研究結(jié)腸癌EMT發(fā)生的分子機(jī)制，尋找可以逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌EMT的重要分子靶點(diǎn)，在關(guān)鍵步驟對(duì)結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移進(jìn)行干預(yù)，理論上可更有效抑制結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移。然而，EMT相關(guān)信號(hào)通路涉及多個(gè)分子、多條信號(hào)通路，任何針對(duì)單個(gè)分子的干預(yù)方法，都難以達(dá)到理想的逆轉(zhuǎn)效果。因此，有必要尋找新的手段和策略。由于單個(gè)miRNA可以同時(shí)調(diào)控多個(gè)靶基因的表達(dá)，靶向miRNA的干預(yù)理論上能更有效地逆轉(zhuǎn)腫瘤。例如ZEB1 和ZEB2 已被多名研究者證實(shí)為miR-200家族的直接靶基因，在其3′-UTR區(qū)域存在多個(gè)可被miR-200家族成員互補(bǔ)結(jié)合的位點(diǎn)，外源性過(guò)表達(dá)miR-200c 可以下調(diào)ZEB1 的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)上皮細(xì)胞標(biāo)志分子E-cadherin 的表達(dá)，從而抑制腫瘤EMT的發(fā)生[6-8]。

miR-126同樣作為一種“抑癌性miRNA”，已在多項(xiàng)研究中證實(shí)其在正常組織中高表達(dá)、腫瘤組織中低表達(dá)[9,10]。本研究組前期工作亦證實(shí)，miR-126在結(jié)腸癌組織中較正常結(jié)腸組織和癌旁組織表達(dá)降低，且和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有明顯聯(lián)系，提示miR-126可能在結(jié)腸癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移中具有重要的作用。結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480是一種低轉(zhuǎn)移潛能的細(xì)胞系，而SW620和HCT116為高轉(zhuǎn)移潛能的細(xì)胞系。研究已證實(shí)，不同轉(zhuǎn)移潛能的細(xì)胞系亦具有明顯的EMT表型差異。因此本研究首先觀察了不同轉(zhuǎn)移潛能的細(xì)胞系中miR-126的表達(dá)差異，結(jié)果證實(shí)相對(duì)于低轉(zhuǎn)移潛能的結(jié)腸癌細(xì)胞SW480，miR-126在結(jié)腸癌細(xì)胞SW620和HCT116中的表達(dá)明顯更低。對(duì)miR-126低表達(dá)的SW620細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA mimics后，發(fā)現(xiàn)可以抑制細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，進(jìn)一步提示miR-126在結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用。

本研究結(jié)果還表明：miR-126可以促進(jìn)SW620細(xì)胞E-cadherin的表達(dá)增加，降低Vimentin的表達(dá)，提示過(guò)表達(dá)miR-126有助于抑制結(jié)腸癌EMT的發(fā)生。EMT的發(fā)生發(fā)展涉及多條信號(hào)通路，例如RhoA信號(hào)通路、EGFR/PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)通路參與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、血管生成，通過(guò)EMT調(diào)控方式參與腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移[11,12]。低表達(dá)的miR-126可能通過(guò)負(fù)調(diào)控相關(guān)靶基因，激活信號(hào)通路，促進(jìn)EMT的發(fā)生，加速結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

綜上，結(jié)腸癌中miR-126的低表達(dá)可能存在高轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，miR-126抑制結(jié)腸癌細(xì)胞SW620增殖、遷移及侵襲的機(jī)制可能是通過(guò)抑制EMT過(guò)程實(shí)現(xiàn)的，miR-126可能成為新的結(jié)腸癌分子預(yù)警標(biāo)志和新的治療靶點(diǎn)。

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[收稿2017-07-11]

(編輯 張曉舟)

RoleofmiR-126ineffectofbiologicalbehaviourandepithelialtomesenchymaltransition(EMT)inhumancoloncancercells

WEIHai-Feng,MIXu-Guang,LIULei,LUXiao-Dan,LIShou-Qing，TANYan,FANGYan-Qiu.

CenterforMedicalTreatmentandDiagnosis,JilinProvincePeople′sHospital,Changchun130021,China

Objective:To investigate the expression of miR-126 in human colon cancer cell lines with different metastatic potential and its effect on the proliferation,invasion and metastasis of colon cancer cells,and to explore the possible mechanism.MethodsThe expression of miR-126 in human colon cancer cell lines (SW480,SW620 and HCT116) was determined by Real-time fluorescence quantitative PCR.miR-126 mimics were transiently overexpressed in SW620 cells throuIgh liposome transfection and the negative control group was set up.The proliferation ability of cells was detected by CCK8 method and the mobility of cells was detected by wound healing assay and Transwell migration and invasion assay.The expression of E-cadherin,Vimentin was determined by Western blot.ResultsThe expression of miR-126 was decreased in SW620 and HCT116 cells with high metastatic potential compared SW480 cells with low metastatic potential.The overexpression of miR-126 significantly inhibited the proliferation,migration and invasion ability of SW620 cells and Western blot indicated that miR-126 overexpression increased the expression of E-cadherin and decreased the expression of Vimentin in SW620 cells,which was significantly different from that of negative control(P<0.05).ConclusionLow expression of miR-126 is closely related to metastasis of colon cancer and the effect of miR-126 on the biological behavior of colon cancer cells may be mediated by the regulation of the EMT process.

miR-126；Colon cancer；EMT；Tumor biological therapy

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.11.012

①本文受吉林省科技廳自然科學(xué)基金(20150101178JC)、吉林省人社廳省人才開(kāi)發(fā)資金(2016年度)和吉林省科技廳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室建設(shè)專項(xiàng)基金(20160622008JC)資助。

R392R730.5

A

1000-484X(2017)11-1658-04

魏海峰(1978年-)，男，博士，助理研究員，主要從事腫瘤基礎(chǔ)及方面的臨床研究,E-mail：whfweb@163.com。

及指導(dǎo)教師：方艷秋(1968年-)，女，博士，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事腫瘤生物治療基礎(chǔ)與臨床方面的研究,E-mail：yq.fang@163.com。