潘婭嵐 郭 楊 周龍云 苑文超 馬 勇 黃桂成

(南京中醫(yī)藥大學骨傷研究所，南京 210029)

·中醫(yī)中藥與免疫·

脊髓康對共培養(yǎng)體系中小膠質(zhì)細胞吞噬及損傷神經(jīng)元再生的影響①

潘婭嵐 郭 楊②③周龍云 苑文超 馬 勇②黃桂成②

(南京中醫(yī)藥大學骨傷研究所，南京 210029)

目的觀察中藥復方脊髓康對共培養(yǎng)體系中小膠質(zhì)細胞吞噬及損傷神經(jīng)元修復再生的影響。方法制備脊髓康含藥血清，分離、鑒定原代海馬神經(jīng)元、原代小膠質(zhì)細胞，谷氨酸誘導神經(jīng)元損傷，含藥血清預處理小膠質(zhì)細胞，建立小膠質(zhì)細胞/損傷神經(jīng)元共培養(yǎng)體系，采用免疫熒光雙重標記法觀察混培養(yǎng)24 h后小膠質(zhì)細胞對神經(jīng)元碎片的吞噬作用及96 h后損傷神經(jīng)元突起生長情況。結(jié)果混合培養(yǎng)24 h后，脊髓康含藥血清中、高劑量組在吞噬指數(shù)及吞噬百分率方面均高于空白組(P<0.05)，中劑量組低于脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)組(P<0.05)，高劑量組與LPS組間的差異則無統(tǒng)計學意義(P>0.05)?；旌吓囵B(yǎng)96 h后，脊髓康含藥血清中、高劑量組一級突起數(shù)量多于空白組(P<0.05)，與LPS組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。脊髓康中、高劑量組平均突起較空白組長(P<0.05)，與LPS對比，脊髓康中劑量組平均神經(jīng)突起較短(P<0.05)，而高劑量組則平均突起較長(P<0.05)。結(jié)論中藥復方脊髓康可能通過促進小膠質(zhì)細胞吞噬神經(jīng)元碎片，改善局部微環(huán)境，從而促進損傷神經(jīng)元的修復再生。

中藥復方；脊髓康；原代小膠質(zhì)細胞；原代神經(jīng)元；共培養(yǎng)；吞噬作用；神經(jīng)元修復再生

脊髓損傷(Spinal cord injury,SCI)是脊柱疾病和脊柱損傷的嚴重并發(fā)癥，多發(fā)于中青年[1]。流行病學調(diào)查顯示，我國SCI發(fā)病率呈逐年上升趨勢[2]。SCI后自身神經(jīng)元的再生能力有限，一旦損傷難以修復，因而成為骨科及神經(jīng)科學領域的研究熱點和難點。小膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的固有免疫細胞，其調(diào)控免疫應答、吞噬細胞碎片作用在神經(jīng)生理病理性變化中意義重大[3,4]。目前，中醫(yī)藥對小膠質(zhì)細胞吞噬作用的研究較少，基于此，本研究旨在觀察SCI有效組方脊髓康[5-7]對小膠質(zhì)細胞吞噬作用的影響，并探討該影響與神經(jīng)修復再生的相關(guān)性，擬為中醫(yī)藥治療SCI提供一定的科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗動物 健康SD雄性大鼠20只，8周齡，體重(190±10)g；孕18 d SD母鼠1只，新生1～2 d SD大鼠5只。動物均由南京中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，許可證號SYXK(蘇)2014-0001。

1.1.1實驗藥物 脊髓康(生黃芪30 g，當歸12 g，丹參20 g，地鱉蟲10 g，赤芍12 g，淫羊藿10 g，制大黃10 g等)為馬勇教授臨床經(jīng)驗方(國家發(fā)明專利ZL200910026193.7) ，其生藥由南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院提供。

1.1.2儀器與試劑 倒置熒光顯微鏡(Leica，德國)；體視顯微鏡(Olympus，日本)；DMEM高糖、DMEM/F12培養(yǎng)基、FBS、B27、0.25胰酶(含EDTA) (Thermofisher,美國)；L-谷氨酰胺、脂多糖 (Lipopolysaccharide,LPS)、多聚賴氨酸(Sigma,美國)；凋亡試劑盒(Roche,瑞士)；CD11b 小鼠抗大鼠多克隆抗體(CBL1512,Milipore,美國)；β III Tubulin兔抗鼠單克隆抗體(#5568,CST,美國)；Alexa 594羊抗兔、Alexa 488羊抗小鼠(SA00006-4,SA00006-1,武漢三鷹)。

1.2實驗方法

1.2.1含藥血清制備 脊髓康原方，加10倍水量，常規(guī)煎煮，濾液濃縮至2 g生藥/ml，4℃保存?zhèn)溆?。健康SD雄性大鼠隨機分為空白組和給藥組。給藥組以生藥量20 g/kg灌胃，連續(xù)給藥3 d，空白組給予等量生理鹽水。末次給藥后1 h腹主動脈采血，37℃靜置1 h，3 000 r/min離心10 min，取上清，56℃水浴30 min滅活補體，0.22 μmol/L的微孔濾膜過濾除菌，分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2原代細胞分離、培養(yǎng)

1.2.2.1原代小膠質(zhì)細胞分離、培養(yǎng) 參考相關(guān)文獻所述方法[8,9]，取新生SD大鼠，逐一經(jīng)75%酒精消毒30 s，斷頭完整取出大腦及腦干；體視顯微鏡下，剝離血管膜，去除腦干及海馬，剪碎腦皮質(zhì)，暫存于0℃DMEM高糖+10%FBS培養(yǎng)基中；取剪碎腦皮質(zhì)，離心去上清，加入0.125%胰酶5 ml重懸，移入10 cm培養(yǎng)皿，于CO2培養(yǎng)箱中消化15 min；加入1 ml 血清終止消化，加入2 ml全培緩慢吹打，靜置后吸取上清；2 000 r/min離心2 min，移去上清，以DMEM/F12+10%FBS培養(yǎng)基重懸；細胞計數(shù)后，以2.5×105個細胞/ml密度接種于包被賴氨酸的6孔板中，置于CO2培養(yǎng)箱中孵育；4 h及24 h后更換DMEM/F12+10%FBS培養(yǎng)基，之后每2～3 d更換一次培養(yǎng)液。細胞培養(yǎng)15 d后，吸取原培養(yǎng)基并保留，以DMEM/F12洗滌1 min后吸除，每孔加入DMEM/F12稀釋的0.062 5%胰酶2 ml，于37℃ CO2培養(yǎng)箱中孵育25～40 min，每孔加入DMEM/F12+10%FBS 2 ml終止消化；小心吸去未貼壁細胞，以DMEM/F12+10%FBS新鮮培養(yǎng)基與上述保留混合膠質(zhì)細胞培養(yǎng)基1∶1混合，每孔加入2 ml繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)1～2 d后行鑒定及進行實驗。

1.2.2.2原代神經(jīng)元分離、培養(yǎng) 取孕期18 d母鼠，戊巴比妥鈉麻醉，剖腹取出子宮，剝離取出胎盤，迅速分離所有胎鼠大腦及腦干，暫存于0℃ DMEM/F12+10%FBS培養(yǎng)基中；體視顯微鏡下，暴露海馬體，剝離血管膜，剪碎海馬體，暫存于0℃ DMEM/F12+10%FBS培養(yǎng)基；取剪碎海馬體，移入10 cm培養(yǎng)皿，5 ml針筒吹打組織混懸液20次，經(jīng)40 μm細胞篩過濾；2 000 r/min離心2 min，移去上清，加入DMEM/F12+10%FBS+B27重懸；計數(shù)細胞，以2×105個細胞/ml密度接種于包被賴氨酸的24孔板中，置37℃ CO2培養(yǎng)箱中孵育；4 h后更換DMEM/F12+10%FBS+B27培養(yǎng)基，加入10 μmol/L阿糖胞苷干預24 h，次日更換培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育，培養(yǎng)7～12 d神經(jīng)元行鑒定及后續(xù)實驗。

1.2.3神經(jīng)元損傷模型的建立 取培養(yǎng)神經(jīng)元，隨機分為正常組及模型組。吸去原培養(yǎng)基，以PBS洗滌3次，正常組加入DMEM/F12繼續(xù)培養(yǎng)，模型組加入含100 μmol/L谷氨酸DMEM/F12干預30 min，30 min后兩組吸去培養(yǎng)基，以PBS洗滌3次，換DMEM/F12+10%FBS+B27培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后神經(jīng)元凋亡模型經(jīng)AnnexinV-FITC/PI雙染流式檢測鑒定。

1.2.4實驗分組 脊髓康含藥血清分為2.5%(低)、5%(中)、10%(高)含藥血清組，同時設置10%空白血清組、1 μg/ml LPS+10%空白血清組(陽性對照組)[10,11]。2.5%、5%含藥血清組用空白血清稀釋，臨用時將各組血清加入DMEM/F12培養(yǎng)液中，并使培養(yǎng)液中血清終濃度為10%。

1.2.5小膠質(zhì)細胞/損傷神經(jīng)元共培養(yǎng)體系 參考相關(guān)文獻所述方法[12,13]，取培養(yǎng)10 d神經(jīng)元，每孔加入100 μmol/L谷氨酸DMEM/F12干預30 min，換DMEM/F12+10%FBS+B27培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。回收原代培養(yǎng)小膠質(zhì)細胞，以DMEM/F12+B27調(diào)整細胞密度為2×105個細胞/ml，配置2.5%、5%、10%含藥血清、10%空白血清及1 μg/ml LPS+10%空白血清細胞懸液，每孔500 μl接種于賴氨酸包被的24孔板內(nèi)過夜。次日，回收谷氨酸誘導的損傷神經(jīng)元，每孔加入100 μl 0.25%胰酶，10 s后吸去胰酶，1～2 min后加入1 ml DMEM/F12+10%FBS終止消化，并輕勻吹打，回收、離心、重懸，以DMEM/F12+10%FBS+B27調(diào)整細胞密度為2×104個細胞/ml；吸除接種小膠質(zhì)細胞板內(nèi)培養(yǎng)基，PBS洗滌3次，每孔500 μl接種神經(jīng)元細胞混懸液與小膠質(zhì)細胞混合培養(yǎng)，每組6個平行孔。

1.2.6細胞免疫熒光化學染色 小膠質(zhì)細胞/損傷神經(jīng)元混合培養(yǎng)24 h后，每組取3個平行孔，吸去培養(yǎng)基，PBS洗滌3次；4%多聚甲醛固定10 min，0.2%Triton-100通透10 min,PBS洗滌；1.5%山羊血清的PBS室溫封閉60 min；分別加入一抗：兔抗β3-tubulin結(jié)合神經(jīng)元骨架、小鼠抗CD11b(1∶200)結(jié)合小膠質(zhì)細胞相關(guān)膜蛋白，4℃過夜；PBS洗滌細胞3次，加入二抗Alexa 594羊抗兔、Alexa 488羊抗小鼠，室溫避光孵育2 h；PBS洗滌細胞3次，于倒置熒光顯微鏡下觀察。200倍鏡下每組隨機選取6個視野，計數(shù)視野下小膠質(zhì)細胞數(shù)(N)，吞噬碎片小膠質(zhì)細胞數(shù)(n)，被吞噬碎片數(shù)(m)，計算吞噬百分率(n/N)、吞噬指數(shù)(m/N)，攝取圖像時以PBS洗滌或晃動培養(yǎng)板以觀察神經(jīng)元碎片是否移動，確保碎片在小膠質(zhì)細胞胞內(nèi)。

小膠質(zhì)細胞/損傷神經(jīng)元混合培養(yǎng)96 h后，按上述方法孵育一抗β3-tubulin、二抗Alexa 594，Dapi復染。每組隨機選取15個神經(jīng)元，記錄每個神經(jīng)元一級突起(從胞體直接發(fā)出的突起的)數(shù)量，運用Image-Pro Plus 6.0曲線測量功能，測量并計算每個神經(jīng)元一級突起平均長度。

1.2.7流式細胞儀檢測凋亡率 谷氨酸造模后24 h，胰酶消化以EP管回收神經(jīng)元，細胞計數(shù)使每管細胞量在0.5×105～5×105個；200 g離心5 min，PBS漂洗，再次重復離心2次；每1ml結(jié)合緩沖液加入20 μl AnnexinV-FITC及20 μl PI染色試劑，輕輕混勻；每EP管加入100 μl AnnexinV-FITC/PI染色混合液，避光孵育10～15 min，設置不加AnnexinV-FITC及PI的樣本為陰性對照，單加AnnexinV-FITC及PI的樣本做調(diào)節(jié)補償。每樣本加入800 μl PBS上機檢測。

2 結(jié)果

2.1原代細胞分離、培養(yǎng) 18 d齡胎鼠分離、培養(yǎng)的神經(jīng)元及新生鼠分離、純化的小膠質(zhì)細胞，見圖1。

2.2原代細胞的鑒定 神經(jīng)元經(jīng)β III Tubulin特異性染色、小膠質(zhì)細胞經(jīng)CD11b特異性染色，結(jié)果示兩種原代細胞純度≥95%，見圖2。

2.3神經(jīng)元損傷模型的鑒定 AnnexinV-FITC/PI雙染經(jīng)流式檢測顯示：正常組神經(jīng)元凋亡率為(2.5±2.9)%，模型組神經(jīng)元凋亡率為(23.9±2.5)%，模型組神經(jīng)元凋亡率明顯高于正常組(P<0.05)，提示谷氨酸誘導神經(jīng)元損傷模型的成功建立，見圖3。

2.4脊髓康對小膠質(zhì)細胞神經(jīng)元碎片吞噬作用的影響 共培養(yǎng)后24 h，以一抗β3-tubulin、二抗Alexa 594標記神經(jīng)元骨架及碎片，以一抗CD11b、二抗Alexa 488標記小膠質(zhì)細胞相關(guān)膜蛋白，觀察小膠質(zhì)細胞對神經(jīng)元碎片的吞噬作用，經(jīng)PBS洗滌或晃動培養(yǎng)板，所觀察到的與小膠質(zhì)細胞重疊的神經(jīng)元碎片均未出現(xiàn)明顯移位。結(jié)果顯示：脊髓康含藥血清中、高劑量組在吞噬指數(shù)及吞噬百分率方面均高于空白組(P<0.05)，中劑量組低于LPS組(P<0.05)，高劑量組與LPS組間差異則無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖4、5。

圖1 原代細胞的分離培養(yǎng) Fig.1 Isolation and culture of primary cellsNote: A.SD rat of pregnant 18 d;B.Neurons cultured for 10 d;C.Purified primary microglia.scale bar 50 μm.

圖3 Annexin V-FITC/PI雙染流式檢測細胞凋亡Fig.3 Flow cytometry detecting cell apoptosis by Annexin V-FITC/OI staining

圖4 觀察脊髓康對小膠質(zhì)細胞吞噬神經(jīng)元碎片的影響Fig.4 Effect of Jisuikang on phagocytosing neuron debris by microgliaNote: A.Control;B.Low dose of Jisuikang；C.Middle dose of Jisuikang;D.High dose of Jisuikang;E.LPS.Scale bar：20 μm.

圖5 各組小膠質(zhì)細胞吞噬百分率、吞噬指數(shù)比較Fig.5 Phagocytosis percentage and index of microglia in each groupNote: JSK-L.Low dose of Jisuikang;JSK-M.Middle dose of Jisuikang;JSK-H.High dose of Jisuikang.Compared with control,**.P<0.01;compared with LPS,##.P<0.01.

2.5脊髓康對小膠質(zhì)細胞/損傷神經(jīng)元混培養(yǎng)體系存活神經(jīng)元生長的影響 共培養(yǎng)96 h后，觀察存活神經(jīng)元生長情況。結(jié)果顯示：脊髓康含藥血清中、高劑量組一級突起數(shù)量多于空白組，與LPS組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。脊髓康提高了神經(jīng)元平均突起長度，與LPS對比，脊髓康中劑量組平均神經(jīng)突起較短，而高劑量組則平均突起較長，見圖6、7。

圖6 存活神經(jīng)元的生長情況Fig.6 Growth of surviving neuronsNote: A.Control;B.Low dose of Jisuikang；C.Middle dose of Jisuikang;D.High dose of Jisuikang;E.LPS.Scale bar：20 μm.

圖7 各組存活神經(jīng)元的一級突起數(shù)量及平均長度對比Fig.7 Number and average length of primary neurites of each surviving neuron in each groupNote: JSK-L.Low dose of Jisuikang;JSK-M.Middle dose of Jisuikang;JSK-H.High dose of Jisuikang.compared with control，**.P<0.01;compared with LPS，#.P<0.05,##.P<0.01.

3 討論

小膠質(zhì)細胞是機體重要的固有免疫細胞，其數(shù)量約占中樞神經(jīng)系統(tǒng)細胞總數(shù)的10%。當SCI發(fā)生時，小膠質(zhì)細胞被迅速激活，介導多種免疫應答，發(fā)揮清道夫樣作用，對疾病的發(fā)生、發(fā)展及恢復有著重要意義[4,14-17]。目前，中醫(yī)藥調(diào)控小膠質(zhì)細胞治療SCI的研究較少，已有研究表明部分中藥能夠抑制小膠質(zhì)細胞過度激活所致的免疫炎性反應，從而起到保護神經(jīng)的作用[18,19]，但中藥對小膠質(zhì)細胞吞噬作用的影響，以及該影響與神經(jīng)修復間的關(guān)系依舊是片盲區(qū)。

LPS是激活小膠質(zhì)細胞，促進其吞噬功能的有效化學試劑[20,21]。目前，提取、純化原代神經(jīng)元、小膠質(zhì)細胞尚存在一定難度，但鑒于細胞株與原代細胞功能等方面的一些差別，本實驗前提條件仍設定以原代細胞進行研究。實驗過程中，對提取的原代小膠質(zhì)細胞及神經(jīng)元損傷模型均行鑒定，確保了實驗前提的可靠性。中樞神經(jīng)系統(tǒng)是一個由多種膠質(zhì)細胞及神經(jīng)元構(gòu)成的復雜體系，SCI的發(fā)生亦并非是單一系統(tǒng)或某一細胞群的病變。因此，建立一個多因素、立體式復雜混合體系，模擬中樞神經(jīng)系統(tǒng)的構(gòu)成，應是SCI體外研究的潛在方向所在。但目前，中醫(yī)藥干預神經(jīng)細胞共培養(yǎng)體系的研究甚少，本研究則立于中醫(yī)學“整體觀”核心理念，初步建立了一個簡單的、模擬整體的神經(jīng)細胞混合體系。本次研究數(shù)據(jù)顯示，共培養(yǎng)24 h后，脊髓康組隨著含藥血清濃度的升高，吞噬指數(shù)及吞噬百分率呈依次上升趨勢，其中脊髓康中、高劑量組在上述兩方面均高于空白組，脊髓康高劑量組與LPS組對比則并無顯著差異，提示脊髓康能提高小膠質(zhì)細胞的吞噬功能，且存在一定的量效關(guān)系。共培養(yǎng)96 h后，LPS組存活神經(jīng)元平均突起較空白組長，研究表明，小膠質(zhì)細胞的清道夫樣作用可通過清除凋亡神經(jīng)元，減少毒性物質(zhì)、細胞因子等釋放，進而抑制SCI后過度的免疫炎性反應，以利于損傷神經(jīng)元的修復再生[22,23]。故本實驗中，LPS可能通過促進小膠質(zhì)細胞吞噬神經(jīng)元碎片作用，改善局部微環(huán)境，促進存活神經(jīng)元的修復再生，這與之前報道的研究結(jié)果有著一致性[13]。脊髓康含藥血清低、中、高劑量組，在提高小膠質(zhì)細胞吞噬功能同時，亦觀察到了其促進存活神經(jīng)元生長的現(xiàn)象，且其與小膠質(zhì)細胞吞噬功能的高低有著一定相關(guān)性。鑒于本實驗采用的是含藥血清預處理小膠質(zhì)細胞的方法，混培養(yǎng)體系并無含藥血清的存在，我們認為，含藥血清并不是本實驗中促進存活神經(jīng)元生長的直接因素，而與LPS有著類似之處，即中藥復方脊髓康可能通過促進小膠質(zhì)細胞清理神經(jīng)毒性物質(zhì)，改善局部微環(huán)境，從而促進存活神經(jīng)元的再生長。據(jù)實驗結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)存活神經(jīng)元的再生長與小膠質(zhì)細胞的吞噬功能并不呈完全的正相關(guān)，LPS組小膠質(zhì)細胞吞噬功能與脊髓康高劑量組無明顯差異，且其在吞噬指數(shù)及吞噬百分率方面平均值均高于后者，但存活神經(jīng)元的平均突起短于脊髓康高劑量組，這可能與LPS激活小膠質(zhì)細胞后，其同樣釋放系列促炎因子相關(guān)。

《難經(jīng)·二十八難》：“督脈者，起于下極之俞，并于脊里，上至風府，入屬于腦”[24]，吳以嶺指出：“督脈，其循行路線恰在脊髓與腦，督脈虛損，奇陽虛乏，不僅統(tǒng)率、督促全身陽氣的作用減弱，其循行部位受累尤甚，脊髓失于溫養(yǎng)而發(fā)病，與現(xiàn)代醫(yī)學 SCI 發(fā)病位置及機制極為吻合”。因此，督脈反映或代表了脊髓的部分或絕大部分功能，而督脈病證大多是脊髓和腦的病證。但督脈絕不是孤立存在的，督脈的物質(zhì)基礎是腎所藏之精，它的能量產(chǎn)生是靠腎精化生的，如《臨證指南醫(yī)案·調(diào)經(jīng)》：“八脈隸乎肝腎”[25]。鑒于督脈、腎精在 SCI 及修復中的積極意義，我們結(jié)合多年的臨床實踐將 SCI的病機歸納為“腎督虛損，瘀阻督脈，樞機統(tǒng)率失職”，并篩選出具有“祛瘀通督，溫腎利濕，調(diào)和氣血”之功效的溫腎通督方脊髓康。該方以生黃芪為君，大補元氣，壯督通瘀，體內(nèi)研究表明，黃芪能下調(diào)超氧化物歧化酶、丙二醛水平，抑制SCI后神經(jīng)元凋亡，促進SCI后大鼠運動功能的恢復[26,27]。配以大黃、枳實、川芎、水蛭、蜈蚣之品行氣活血，祛瘀生新，現(xiàn)代研究提示，大黃提取物能降低局部炎性因子、氧化活性物水平，保護血脊髓屏障，減少CNS損傷后神經(jīng)元的繼發(fā)凋亡[28,29]，川芎嗪能改善脊髓血流，抑制細胞凋亡，降低局部炎性因子水平，清除氧自由基，發(fā)揮著抗炎、抗凋亡、抗氧化以改善SCI損傷局部微環(huán)境的作用[27]。輔以溫補腎陽之肉蓯蓉、仙靈脾等溫腎祛寒，又加厚樸、澤瀉、車前子等利水化濕，全方體現(xiàn)著“溫腎、通督”兩大原則，共奏袪瘀通督，溫腎利濕之效。前期基礎研究及臨床研究均提示該方對SCI有著良好的功效，在改善脊髓微環(huán)境，促進SCI后患者神經(jīng)功能的恢復方面療效顯著[5-7]。本次研究則涉足中醫(yī)藥研究較少關(guān)注之處，基于小膠質(zhì)吞噬作用角度探討了脊髓康對神經(jīng)的保護作用，從新的方向闡釋了脊髓康溫腎通督的科學內(nèi)涵。

我們認為本次實驗有一定創(chuàng)新之處，但亦存在一些缺陷：①本實驗提取的原代細胞未對其進行常規(guī)功能的檢測，未能確定其活力及是否保持細胞原有特性；②本實驗采用的混合培養(yǎng)體系與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的復雜構(gòu)成差異仍較大，小膠質(zhì)細胞與神經(jīng)元的比例不一；③本研究未進行通路機制研究，仍缺少一定證據(jù)。綜上，脊髓康可能通過促進小膠質(zhì)細胞吞噬神經(jīng)元碎片作用，改善局部微環(huán)境，從而促進損傷神經(jīng)元的修復再生，但其詳細機制仍待進一步研究。

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[收稿2017-03-15 修回2017-04-14]

(編輯 張曉舟)

EffectsofChineseherbalcompound"Jisuikang"onphagocytosisofmicrogliaandregenerationofinjuredneuronsinco-culturesystem

PANYa-Lan,GUOYang,ZHOULong-Yun,YUANWen-Chao,MAYong,HUANGGui-Cheng.

InstituteofOrthopedicsandTraumatologyofNanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210029，China

Objective:To observe the effects of Chinese herbal compound 'Jisuikang' on the phagocytosis of microglia and the regeneration of injured neurons in co-culture system.MethodsPrepared drug serum of ‘Jisuikang′ and isolated and identified the primary neuron and microglia.The neuron cells were induced apoptosis by glutamic acid and the microglia cells were predisposed by drug serum of 'Jisuikang'.Then,the co-culture system of injured neurons and microglia cells was established.24 h and 96 h after co-culture,engulfment of neuron debris by microglia cells and regeneration of injured neurons were observed by immunofluorescence double labeling method.Results24 h after co-culture,middle and high dose of 'Jisuikang' showed greater phagocytic percentage and phagocytic index than that of control.In comparison of LPS,high dose of 'Jisuikang' showed no significant difference.96 h after co-culture,first grade of neuritis of middle and high dose of 'Jisuikang' were more than that of control,and there were no significant difference in comparison of LPS.Neuritis' mean length per cell of middle and high dose of 'Jisuikang' were larger than that of control.Neuritis' mean length per cell of high dose of 'Jisuikang' showed significant difference in comparison of LPS.ConclusionTraditional Chinese medicine compound 'Jisuikang' may enhance engulfment of neuron debris by microglia to improve local microenvironment,which promote the repair and regeneration of injured neurons.

Herbal compound;Jisuikang;Primary microglia;Primary neurons;Co-culture;Phagocytosis;Regeneration of neurons

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.11.011

①本文受國家自然科學基金青年項目(81704100)、國家自然科學基金面上項目(81573997)和江蘇省高校自然科學研究面上項目(15KJD360001)資助。

②同時供職于南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，南京 210029。

③通訊作者，E-mail：drguoyang@126.com。

R274.9

A

1000-484X(2017)11-1652-06

潘婭嵐(1989年-)，女，在讀博士，主要從事醫(yī)藥治療創(chuàng)傷與骨關(guān)節(jié)并的研究。