陶開宇 安 琪 杜 磊 程海峰 蔣大銘 胡章龍

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院心臟大血管外科，杭州 310009)

體外循環(huán)中調(diào)節(jié)血小板功能對大鼠全身炎性反應(yīng)及肺氧合功能的影響①

陶開宇 安 琪②杜 磊③程海峰 蔣大銘 胡章龍

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院心臟大血管外科，杭州 310009)

目的探討體外循環(huán)(ECC)中調(diào)節(jié)血小板功能對大鼠全身炎性反應(yīng)及肺氧合功能的影響。方法將參與ECC模型的大鼠隨機分為ECC中補充血小板組(MH組)、ECC中補充血漿組(MP組)和持續(xù)泵入替羅非班(Tirofiban)+ECC中補充血小板組(TMH組)，每組8只大鼠。3組大鼠ECC持續(xù)2 h，術(shù)后觀察2 h。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測3組大鼠血漿及肺泡灌洗液中炎性因子，測量氧合指數(shù)、肺組織含水量，采用流式細(xì)胞術(shù)測定循環(huán)內(nèi)皮數(shù)量，蘇木精-伊紅染色病理學(xué)觀察大鼠肺組織病理改變。分析調(diào)節(jié)血小板功能對ECC大鼠全身炎性反應(yīng)水平、血管內(nèi)皮損傷程度、肺組織水腫程度和肺氧合功能的影響。結(jié)果ECC后2 h，MH組與MP組大鼠血小板數(shù)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，TMH組大鼠明顯高于MH、MP組大鼠(P<0.05)。ECC后2 h，3組大鼠氧合指數(shù)低于ECC開始時(P<0.05)，3組大鼠肺組織含水量比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，MH組大鼠支氣管肺泡灌洗液中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(NE)水平低于TMH組大鼠(P<0.05)，TMH組大鼠血漿中NE水平明顯低于MP組大鼠(P<0.05)。ECC結(jié)束時，3組大鼠循環(huán)內(nèi)皮數(shù)量比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。肺組織病理學(xué)檢查提示MH組大鼠肺間質(zhì)較其他各組薄，炎性細(xì)胞浸潤少。結(jié)論在ECC早期血小板急劇減少后立即補充新鮮血小板能明顯減輕循環(huán)中的炎性反應(yīng)，該保護(hù)效應(yīng)可能與血小板黏附于ECC相關(guān)炎性反應(yīng)所致的內(nèi)皮損傷處并減少中性粒細(xì)胞與內(nèi)皮下組織黏附有關(guān)。提示在ECC中保持一定數(shù)目且具有正常黏附聚集功能的血小板，可能降低ECC術(shù)后炎性反應(yīng)和肺損傷，改善預(yù)后。

體外循環(huán)；血小板；炎性反應(yīng)；肺氧合功能

體外循環(huán)(Extracorporeal circulation，ECC)相關(guān)肺功能損傷是導(dǎo)致心臟外科患者術(shù)后預(yù)后不良甚至死亡的重要原因[1]。ECC能導(dǎo)致全身炎性反應(yīng)，血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，血管內(nèi)皮通透性增加，血管中液體外滲至肺組織中，導(dǎo)致肺組織水腫，順應(yīng)性下降，肺功能損害，表現(xiàn)為急性肺損傷甚至急性呼吸窘迫綜合征[2]。內(nèi)皮損傷時，循環(huán)中的內(nèi)皮祖細(xì)胞和鄰近的成熟內(nèi)皮細(xì)胞參與內(nèi)皮修復(fù)，然而修復(fù)時間較長，很難在短時間內(nèi)完成[3]。內(nèi)皮破損時血小板可能是參與內(nèi)皮修復(fù)的主要成分[4]。激活的血小板能與內(nèi)皮細(xì)胞及內(nèi)皮下組織形成緊密連接，從而完成對損傷血管壁的緊急修復(fù)[5]。因此推測：血小板可能是對ECC造成的內(nèi)皮損傷進(jìn)行早期修復(fù)的主要成分。然而ECC時由于血小板與ECC管路異物表面接觸、激活、黏附，以及ECC中使用肝素等可導(dǎo)致血小板數(shù)量明顯減少，特別是ECC開始早期。本文探討在圍ECC期補充新鮮血小板對正常功能血小板數(shù)量和肺損傷的影響，現(xiàn)作如下報道。

1 材料與方法

1.1實驗動物和試劑 雄性SD大鼠48只，7～8周齡，體重250～300 g，由四川省動物實驗中心提供。ELISA試劑：中心粒細(xì)胞彈性蛋白酶抗體購自中國USCNLIFE公司。流式細(xì)胞抗體：CD146抗體、藻紅蛋白標(biāo)記的抗大鼠CD146抗體(Phycoerythrin(PE)-conjugated mouse monoclonal anti-rat MCAM/CD146)、CD146抗體同型對照購自美國R&D Systems公司，VEGFR2(KDR)抗體購自美國Novusbio公司，VEGFR2抗體同型對照購自美國GeneTex公司，異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的KDR二抗購自美國Thermo公司。

1.2方法

1.2.1血小板采集 濃縮血小板均實驗當(dāng)日制備。戊巴比妥鈉50 mg/kg行腹腔內(nèi)注射麻醉，麻醉后固定于鼠板，嬰幼兒喉鏡顯露下行氣管插管(動脈留置針16G)。用小動物呼吸機機械通氣，呼吸頻率為60 BPM，潮氣量15 ml/(kg·min)，吸入氣體氧濃度為40%。橫斷大鼠左側(cè)肋骨開胸以顯露心臟，右心室穿刺抽血，輕柔注入枸櫞酸鈉抗凝的采血管中。血小板供體鼠采血后麻醉過量處死。

1.2.2血小板分離 所采全血立即制備濃縮血小板血漿，根據(jù)參考文獻(xiàn)[6]，具體步驟如下：梯度離心共8 min：500 r/min 4 min,3 000 r/min 4 min；移除上層血漿連同白膜層及白膜層下方少量紅細(xì)胞于另一空白采血管中,室溫放置1 h；第二次梯度離心共6 min,300 r/min 2 min,500 r/min 4 min；移除上層血漿于另空白采血管中；最后將第二次分離的血漿以5 000 r/min,離心6 min；移除上層血漿至空白采血管中-20℃冷凍備用；余下0.5 ml即為濃縮血小板血漿。

1.2.3血漿制備 試驗用大鼠血漿均實驗當(dāng)天制備。抽大鼠全血2 ml輕柔注入采血管中，立即離心(4℃，3 500 r/min，10 min)，取上清液備用。

1.2.4實驗分組 隨機數(shù)字表法將大鼠分別歸為ECC中補充血小板組(MH組)、ECC中補充血漿組(MP組)和替羅非班(Tirofiban)+ECC中補充血小板組(TMH組)，每組8只，共24只大鼠。另外24只大鼠作為血小板及血漿供體。

1.2.5ECC建立過程 大鼠體外循環(huán)建立流程根據(jù)作者前期研究報道[7]。大鼠編號，稱重并記錄。戊巴比妥鈉50 mg/kg行腹腔內(nèi)注射麻醉，麻醉后固定于鼠板，嬰幼兒喉鏡顯露下行氣管插管(動脈留置針16G)并固定于上唇。用小動物呼吸機機械通氣，呼吸頻率為60 BPM，潮氣量15 ml/(kg·min)，吸入氣體氧濃度為40%。大鼠頸部和左側(cè)大腿根部內(nèi)側(cè)備皮消毒，解剖暴露右頸總動脈和左股靜脈，左股靜脈置入24G套管針，后接三通，經(jīng)左股靜脈行全身肝素化(3 mg/kg)后10 min，于右頸總動脈插20G套管針及三通，三通側(cè)孔接生物機能實驗系統(tǒng)，檢測動脈血壓。置管成功后，所有管道縫于皮膚妥善固定。

1.2.6各組補充血小板時機 MH組在ECC開始后15 min時經(jīng)股靜脈三通活塞緩慢推注濃縮血小板0.5 ml。MP組則在ECC開始15 min時經(jīng)股靜脈三通活塞緩慢推注0.5 ml新鮮冰凍血漿。TMH組則在麻醉后立即緩慢推注替羅非班60 μg/kg，并在ECC中持續(xù)經(jīng)股靜脈三通活塞肝素帽持續(xù)泵入替羅非班0.5 μg/(kg·min)至ECC結(jié)束，ECC開始后15 min時補充0.5 ml富血小板血漿。

1.2.7標(biāo)本及數(shù)據(jù)采集

1.2.7.1血氣分析 各組大鼠于ECC開始時、ECC結(jié)束時(ECC開始后2 h)、ECC后2 h抽取動脈血檢查血氣(iSTAT)并記錄，以評價大鼠肺氧合功能情況，并根據(jù)動脈二氧化碳分壓適當(dāng)調(diào)整呼吸機參數(shù)，如呼氣壓力和呼吸次數(shù)，使動脈PaCO2維持在35～40 mmHg之間。氧合指數(shù)計算公式：氧合指數(shù)(OI) = PaO2/FiO2(吸入氧濃度FiO2=40%)。

1.2.7.2血常規(guī)分析 各組大鼠于ECC開始時、ECC 15 min、ECC 20 min、ECC結(jié)束時和ECC后2 h分別取全血約20 μl檢測血常規(guī)并記錄，用以檢測血小板數(shù)量。

1.2.7.3肺組織含水量檢測 各組大鼠于ECC后2 h，橫斷大鼠肋骨開胸，結(jié)扎右肺下葉，結(jié)扎線遠(yuǎn)端剪除肺組織，用棉簽輕輕擦干肺組織表面液體，稱重并記錄。將肺組織放置于60℃干燥烘箱中架空放置72 h后稱重，用以下公式計算肺組織含水量以評價肺組織水腫情況：肺組織含水量=(肺組織濕重-肺組織干重)/肺組織濕重×100%。

1.2.7.4肺組織病理學(xué)檢查 獲取用于檢測含水量的肺組織后，結(jié)扎右肺中葉，結(jié)扎線遠(yuǎn)端剪除肺組織，立即置入4%多聚甲醛中保存用以制備HE染色病理切片。

1.2.7.5血漿及肺泡灌洗液中中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(NE)水平檢測 血漿標(biāo)本：各組大鼠于ECC開始前(0.5 ml，減少ECC前失血)、ECC結(jié)束時(1 ml)、ECC后2 h(1 ml)抽血輕柔注入EDTA抗凝采血管中，立即離心(4℃，3 500 r/min，10 min)，取上清液分裝于兩個EP管中置于-70℃冰箱冷凍保存以備檢測血漿中炎性因子水平。并根據(jù)ELISA試劑盒說明書要求測定血漿NE濃度。

支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本采集按文獻(xiàn)[8]：各組大鼠于ECC后2 h，經(jīng)前頸部切口將氣管綁于氣管插管。經(jīng)氣管插管注入4 ml生理鹽水，輕輕拍打大鼠胸廓，靜置5 min后緩慢抽出生理鹽水。立即離心(4℃，3 500 r/min)，取上清液分裝于兩個EP管中置于-70℃冰箱冷凍保存以備檢測支氣管肺泡灌洗液中炎性因子NE水平，以評價肺組織中炎性反應(yīng)水平。

1.2.7.6流式細(xì)胞術(shù)檢測循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞 循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞用CD146+與KDR+作為篩選指標(biāo)，雙陽性細(xì)胞可認(rèn)定為循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞。ECC結(jié)束時取大鼠1 ml全血，根據(jù)抗體說明書進(jìn)行操作。

2 結(jié)果

2.1大鼠一般情況 3組大鼠體重差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，MP組1只大鼠死亡，死亡原因為手術(shù)野出血，MP組增補1只大鼠，使各組大鼠數(shù)量為8只。濃縮血小板血漿經(jīng)檢測，血小板濃度為(7 853.58±849.65) × 109L-1，血小板收獲率為(61.2±7.6)%，白細(xì)胞混雜數(shù)目為(5.06±0.35)× 108L-1，紅細(xì)胞混雜數(shù)目為(11.7±1.6 )× 109L-1，血小板收獲率已達(dá)到美國血庫協(xié)會(AABB)標(biāo)準(zhǔn)[9]，即血小板收獲率60%。

2.23組大鼠不同時點血液中血小板數(shù)量的比較 3組大鼠ECC開始時血小板數(shù)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。實驗過程中MP組大鼠血小板逐漸降低，且明顯低于ECC開始時(P<0.05)。ECC開始后15 min MH組大鼠血小板明顯降低，補充血小板后增加至(811.2±189.1)×109L-1(ECC 20 min)，與ECC開始時比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，隨后逐漸降低，明顯低于ECC開始時(P<0.05)。實驗過程中TMH組大鼠血小板降低無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。ECC開始后15 min TMH組大鼠血小板且明顯高于同一時間點MH組與MP組大鼠(P<0.05)。ECC開始后20 min TMH組與MH組大鼠血小板數(shù)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義，且都明顯高于MP組大鼠(P<0.05)。ECC結(jié)束時TMH組大鼠血小板數(shù)量明顯高于MH組與MP組大鼠，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。ECC后2 h，MH組與MP組大鼠血小板數(shù)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但TMH組大鼠明顯高于MH、MP組大鼠(P<0.05)。表明應(yīng)用替羅非班能明顯減少ECC術(shù)中血小板消耗。

GroupsECCatthebeginningECC15minECC20minAttheendofECCAt2hafterECCTMHgroup(n=8)869.5±90.3756.9±125.62)3)935.7±100.22)822.0±131.02)3)755.2±92.72)3)MHgroup(n=8)894.8±61.7547.5±109.61)811.2±189.12)544.5±128.91)521.9±109.01)MPgroup(n=8)926.3±93.9534.4±104.41)532.3±116.81)481.2±120.81)445.8±138.11)

Note：Compared with ECC at the beginning,1)P<0.05;compared with MP group,2)P<0.05;compared with MH group,3)P<0.05.

2.33組大鼠不同時點氧合指數(shù)的比較 ECC開始時、ECC結(jié)束時、ECC后2 h 3組大鼠氧合指數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。ECC后2 h各組大鼠氧合指數(shù)低于ECC開始時(P<0.05)，見表2。

2.43組大鼠ECC后2 h肺組織含水量的比較 由于3組大鼠ECC前無法檢測肺組織含水量，僅檢測ECC后2 h肺組織含水量，TMH、MH、MP組大鼠ECC后2 h肺組織含水量分別為(79.1±1.3)%、(79.0±1.4)%、(79.8±2.5)%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.53組大鼠ECC后2 h支氣管肺泡灌洗液中NE水平的比較 由于各組大鼠ECC前無法檢測支氣管肺泡灌洗液NE水平，因此僅檢測ECC后2 h支氣管肺泡灌洗液NE水平。MH組大鼠支氣管肺泡灌洗液NE水平為(6.7±4.6)ng/ml，明顯低于TMH組大鼠的(11.1±3.4)ng/ml(t=-2.176，P=0.047)，但與MP組大鼠的(11.0±4.7)ng/ml比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=-0.049，P=0.962)。表明體外循環(huán)中補充血小板同時抑制血小板正常的黏附聚集功能將使血小板失去保護(hù)作用。

GroupsECCatthebeginningAttheendofECCAt2hafterECCTMHgroup(n=8)391.4±31.4347.2±68.6306.8±34.11)MHgroup(n=8)380.5±35.0351.4±87.6326.7±39.91)MPgroup(n=8)403.0±39.9370.3±62.3308.1±27.61)

Note：Compare with ECC at the beginning,1)P<0.05.

GroupsECCatthebeginningAttheendofECCAt2hafterECCTMHgroup(n=8)1.2±0.88.1±4.51)9.4±2.21)2)MHgroup(n=8)1.3±0.68.5±3.21)10.6±3.41)MPgroup(n=8)1.4±0.810.8±4.31)14.9±5.51)

Note：Compared with ECC at the beginning,1)P<0.05;compared with MP group,2)P<0.05.

2.63組大鼠不同時點血漿中NE水平的比較 ECC開始時、結(jié)束時3組大鼠血漿中NE水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。隨著時間推移，3組大鼠血漿中NE水平均明顯增高，與各組ECC開始時相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，ECC結(jié)束后2 h，TMH組明顯低于MP組大鼠(P<0.05)。見表3。

圖1 TMH、MH、MP組大鼠ECC結(jié)束時循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量的比較Fig.1 Comparison of number of circulating endothelial cells in rats at end of ECC in TMH,MH and MP groupNote: The cell in gate P4 of Q2 district was double positive circulating endothelial cells of PE-CD146+ and FITC-KDR+,and the gate P4 was to prevent the PE-CD146+ or FITC-KDR+ strong positive cells entering the Q2 district due to the compensation setting.

圖2 TMH、MH、MP組大鼠ECC后2 h肺組織HE染色病理學(xué)比較(×400)Fig.2 Comparison of HE staining pathology in lung tissue in rats at 2 h after ECC in TMH,MH and MP group(×400)Note: The inflammatory cell adhesion is seen on the walls of the pulmonary vessels as shown in the arrow.A.TMH group；B.MH group；C.MP group.

2.73組大鼠ECC結(jié)束時循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量的比較 考慮ECC開始前血液丟失過多，ECC開始時未檢測循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量，僅檢測停ECC時循環(huán)內(nèi)皮數(shù)量。TMH、MH、MP組大鼠ECC結(jié)束時循環(huán)內(nèi)皮數(shù)量分別為(889.1±366.3)個/ml、(968.3±654.5)個/ml、(1 107.6±691.3)個/ml，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。表明相對于抑制血小板功能，ECC中輸注正常功能的血小板并不會增加血管內(nèi)皮的損傷，見圖1。

2.83組大鼠ECC后2 h肺組織病理學(xué)的比較 MH組、TMH組與MP組大鼠肺組織HE染色病理切片提示MP組大鼠肺泡壁明顯增厚，MH組與TMH組肺泡壁厚薄程度比較接近，但TMH組大鼠肺內(nèi)血管壁上可及炎性細(xì)胞黏附，箭頭所示，見圖2。

3 討論

ECC可引起全身炎性反應(yīng)，激活血管內(nèi)皮細(xì)胞，造成血管內(nèi)皮細(xì)胞攣縮變形，細(xì)胞間隙增大，甚至血管內(nèi)皮細(xì)胞脫落，導(dǎo)致毛細(xì)血管滲透性大大增加，內(nèi)皮下膠原組織暴露進(jìn)一步促進(jìn)中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞黏附浸潤，炎性因子釋放造成組織損傷，組織水腫加劇，有證據(jù)表明ECC相關(guān)炎性反應(yīng)導(dǎo)致毛細(xì)血管滲漏是ECC術(shù)后肺功能障礙的主要原因[10]。但ECC中血小板與非生理性管路接觸而大量激活、黏附，數(shù)量明顯降低，有文獻(xiàn)報道ECC開始后5 min即可降低至正常數(shù)量的20%以下，且ECC中血小板功能受損嚴(yán)重，其修復(fù)血管內(nèi)皮的作用大大降低，阻礙血小板對ECC時損傷的血管內(nèi)皮的修復(fù)，加劇ECC相關(guān)器官損傷的嚴(yán)重程度[11]。

根據(jù)以上證據(jù)，如果在ECC當(dāng)中增加新鮮血小板可能會增加血小板修復(fù)血管內(nèi)皮的作用。考慮同種異體大鼠之間首次輸血無血型排斥反應(yīng)，因此本課題中在不同時間點輸注同種異體大鼠新鮮血小板，以探討不同時間增加血小板數(shù)量對大鼠炎性反應(yīng)水平以及肺氧合功能的影響。體外循環(huán)開始后15 min，經(jīng)紅細(xì)胞壓積校正的血小板數(shù)量迅速減少至ECC開始時的(60.4±2.4)%，表明血液成分與體外循環(huán)異物管道接觸將導(dǎo)致超過2/3的血小板丟失，在ECC中補充血小板后5 min循環(huán)中血小板數(shù)量明顯增加，與體外循環(huán)開始時血小板數(shù)量無統(tǒng)計學(xué)差異，表明在本課題中應(yīng)用濃縮血小板制劑可明顯增加循環(huán)中血小板數(shù)量。

本實驗中發(fā)現(xiàn)ECC中輸注新鮮血小板，雖然于轉(zhuǎn)流后2 h暫未體現(xiàn)出明顯肺氧合功能保護(hù)作用，但能明顯改善循環(huán)中炎性反應(yīng)水平。我們發(fā)現(xiàn)體外轉(zhuǎn)流開始后15 min補充血小板的大鼠轉(zhuǎn)流后循環(huán)中的NE水平明顯低于輸注血漿組。NE主要由中心粒細(xì)胞分泌，屬絲氨酸蛋白酶家族，在生理狀態(tài)下，參與機體防御系統(tǒng)殺滅致病菌，防止感染。但在病理狀態(tài)下，比如ECC，NE被大量分泌，破壞細(xì)胞間的緊密連接和基底膜的完整性，使肺血管通透性增加，導(dǎo)致肺水腫，并能進(jìn)一步造成肺組織炎性損傷，有證據(jù)證明NE的活化程度與肺組織損傷密切相關(guān)[12]。表明轉(zhuǎn)流中補充新鮮血小板可明顯減少循環(huán)中炎性細(xì)胞的激活，大鼠肺組織病理切片也提示轉(zhuǎn)流中補充血小板可明顯減少肺組織水腫以及中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞在肺組織中滯留。

體外循環(huán)中應(yīng)用抗血小板藥物的效果尚有爭論，有學(xué)者認(rèn)為ECC前24 h內(nèi)應(yīng)用抗血小板藥物能明顯增加術(shù)后出血的風(fēng)險，并且是術(shù)后輸血的獨立危險因素[13]，但也有文章提出ECC前應(yīng)用抗血小板藥物可減少術(shù)后出血，但通過檢測支氣管肺泡灌洗液中髓過氧化物酶的活化程度(中性粒細(xì)胞脫顆粒活化的標(biāo)志性產(chǎn)物)，發(fā)現(xiàn)與對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，且不能改善肺氧合功能[14]。池昊育等[15]認(rèn)為體外循環(huán)前運用替羅非班抑制血小板黏附，能保護(hù)血小板功能，并能減少血小板丟失，最終能減輕血小板相關(guān)的炎性反應(yīng)。但其研究方法是用正常人血注入封閉的體外循環(huán)管道中，屬于離體實驗，在其實驗中中性粒細(xì)胞被逐漸激活黏附，但實驗當(dāng)中并無中性粒細(xì)胞自骨髓當(dāng)中持續(xù)釋放入血，因此并不能真正反映體外循環(huán)中中性粒細(xì)胞數(shù)量不斷增加的實際情況。

本實驗ECC中全程應(yīng)用替羅非班以抑制血小板黏附聚集，可明顯減少血小板消耗，能明顯增加血液中血小板數(shù)量，在抑制血小板黏附聚集同時發(fā)現(xiàn)替羅非班能明顯抑制轉(zhuǎn)流術(shù)中補充血小板的所得到的保護(hù)效果，ECC中補充血小板同時應(yīng)用替羅非班可使大鼠支氣管肺泡灌洗液中NE的水平明顯高于僅補充血小板的大鼠，而與補充血漿的對照組則無明顯差別，表明轉(zhuǎn)流術(shù)中補充新鮮血小板的肺保護(hù)作用的機制可能是由于血小板黏附聚集于血管內(nèi)皮破損處對內(nèi)皮的修復(fù)。體外循環(huán)開始早期，由于血液成分與體外循環(huán)管道內(nèi)表面的接觸、肝素的使用導(dǎo)致血小板大量激活，黏附，使血小板大量消耗。同時，隨著體外循環(huán)時間的延長，全身炎性反應(yīng)逐漸增強，血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷逐漸明顯，而能立即參與修復(fù)血管內(nèi)皮的血小板數(shù)量過低，且隨體外循環(huán)時間延長血小板聚集的主要受體PGⅡb/Ⅲa功能逐漸受損，不能起到全面有效地修復(fù)作用，導(dǎo)致內(nèi)皮下膠原組織暴露，中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞黏附于激活的內(nèi)皮細(xì)胞與血管破損處并游走至血管外導(dǎo)致組織炎性反應(yīng)水平明顯增高，組織損傷[16]。如轉(zhuǎn)流中應(yīng)用PGⅡb/Ⅲa抑制劑，則使血小板聚集修復(fù)損傷血管內(nèi)皮的功能明顯減弱，不能起到覆蓋內(nèi)皮下組織，減少內(nèi)皮下組織的暴露，保護(hù)肺組織的作用。

在本試驗中，我們也發(fā)現(xiàn)應(yīng)用替羅非班阻斷血小板黏附聚集可使循環(huán)中NE的水平較血漿對照組明顯降低，與補充血小板組的大鼠相當(dāng)，表明應(yīng)用替羅非班雖然不能減輕肺組織中的炎性反應(yīng)，卻能減輕循環(huán)中中性粒細(xì)胞的激活，這可能與轉(zhuǎn)流開始早期替羅非班抑制血小板表達(dá)P-選擇素(P-選擇素能與中性粒細(xì)胞上的P選擇素糖蛋白受體-1結(jié)合，介導(dǎo)血小板與中性粒細(xì)胞黏附)，減少血小板激活，減少血小板源性促炎性因子的釋放，減少血小板與中性粒細(xì)胞之間的黏附，減少中性粒細(xì)胞的激活有關(guān)[17]。這提示如果能在體外循環(huán)早期抑制血小板功能，而在體外循環(huán)中期恢復(fù)血小板功能可能有更好的器官保護(hù)作用。

通過本部分實驗，ECC中抑制血小板的黏附聚集功能，能明確抵消體外循環(huán)術(shù)中補充新鮮血小板的肺保護(hù)作用，提示體外循環(huán)術(shù)中補充新鮮血小板減輕循環(huán)中、肺組織中炎性反應(yīng)可能與血小板的黏附聚集作用有關(guān)。初步揭示ECC中血小板所起到的器官保護(hù)作用，考慮血小板既在ECC時起到促炎性反應(yīng)的作用也起到器官保護(hù)的作用，因此需要進(jìn)一步的研究血小板參與肺保護(hù)的過程和具體的機制，以及探討更精確的應(yīng)用血小板的時機與血小板的最佳補充量，以期在促炎性反應(yīng)與器官保護(hù)之間取得最佳平衡。為減少ECC相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生，加強ECC器官保護(hù)，改善預(yù)后提供新的思路與治療策略，并提供實驗室證據(jù)。

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[收稿2017-06-16]

(編輯 張曉舟)

Effectofregulatingplateletfunctiononsystemicinflammatoryresponseandpulmonaryoxygenationfunctioninratsduringextracorporealcirculation

TAOKai-Yu,ANQi,DULei,CHENGHai-Feng,JIANGDa-Ming,HUZhang-Long.

DepartmentofCardiovascularSurgery,theSecondAffiliatedHospitalofZhejiangUniversitySchoolofMedicine,Hangzhou310009，China

Objective:To investigate the effect of regulating platelet function on systemic inflammatory response and pulmonary oxygenation function in rats during extracorporeal circulation (ECC).MethodsThe rats participating in the ECC model were randomly divided into ECC supplemented platelet group (group MH),ECC supplemented plasma group (group MP),and continuous pump Tirofiban+ECC supplemented platelet group (group TMH),with 8 rats in each group.Rats of the three groups lasted two hours with ECC,observed for two hours after operation.Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) was used to detect inflammatory factors in the plasma and bronchoalveolar lavage fluid of rats in the three groups.The oxygenation index and lung tissue water content were measured.The number of circulating endothelial quantity was measured by flow cytometry,and pathological changes of lung tissue in rats were observed by hematoxylin eosin staining.The effects of regulating platelet function on the levels of systemic inflammatory response,the degree of vascular endothelial damage,the edema degree of lung tissue and pulmonary oxygenation function of ECC rats were analyzed.ResultsThere was no significant difference in platelet count between group MH and group MP after two hours with ECC (P>0.05),the group TMH was significantly higher than that in group MH and group MP (P<0.05).After two hours with ECC,the oxygenation indexes of the three groups were lower than that at the beginning of ECC (P<0.05).There was no significant difference in lung tissue water content between the three groups (P>0.05)；the level of neutrophil elastase (NE) in bronchoalveolar lavage fluid of rats in group MH was lower than that in group TMH(P<0.05),the level of NE in plasma of group TMH was lower than that in group MP (P<0.05).At the end of ECC,there were no statistically significant differences in circulating endothelial quantity of the three groups (P>0.05).Pathological examination of lung tissue showed that the lung interstitium of group MH was thinner than that of other groups,and inflammatory cell infiltration was less.ConclusionAt the early stage of ECC,supplement fresh platelets after platelet sharp decrease can significantly reduce the inflammatory response in the circulation.The protective effect may be related to platelets adhere to the endothelium associated with ECC related inflammatory reactions,and decrease the neutrophils and endothelial tissue adhesion.It is suggested that certain number of platelets with normal adhesion and aggregation function in ECC may reduce inflammatory response and lung injury after operative,and improve prognosis.

Extracorporeal circulation;Platelets;Inflammatory reaction;Pulmonary oxygenation function

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.11.008

①本文為浙江省自然科學(xué)基金青年基金項目(No.LQ13H020002)。

②四川大學(xué)華西醫(yī)院心臟大血管外科，成都 610041。

③四川大學(xué)華西醫(yī)院麻醉科，成都 610041。

R392

A

1000-484X(2017)11-1636-06

陶開宇(1981年-)，男，博士，主治醫(yī)師，主要從事心臟外科方面的研究。

及指導(dǎo)教師：程海峰(1969年-)，男，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事心臟外科方面的研究。