張 偉 堯 斌 程慧明 孟凡磊

(江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，南昌 330006)

地塞米松對哮喘大鼠T-bet/GATA-3的影響①

張 偉 堯 斌②程慧明②孟凡磊②

(江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，南昌 330006)

目的探討地塞米松對轉(zhuǎn)錄因子T-bet/GATA-3的影響。方法將30只SD大鼠隨機分為正常組、模型組與地塞米松組，每組10只。于第1、8天腹腔注射卵白蛋白，第15天霧化吸入卵白蛋白引喘，每日一次，共14次。地塞米松組于實驗開始后第15天起，按0.5 mg/kg予以腹腔注射地塞米松，每日一次，共14次。流式細胞術(shù)測脾及外周血Th1、Th2含量，免疫組化法及免疫印跡法測T-bet、GATA-3蛋白表達，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)測T-bet、GATA-3mRNA的表達。結(jié)果模型組與正常組比較，脾與外周血中Th1、Th2含量有非常顯著性增多(P<0.01)；肺組織中T-bet、GATA-3蛋白與mRNA的表達亦有非常顯著性升高(P<0.01)。而地塞米松組與模型組比較，T-bet/GATA-3有顯著(P<0.05)或非常顯著(P<0.01)性升高。結(jié)論T-bet/GATA-3是影響Th1/Th2平衡的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，地塞米松可提高T-bet/GATA-3比值，從而減輕哮喘的發(fā)作。

T-bet/GATA-3；Th1/Th2；IFN-γ/IL-4

關(guān)于哮喘的致病機理，Th2占優(yōu)勢的Th1/Th2 失衡被認為是哮喘發(fā)病的一個重要的免疫學(xué)機制。Th1和Th2是由同一輔助性T細胞前體細胞群(Th0)分化而來，Th2產(chǎn)生IL-4，IL-4是導(dǎo)致哮喘嗜酸性氣道炎癥的最主要因素[1，2]；IFN-γ主要由Th1細胞分泌，在許多方面與IL-4具有對抗作用，對Th2細胞起免疫下調(diào)作用[3]。此外，轉(zhuǎn)錄因子T-bet和GATA-3是Th0向Th1/Th2轉(zhuǎn)化的重要轉(zhuǎn)錄因子，它們在Th細胞分化調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，它們主要通過JAK-STATs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進行轉(zhuǎn)化[4-6]。本研究旨在驗證以下假說：幼稚的CD4+T細胞在GATA-3轉(zhuǎn)錄因子的作用下通過JAK-STAT通路向Th2轉(zhuǎn)化，并分泌炎性因子IL-4，IL-4促進IgE的合成，嗜酸細胞的募集、活化，介導(dǎo)氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性的發(fā)生，引發(fā)嗜酸粒細胞性哮喘；幼稚的CD4+T細胞在T-bet轉(zhuǎn)錄因子的作用下通過JAK-STAT通路向Th1轉(zhuǎn)化，并分泌細胞因子IFN-γ，IFN-γ在許多方面與IL-4具有對抗作用，維持Th1/Th2的平衡。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動物與分組 SPF級SD雄性大鼠30只，體重180～200 g，由蘇州工業(yè)園區(qū)愛爾麥特科技有限公司提供(合格證編號：NO.201508901)，按隨機數(shù)字表法將動物分為正常組、模型組、地塞米松組。每組10只。

1.1.2主要試劑和儀器 10%卵白蛋白(Sigma公司生產(chǎn))，氫氧化鋁[AL(OH)3]溶液(廣州化學(xué)試劑廠)， FITC conjugated anti-CD4(eBioscience)，PerCP-Cy5-conjugatedanti-IFN-γ(eBioscience)，APC-conjugated anti-IL-4(eBioscience)，T-bet、GATA-3一抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，β-actin 抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，PCR引物(上海生工)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(全式金生物技術(shù)有限公司)，Real time PCR mastermix(全式金生物技術(shù)有限公司)，Trizol(Invitrogen公司)。超聲霧化器(型號：402AI上海魚躍醫(yī)療設(shè)備有限公司)，Real time PCR儀(型號：ABI7500，Applied biosystems)，SDS-PAGE電泳儀(型號：PowerPac，Bio-Rad公司)，轉(zhuǎn)膜儀(型號：Trans-Blot Turbo，Bio-Rad公司)，流式細胞儀(CytoFLEX， Beckman Coulter有限公司)，光學(xué)顯微鏡(型號：IX73，OLYMPUS公司)。

1.2方法

1.2.1造模方法[7]除正常對照組外其余各組于實驗第1天和第8天腹腔注射10%卵白蛋白(OVA)和Al(OH)3溶液0.2 ml，2次致敏，于實驗第15天起開始霧化吸入1%OVA溶液20 min誘喘，霧化流量3 ml/min，以大鼠出現(xiàn)煩躁、嗆咳、打噴嚏、呼吸頻率加快，幅度加大、腹式呼吸明顯和點頭運動，嚴(yán)重者呼吸減慢或節(jié)律不整，四肢癱軟，行動遲滯或俯伏不動，反應(yīng)遲鈍等癥狀為激發(fā)成功。每天1次，連續(xù)2周。正常對照組用注射用水代替卵清白蛋白液進行注射和霧化吸入。

1.2.2地塞米松干預(yù)方法 于實驗開始后第15天起，按0.5 mg/kg予以腹腔注射，每日一次，共14次， 每次注射于OVA霧化吸入前0.5 h結(jié)束。

1.2.3樣品采集及指標(biāo)檢測

1.2.3.1流式細胞術(shù)測外周血及脾臟中Th17的水平 各組大鼠于第28天霧化吸入結(jié)束后2 h內(nèi)取材。3.5%水合氯醛(1 ml/100 g)行腹腔麻醉，剪開大腿內(nèi)側(cè)肌肉暴露股動脈，先用預(yù)先吸有肝素鈉1 ml 的注射器經(jīng)股動脈取血2 ml，作為流式細胞學(xué)檢測備用，股動脈放血處死大鼠。打開胸腔與腹腔，取脾臟，外周血與脾臟均于-80℃保存。

制備脾(外周血)淋巴細胞懸液，加入1×cell stimulation cocktail刺激淋巴細胞增殖，加入CD4+FITC、IL-4、IFN-γ熒光單克隆抗體，運用流式細胞儀檢測IL-4所代表的Th2的含量、IFN-γ代表的Th1的含量。采用Flowjo分析軟件。

1.2.3.2免疫組織化學(xué)法測定大鼠肺組織中GATA3、T-bet蛋白表達。取右肺中葉，石蠟包埋，脫蠟，水化，封片，一抗孵育，顯色，復(fù)染與封片。每個樣本隨機抽取3張免疫組化切片，每張切片在顯微鏡下(×400)隨機選取5個互不重疊視野，測定單位面積陽性細胞表達的平均光密度值。采用Image-Pro Plus分析軟件進行分析。

1.2.3.3免疫印跡法(Western blot)檢測肺組織中GATA3、T-bet蛋白含量。取右肺下葉組織，肺組織在RIPA蛋白裂解液中裂解，提取蛋白樣品，SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，一抗、二抗孵育，化學(xué)發(fā)光劑檢測轉(zhuǎn)印膜上靶蛋白信號。采用Image-Pro Plus分析軟件進行分析。

1.2.3.4逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)檢測肺組織中GATA3、T-betmRNA的表達。取右肺下葉組織，TRIzol法抽提總RNA,逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，PCR擴增，電泳。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠脾臟及外周血中Th2、Th1的含量 模型組Th2百分比非常顯著高于正常對照組(P<0.01)；而地塞米松組在脾臟、外周血中的含量與正常組無顯著差異(P>0.05)，而地塞米松組Th2含量與模型組比較則有顯著或非常顯著性降低(P<0.05或P<0.01)，說明嗜酸粒細胞性哮喘大鼠幼稚的CD4+顯著向Th2分化，而地塞米松可顯著抑制Th0向Th2的分化。見圖1。

模型組Th1百分比非常顯著高于正常對照組(P<0.01)；而地塞米松組在脾臟、外周血中的含量與正常組比較顯著或非常顯著性升高(P<0.05或P<0.01)，而地塞米松組Th1含量與模型組比較則有非常顯著性降低(P<0.01)，說明嗜酸粒細胞性哮喘大鼠Th1細胞顯著增多，而地塞米松可顯著抑制Th0向Th1的分化。見圖2。

2.2各組大鼠肺組織中GATA3、T-bet蛋白的含量 免疫組化法測得各組大鼠肺組織中GATA3、T-bet平均光密度值，模型組與地塞米松組皆顯著高于正常對照組(P<0.01)，而地塞米松組與模型組比較，GATA3蛋白含量非常顯著性降低(P<0.01)，而T-bet蛋白含量有顯著性降低(P<0.05)。說明GATA3、T-bet參與了嗜酸粒細胞性哮喘的發(fā)作，而地塞米松可以抑制GATA3、T-bet蛋白的水平，提高T-bet/GATA3比值，從而減輕嗜酸粒細胞性哮喘的程度(圖3)。

圖2 各組大鼠外周血Th2、Th1的含量Fig.2 Percentage of Th2,Th1 in peripheral blood of every groupNote: ▲.P<0.01,vs normal group;△.P>0.05,vs normal group;*.P<0.05,vs model group;**.P<0.01,vs model group.A1 and A2.Normal group;B1 and B2.Model group;C1 and C2.DEX group.

圖3各組大鼠肺組織GATA3、T-bet蛋白的平均光密度值

Fig.3DensityofproteinGATA3,T-betinlungtissueofeverygroup

Note: ▲▲.P<0.01,vs normal group;**.P<0.01,vs model group;*.P<0.05,vs model group;A1.Normal group(GATA3);B1.Model group(GATA3);C1.DEX group(GATA3);A2.Normal group(T-bet);B2.Model group(T-bet);C2.DEX group(T-bet).

圖4 各組大鼠肺組織中GATA3、T-bet蛋白表達的比較Fig.4 Expression of protein GATA3,T-bet in lung tissue of every groupNote: ▲▲.P<0.01,vs normal group;**.P<0.01,vs model group.

表1目的基因的引物序列

Tab.1Primersequenceoftargetgene

PrimernamePrimersequenceAugmentationlength(bp)GATAFGGCGGCGAGATGGTACTG68RTCTGCCCATTCATTTTATGGTAGAT-betFTCCTGTCTCCAGCCGTTTCT121RCGCTCACTGCTCGGAACTCTβ-actinFTAAAGACCTCTATGCCAACACAGT220RCACGATGGAGGGGCCGGACTCATC

圖5 各組大鼠肺組織中GATA3、T-betmRNA的表達Fig.5 Expression of GATA3,T-betmRNA in lung tissue of every groupNote: ▲▲.P<0.01,vs normal group;*.P<0.05,vs model group;**.P<0.01,vs model group.

2.3肺組織中GATA3、T-bet蛋白的免疫印跡表達 Western blot法測得各組大鼠肺組織中GATA3、T-bet蛋白的免疫印跡表達水平，模型組與地塞米松組GATA3、T-bet蛋白表達皆顯著高于正常對照組(P<0.01)，而地塞米松組與模型組比較，GATA3、T-bet蛋白含量有非常顯著性降低(P<0.01)，地塞米松組T-bet/GATA3比值與模型組比較有非常顯著性升高(P<0.01)，見圖4。

2.4肺組織中GATA3、T-betmRNA的表達 RT-PCR法測得各組大鼠肺組織中GATA3、T-betmRNA的表達水平，與正常對照組比較，模型組與地塞米松GATA3、T-betmRNA表達量皆非常顯著性增高(P<0.01)；而與模型組比較，地塞米松組GATA3mRNA表達有非常顯著性降低(P<0.01)，T-betmRNA表達量有顯著性降低(P<0.05)，T-bet/GATA3有顯著性升高(P<0.05)，見表1、圖5。

3 討論

近年，越來越多的事實表明支氣管哮喘最重要的免疫異常是Th1/Th2比例和功能的失衡。Th1和Th2是由Th0前體細胞群分化而來。Th2細胞產(chǎn)生IL-4，是導(dǎo)致哮喘嗜酸性氣道炎癥的最主要因素[8，9]，它能使免疫球蛋白 E(IgE)產(chǎn)生增加、誘導(dǎo)肥大細胞分化，并對嗜酸性粒的細胞生長、趨化和激活均有影響，并且它在促進Th0向Th2的分化過程起到最關(guān)鍵的作用；IFN-γ主要由Th1細胞分泌，在許多方面與IL-4具有對抗作用，對Th2細胞起免疫下調(diào)作用[10，11]。IFN-γ可抑制IL-4 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，并抑制IL-4誘導(dǎo)的B淋巴細胞表達IgE Fν低親和力受體(FceRⅡ)和分泌可溶性 FceRⅡ，從而抑制體內(nèi)IgE的合成[12]。

近年來的研究表明，Th1/Th2細胞在數(shù)量、活化及功能方面的比例失衡，是支氣管哮喘發(fā)病機制中的重要環(huán)節(jié)。Th0細胞越來越多向Th2亞群分化[13]，Th2優(yōu)勢分化及Th2型炎性細胞因子通過促進IgE的合成，嗜酸細胞在氣道內(nèi)募集、活化并釋放細胞因子等，介導(dǎo)氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性的發(fā)生[14]。相反,哮喘患者體內(nèi)Th1功能降低，IFN-γ生成低下，對IL-4及IgE的生成調(diào)節(jié)作用減弱，使IgE生成增加[15]。

此外，GATA-3和T-bet是重要轉(zhuǎn)錄因子，在Th細胞分化調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，主要通過JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑進行。GATA-3僅在Th2中表達[16-18]，一旦Th0在Th2分化環(huán)境中誘導(dǎo)，GATA-3基因即可在STAT6非依賴信號轉(zhuǎn)導(dǎo)下促使正在分化或已分化的Th合成Th2細胞因子。

T-bet與IFN-γ表達密切相關(guān)[19-21]，IFN-γ與受體結(jié)合后，經(jīng)由JAK/STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活T-bet基因，促使細胞向Th1方向分化；而T-bet對IFN-γ的基因具有反式激活作用，使IFN-γ的等位基因位點從常染色質(zhì)移入異染色質(zhì)，因此，T-bet很可能通過直接調(diào)控IFN-γ基因轉(zhuǎn)錄而觸發(fā)Th1分化的基因程序。

所以，T-bet/GATA3的水平異常直接影響IFN-γ/IL-4的比值，從而影響Th1/Th2分化平衡，而Th細胞的分化平衡與哮喘的發(fā)生密切相關(guān)。

本實驗研究顯示，哮喘大鼠的氣道內(nèi)大量炎性細胞浸潤，主要以嗜酸粒細胞為主，而地塞米松可非常顯著減少嗜酸粒細胞的數(shù)量，從而減輕哮喘的發(fā)作。IL-4在模型組BALF中大量存在，提示IL-4為Th2介導(dǎo)的嗜酸粒細胞性哮喘的主要炎性因子；而地塞米松治療組IFN-γ/IL-4較模型組有較大幅度升高，說明IFN-γ/IL-4可提高Th1/Th2，從而降低哮喘的發(fā)作。經(jīng)流式細胞技術(shù)測定，在脾臟與外周血中可檢測到Th2、Th1的存在，模型組Th2、Th1的含量顯著高于正常組與地塞米松組，說明嗜酸粒細胞性哮喘大鼠以Th2、Th1的存在為主；在肺組織中，通過免疫組化法及免疫印跡法測得GATA-3和T-bet蛋白的表達，RT-PCR法測得GATA-3和T-betmRNA的表達，GATA-3和T-bet在嗜酸粒細胞哮喘模型中皆有高表達，而地塞米松可顯著降低GATA-3和T-bet的含量，而地塞米松組T-bet/GATA-3與模型組比較有顯著的提高，說明GATA-3參與了Th2細胞的分化過程，并且是促進Th0向Th2分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，而T-bet參與了Th1細胞的分化過程，并且是促進Th0向Th1分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，地塞米松的治療可促使T-bet/GATA-3的提高，從而促進Th1/Th2的升高，從而減輕哮喘的發(fā)作。

綜上所述，Th1/Th2失衡，Th2高表達是哮喘產(chǎn)生的原因。GATA-3是促進Th0向Th2分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，Th2產(chǎn)生大量的IL-4，而IL-4具有強大的募集嗜酸粒細胞的作用，從而使氣道內(nèi)產(chǎn)生大量的炎性因子，并引發(fā)哮喘的發(fā)生；T-bet可促進Th0向Th1分化，并產(chǎn)生大量IFN-γ，從而對抗IL-4的炎性反應(yīng)，降低哮喘的發(fā)作。因此，提高T-bet/GATA-3的含量，可進一步提高IFN-γ/IL-4，從而提高Th1/Th2，進而抑制哮喘的發(fā)作。

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[收稿2016-11-07 修回2017-03-07]

(編輯 張曉舟)

InfluenceofT-bet/GATA-3toTh1/Th2ofathmarats

ZHANGWei,YAOBin,CHENGHui-Ming,MENGFan-Lei.

TheAffiliatedHospitalofJiangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine，Nanchang330006,China

Objective:To discuss the influence of dexamethasone(DXM) to T-bet/GATA-3 of athma rats.Methods30 SD rats were randomly divided into normal group,model group and DXM group，10 rats in each group.Ovalbumin was intraperitoneal injected on the 1th and 8th day and aerosol inhaled from the 15th day,once a day,14 days altogether.Dexamethasone was intraperitoneal injected in 0.5 mg/kg from the 15th day,once per day,a total of 14 times.Flow cytometry tested the content of Th1 and Th2 in spleen and peripheral blood,immunohistochemistry and Western blot measured T-bet and GATA-3 protein expression and RT-PCR tested T-bet and GATA-3 mRNA expression.ResultsCompared model group with normal group,the contents of Th1，Th2 in spleen and peripheral blood had a very significant increase(P<0.01);expression of T-bet,GATA-3 protein and mRNA in the lung tissue also had very significant risen(P<0.01).While compared DXM group with model group,T-bet/GATA-3 rose significantly(P<0.05)or very significantly(P<0.01).ConclusionT-bet/GATA-3 is the key transcription factors that influence the balance of Th1/Th2,while DXM can raise the ratio of T-bet/GATA-3,which reduce the severity of asthma.

T-bet/GATA-3；Th1/Th2；IFN-γ/IL-4

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.11.006

①本文為國家自然科學(xué)基金項目(81460743)。

②江西中醫(yī)藥大學(xué)，南昌 330006。

R562.2+5R392.12

A

1000-484X(2017)11-1626-05

張 偉(1978年-)，女，博士，副主任中醫(yī)師，主要從事腧穴的敏化規(guī)律研究,現(xiàn)供職于威海市中醫(yī)院，威海 264200，E-mail：1418771965@qq.com。