王英澤 王巧蘭 杜 朝 曹晴晴 付 育

(河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,石家莊 050018)

羧基化單壁碳納米管對(duì)小鼠CIK細(xì)胞表型及功能的影響研究①

王英澤 王巧蘭 杜 朝 曹晴晴 付 育

(河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,石家莊 050018)

目的探討羧基化單壁碳納米管(SWCNT-COOH)對(duì)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)而成的CIK細(xì)胞表型及功能的影響。方法以不同濃度的SWCNT-COOH處理CIK細(xì)胞，采用倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，MTS法測(cè)定殺傷效果，流式細(xì)胞術(shù)分析免疫表型。結(jié)果隨著效靶比的增加，CIK的殺傷效果逐漸增強(qiáng)且最適效靶比為20∶1。用0.5 μg/ml SWCNT-COOH處理CIK細(xì)胞，CD3+CD4+、CD3+CD8+比例最高且均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，同時(shí)CIK殺傷小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16、小鼠肝癌細(xì)胞H22和小鼠前列腺癌細(xì)胞RM-1的效果最佳。結(jié)論SWCNT-COOH可以顯著增強(qiáng)CIK細(xì)胞的體外殺傷活性，具有潛在的腫瘤藥物開發(fā)價(jià)值。

SWCNT-COOH；CIK細(xì)胞；腫瘤免疫；免疫表型

細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(Cytokine-induced killer cell,CIK)具有殺瘤作用強(qiáng)、增殖活性高、殺傷范圍廣、提高免疫力、刺激骨髓造血、毒副作用小等免疫特性，因此CIK細(xì)胞被認(rèn)為是新一代腫瘤過繼性免疫治療的首選方案[1-4]。但單獨(dú)的CIK細(xì)胞治療效果不明顯、存在體外擴(kuò)增困難和可能潛在致癌性等缺陷，那么如何解除腫瘤患者體內(nèi)的免疫抑制狀態(tài)，使CIK細(xì)胞免疫治療在體內(nèi)更好地發(fā)揮抗腫瘤的療效，有待于進(jìn)一步研究探索[5-8]。

納米碳管獨(dú)特的尺寸及形狀效應(yīng)賦予了其廣泛的應(yīng)用范圍。近年來，SWCNT-COOH所引起的機(jī)體免疫效應(yīng)和機(jī)制的研究逐漸引起學(xué)者的關(guān)注[9-12]。Dong等[13]在探討碳納米管誘導(dǎo)的肺纖維化病理發(fā)展的調(diào)控機(jī)制的研究中發(fā)現(xiàn)，碳納米管能有效激活CD4+T細(xì)胞群體中的Th2型細(xì)胞，促進(jìn)Th2型細(xì)胞因子(IL-4和IL-13)的釋放。Xue等[14]研究顯示SWCNT可能通過在紋狀體中的氧化反應(yīng)增強(qiáng)細(xì)胞外多巴胺來治療甲基苯丙胺成癮的作用。Pulskamp等[15]對(duì)碳納米管是否誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生炎癥應(yīng)答進(jìn)行了相關(guān)研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明碳納米管在體外能誘導(dǎo)炎癥因子的釋放。而SWCNT-COOH對(duì)CIK細(xì)胞表型和功能影響方面的研究卻鮮有報(bào)道。因此，本研究利用SWCNT-COOH探討其對(duì)CIK細(xì)胞功能的影響，以期能為提高CIK細(xì)胞的殺傷效果提供一種新的思路，為腫瘤的臨床免疫治療提供有價(jià)值的參考。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料、試劑 SWCNT由中國(guó)科學(xué)院納米中心提供；B16、H22和RM-1細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室凍存；昆明鼠從河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物所購(gòu)買；RPMI Medium 1640 basic(1×)(Gibco)；青鏈霉素混合液(北京索萊寶科技有限公司)；TRYPSIN/EDTA(Wisent)；胎牛血清(HyClone)；Mouse Lymphocyte Separation Medium(深圳市達(dá)科為生物工程有限公司)；IFN-γ、CD3、IL-2(Miltenyi Biotec)；PHA(Sigma)；Anti-Mouse CD3e FITC、Anti-Mouse CD4 PE、Anti-Mouse CD8a(B7-1)PE-Cyanine5、Anti-Mouse CD4 FITC、Anti-Mouse CD25 PE、Anti-Mouse CD127 APC(eBioscience)；CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Prolifera(Promega)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1SWCNT的羧基化程序[16-18]0.1 g SWCNT和100 ml混酸(體積之比98% H2SO4:68% HNO3=3∶1)37℃超聲2 h，將得到的黑色懸浮液加水稀釋至250 ml，通過布氏漏斗用0.22 μmol/L濾膜過濾，反復(fù)沖洗至pH≥4.5，室溫干燥備用。

稱取1 g SWCNT在加入0.5 wt%膽酸鈉表面活性劑的10 ml磷酸緩沖液(20 mmol/L，pH7.0)中溶解，超聲2 h。300 g離心15 min并去除聚集度高的碳管，最終得到分散性較好的SWCNT-COOH分散液。紫外定量測(cè)定濃度，備用。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠腫瘤細(xì)胞系的培養(yǎng)：B16、H22和RM-1使用含10%FBS的1640培養(yǎng)基，在5% CO2、37℃條件下培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

脾臟淋巴細(xì)胞的分離與誘導(dǎo)：取體重20 g左右的昆明鼠，斷頸處死，取脾臟，按照小鼠淋巴細(xì)胞分離液的廠家說明書的方法，制備脾臟淋巴細(xì)胞。將細(xì)胞密度調(diào)整為5×106個(gè)/ml，同時(shí)加入IFN-γ(50 ng/ml)，24 h后加入CD3、IL-2和PHA(工作濃度分別為100 ng/ml、30 ng/ml和10 μg/ml)，以后隔天補(bǔ)加等體積新鮮培養(yǎng)基，并添加IL-2(工作濃度30 ng/ml)，以獲得CIK細(xì)胞。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)分析免疫表型 六孔板每孔接種體外培養(yǎng)至第5天的CIK細(xì)胞5×106個(gè)，用不同濃度的SWCNT-COOH處理24 h。收獲細(xì)胞后，用PBS漂洗，再以相應(yīng)抗體避光孵育30 min，上機(jī)檢測(cè)。

1.2.4MTS法測(cè)定殺傷效果 效靶比優(yōu)化：96孔板每孔接種B16細(xì)胞5×103個(gè)，4 h后按個(gè)數(shù)比5∶1、10∶1、20∶1、40∶1和50∶1接種CIK與B16細(xì)胞，24和48 h測(cè)定殺傷效果。

細(xì)胞毒性檢測(cè)：96孔板每孔接種小鼠腫瘤細(xì)胞5×103個(gè)，每組設(shè)定3個(gè)復(fù)孔。4 h后按最適效靶比20∶1加入經(jīng)SWCNT-COOH處理24 h后的CIK細(xì)胞，并以單獨(dú)的CIK和小鼠腫瘤細(xì)胞作為對(duì)照，24 h和48 h測(cè)定殺傷效果。細(xì)胞存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)組A493值-實(shí)驗(yàn)空白組A493值)/(對(duì)照組A493值-對(duì)照空白組A493值)×100%。

2 結(jié)果

2.1CIK細(xì)胞誘導(dǎo)效果的檢測(cè) CIK細(xì)胞大部分呈圓形，少數(shù)細(xì)胞表面有突起，生長(zhǎng)主要以團(tuán)簇狀增殖[19，20]。在細(xì)胞因子的作用下，脾臟淋巴細(xì)胞已被誘導(dǎo)成為CIK細(xì)胞(圖1)。CD3是可以鑒定CIK細(xì)胞成熟度的標(biāo)志物，因?yàn)槠湓诳鼓[瘤療效中起重要作用。誘導(dǎo)培養(yǎng)5 d的CIK細(xì)胞處理組CD3+比例為96.0%，明顯高于新分離的脾臟淋巴細(xì)胞處理組，表明該體系已成功將小鼠脾臟淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)成為CIK細(xì)胞(圖2)。

2.2SWCNT-COOH對(duì)CD4+、CD8+T細(xì)胞和Treg細(xì)胞比例的影響 CIK細(xì)胞的主要效應(yīng)細(xì)胞為CD3+CD4+、CD3+CD8+表型的T 淋巴細(xì)胞和控制體內(nèi)自身免疫反應(yīng)性抑制腫瘤免疫應(yīng)答的T細(xì)胞(Treg，CD4+CD25+CD127-)亞群[21,22]。結(jié)果顯示，0.5 μg/ml SWCNT-COOH使CD4+T細(xì)胞比例(28.2%)顯著升高(P<0.05)；而更高濃度的碳納米管的加入，效果相反，產(chǎn)生了抑制作用(圖3)。CD8+T細(xì)胞比例變化與CD4+T細(xì)胞比例的變化趨勢(shì)一致。隨著SWCNT-COOH劑量的增加，Treg細(xì)胞比例呈逐漸降低的趨勢(shì)(圖4)。這說明SWCNT-COOH在低濃度下能夠消除Treg細(xì)胞對(duì)CD4+、CD8+型T細(xì)胞的抑制作用，從而使CIK細(xì)胞能更好地發(fā)揮其作用。

圖1 細(xì)胞因子誘導(dǎo)的脾臟淋巴細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)Fig.1 Growth status of splenic lymphocyte induced by cytokineNote: Eyepiece ×10;objective ×20.A.1 d;B.2 d;C.3 d;D.4 d;E.5 d.

圖2 細(xì)胞因子誘導(dǎo)的小鼠脾臟CD3+型T細(xì)胞的比例Fig.2 Ratio of CD3+ T cell in mouse splenic lymphocyte induced by cytokine

圖3 SWCNT-COOH對(duì)CIK細(xì)胞CD3+CD4+、CD3+CD8+表型的影響Fig.3 Effect of carboxylated single-walled carbon nanotubes on phenotype of CD3+ CD4+ and CD3+ CD8+ in CIK cellsNote: A.CD3+ CD4+ phenotype in CIK cells；B.CD3+ CD8+ phenotype in CIK cells；C.Summary of data as in Fig.A；D.Summary of data as in Fig.B.

2.3CIK殺傷B16細(xì)胞效靶比的優(yōu)化 如圖5所示，隨效靶比的增加，CIK對(duì)B16細(xì)胞的殺傷效果逐漸增強(qiáng)。值得注意的是，當(dāng)效靶比為20∶1時(shí)，CIK對(duì)B16細(xì)胞的殺傷效果分別達(dá)到40.8%、43.8%，顯著高于5∶1、10∶1時(shí)的殺傷效果(P<0.05)，但更高的效靶比并不能使殺傷效果進(jìn)一步顯著增強(qiáng)。在考慮細(xì)胞用量及密度的前提下，確定CIK殺傷B16細(xì)胞的最優(yōu)效靶比為20∶1。

2.4SWCNT-COOH對(duì)CIK細(xì)胞殺傷效果的影響 本實(shí)驗(yàn)用SWCNT-COOH處理培養(yǎng)至第5天的CIK細(xì)胞24 h，然后再去殺傷小鼠腫瘤細(xì)胞，此時(shí)的培養(yǎng)基中會(huì)存有濃度減半的SWCNT-COOH。因此，檢測(cè)SWCNT-COOH對(duì)小鼠腫瘤細(xì)胞的毒性影響，以確定碳納米管的安全用量。 結(jié)果表明， 隨著SWCNT-COOH濃度的增加，對(duì)3種小鼠腫瘤細(xì)胞活力的抑制作用逐漸增強(qiáng)，存在濃度依賴效應(yīng)(圖6)。在SWCNT-COOH的濃度為1.0 μg/ml時(shí)，細(xì)胞抑制率均小于25%，故在以下實(shí)驗(yàn)中以2.0 μg/ml濃度為最高作用劑量，觀察染毒細(xì)胞形態(tài)及其他各指標(biāo)的變化。

圖4 SWCNT-COOH對(duì)Treg細(xì)胞比例的影響Fig.4 Effect of carboxylated single-walled carbon nanotubes on ratio of Treg cellsNote: A.CD4+ phenotype in CIK cells；B.CD25+ CD127-phenotype in CIK cells；C.Summary of data as in Fig.A and Fig.B.The phenotype of Treg cells is CD4+CD25+CD127-.

圖6 SWCNT-COOH對(duì)小鼠腫瘤細(xì)胞的毒性測(cè)定Fig.6 Determination of toxicity of carboxylated single-walled carbon nanotubes to mouse tumor cellsNote: A.Inhibition of B16 cell(%)；B.Inhibition of H22 cell(%)；C.Inhibition of RM-1 cell(%).

圖5 CIK殺傷B16細(xì)胞效靶比的優(yōu)化Fig.5 Optimization for effect target ratio of CIK killing B16 cells

為證實(shí)CIK細(xì)胞對(duì)小鼠腫瘤細(xì)胞的殺傷效果，本實(shí)驗(yàn)采用了3種小鼠腫瘤細(xì)胞系(B16、H22和RM-1細(xì)胞)進(jìn)行驗(yàn)證。隨著SWCNT-COOH濃度的升高，CIK細(xì)胞對(duì)B16、H22和RM-1細(xì)胞的抑制率均呈先升高后下降的趨勢(shì)(圖7)。當(dāng)SWCNT-COOH的濃度為0.5 μg/ml時(shí)，CIK對(duì)3種小鼠腫瘤細(xì)胞的抑制率分別達(dá)到最大值，且顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，而當(dāng)SWCNT-COOH濃度提高到1 μg/ml和2 μg/ml時(shí)，CIK對(duì)3種腫瘤細(xì)胞的抑制率均出現(xiàn)下降趨勢(shì)。我們推測(cè)碳納米管在高濃度下，對(duì)CIK細(xì)胞產(chǎn)生一定的毒性作用，進(jìn)而影響了其對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效果。這與SWCNT-COOH影響CIK細(xì)胞表型CD4+、CD8+T細(xì)胞和Treg細(xì)胞比例變化的實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致，綜上，SWCNT-COOH能通過改變T淋巴細(xì)胞的表型比例來影響CIK細(xì)胞的殺傷效果，主要表現(xiàn)在提高CD4+、CD8+T細(xì)胞比例和降低Treg細(xì)胞比例方面。

圖7 SWCNT-COOH對(duì)CIK細(xì)胞殺傷效果的影響Fig.7 Effect of carboxylated single-walled carbon nanotubes on cytotoxicity of mouse tumor cellsNote: A.Inhibition of B16 cell(%);B.Inhibition of H22 cell(%);C.Inhibition of RM-1 cell(%).

3 討論

碳納米管在水溶液中難分散、易聚集，將其應(yīng)用于生物體系中使它們喪失了納米材料的許多優(yōu)勢(shì)，諸如尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)等，也給我們的實(shí)際應(yīng)用帶來很大困難。因此，對(duì)碳納米管的功能化修飾尤顯重要。通過化學(xué)修飾(表面添加官能團(tuán)，如羧基化、氨基化、氫化、氟化等)和非共價(jià)修飾(表面結(jié)合溶解劑，不改變化學(xué)結(jié)構(gòu))，可增強(qiáng)納米材料的親水性，使其更均勻穩(wěn)定地分散在介質(zhì)中[16,22]。本研究所采用的碳納米管均經(jīng)過羧基化修飾，分散性、生物相容性良好，能很好地應(yīng)用于我們的試驗(yàn)體系中。

近年來，癌癥免疫治療的發(fā)展備受關(guān)注[23，24]。研究表明，CIK細(xì)胞對(duì)多種癌細(xì)胞株系均具有殺傷效應(yīng)。更重要的是，CIK細(xì)胞能夠遷移至腫瘤組織處，識(shí)別異常脈管系統(tǒng)和腫瘤細(xì)胞，啟動(dòng)免疫反應(yīng)、殺傷腫瘤細(xì)胞[3]。雖然CIK 細(xì)胞的免疫療法取得了一定成效，但尋求提高CIK 細(xì)胞治療效果的有效方法依然是目前研究的熱點(diǎn)[1-8,25]。本研究結(jié)果表明，經(jīng)低濃度的SWCNT-COOH處理的CIK細(xì)胞，可以顯著提高CD3+CD4+、CD3+CD8+型T細(xì)胞的比例(P<0.05)，顯著降低Treg細(xì)胞比例(P<0.05)，能夠增強(qiáng)CIK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷力。利用納米顆粒的獨(dú)特性質(zhì)開發(fā)納米藥物、納米藥物載體等新型治療腫瘤的手段，極大拓展了納米材料的應(yīng)用領(lǐng)域，同時(shí)也為臨床治療惡性腫瘤提供了一種新的思路。

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[收稿2017-04-26 修回2017-06-30]

(編輯 張曉舟)

EffectsonphenotypeandfunctionofmouseCIKcellstreatedwithcarboxylatedsingle-walledcarbonnanotubes

WANGYing-Ze,WANGQiao-Lan,DUChao,CAOQing-Qing,FUYu.

CollegeofBiologicalScienceandEngineering,HebeiUniversityofScienceandTechnology,Shijiazhuang050018,China

Objective:To investigate the effect on the phenotype and function of CIK cells induced from splenic lymphocyte in mice treated with carboxylated single-walled carbon nanotubes.MethodsCIK cells were treated with carboxylated single-walled carbon nanotubes at different concentrations.Cell growth status was observed using inverted fluorescence microscopy.The killing effect was determined by MTS method.Immunophenotype was analyzed by flow cytometry.ResultsWith the increase of the effect target ratio,the killer rate of CIK was gradually enhanced and the optimal effect target ratio was 20∶1.With the increase of the dose of carboxylated single-walled carbon nanotubes,the proportion of Treg cells decreased.When CIK cells were treated with 0.5 μg/ml carboxylated single-walled carbon nanotubes(CNTs),the proportion of CD3+CD4+and CD3+CD8+was significantly higher than that of the control group(P<0.05),and the killing effects of CIK anchieved best results to B16 cells,H22 cells and RM-1cells.ConclusionThe carboxylated single-walled carbon nanotubes enhanced the ability of CIK cells to kill tumor cells,significantly which provide has potential value in tumor drug development.

Carboxylated single-walled carbon nanotubes;CIK cells;Tumor immunity;Immunophenotype

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.11.004

①本文受國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81171455)、國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(31100715、81402305)、河北省自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(C2013208005)、河北省高等學(xué)?？茖W(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(QN2014043)和河北科技大學(xué)五大平臺(tái)開放基金課題資助。

R730.51

A

1000-484X(2017)11-1616-06

王英澤(1977年-)，男，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事納米材料的免疫效應(yīng)研究，E-mail：yingze-wang@126.com。

及指導(dǎo)教師：杜 朝(1969年-)，男，博士，副教授，主要從事分子生物學(xué)相關(guān)研究，E-mail：duchao-pku@126.com。