鄒 勇， 林哲生， 陳玉嬋， 廖思紅， 袁 青， 林東軍, 2△

(中山大學附屬第三醫(yī)院 1輸血科， 2血液科， 廣東 廣州 510630)

過表達B7-H6在自然殺傷細胞介導的肝細胞凋亡中的作用*

鄒 勇1△， 林哲生1， 陳玉嬋1， 廖思紅1， 袁 青1， 林東軍1, 2△

(中山大學附屬第三醫(yī)院1輸血科，2血液科， 廣東 廣州 510630)

目的探討過表達B7同源物6(B7-H6)在自然殺傷(NK)細胞介導的肝細胞凋亡中的作用。方法設計針對B7-H6全長的寡核苷酸引物，經(jīng)PCR擴增調(diào)取B7-H6全長，并將其亞克隆入線性化的真核表達載體pIRES2-EGFP，構(gòu)建重組B7-H6過表達載體pIRES2-EGFP-B7-H6，通過雙酶切、PCR及測序進行鑒定。利用脂質(zhì)體將pIRES2-EGFP-B7-H6重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染正常肝細胞系L02，采用熒光顯微鏡觀察EGFP的表達，流式細胞技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染效率，qRT-PCR 和Western blot 檢測B7-H6 mRNA 和蛋白的表達水平。將轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-B7-H6重組質(zhì)粒的L02細胞與NK-92細胞以不同的效靶比共培養(yǎng)，利用CCK-8實驗分析檢測NK-92細胞對L02細胞的殺傷效應。結(jié)果經(jīng)PCR、酶切及測序等方法證實成功構(gòu)建pIRES2-EGFP-B7-H6過表達載體；經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染L02細胞48 h后，在熒光顯微鏡下觀察到較強綠色熒光表達，流式檢測顯示轉(zhuǎn)染效率達到92.6%；qRT-PCR和Western blot結(jié)果顯示L02細胞B7-H6的mRNA和蛋白高表達；CCK-8實驗證實相對于轉(zhuǎn)染空載體pIRES2-EGFP， NK-92細胞對轉(zhuǎn)染了pIRES2-EGFP-B7-H6的L02細胞的殺傷活性顯著增強(P<0.05)。結(jié)論成功構(gòu)建過表達B7-H6的真核表達載體pIRES2-EGFP-B7-H6，并進一步證實NK-92細胞對過表達B7-H6的L02細胞具有顯著的殺傷效應。

B7同源物6； 真核表達載體； 自然殺傷細胞； 肝細胞； 細胞凋亡

B7同源物6(B7 homologue 6, B7-H6)又稱自然殺傷細胞細胞毒性受體3配體1(natural killer cell cytotoxicity receptor 3 ligand 1，NCR3LG1)，屬于B7免疫球蛋白超家族，是近年來利用生物信息學和質(zhì)譜技術(shù)等發(fā)現(xiàn)的新型共刺激分子。已經(jīng)證實，B7-H6為人類自然殺傷(natural killer，NK)細胞的配體，可以與NK細胞表面細胞毒性受體NKp30特異性結(jié)合而激活并促進NK細胞釋放TNF-α和IFN-γ，從而殺傷靶細胞[1-3]。本研究通過構(gòu)建重組B7-H6過表達載體并轉(zhuǎn)染肝細胞系L02，以驗證NK細胞對過表達B7-H6的肝細胞的殺傷效應，為進一步研究B7-H6表達在重癥乙型肝炎肝細胞損傷中的作用提供理論基礎。

材 料 和 方 法

1主要試劑

DH5α感受態(tài)細胞、L02細胞和NK-92細胞(本實驗室保存)；DNA限制性內(nèi)切酶(Thermo Scienti-fic)；PrimeSTAR高保真DNA聚合酶、T4 DNA連接酶和2×PrimeSTAR Max Premix (TaKaRa)；柱離心式膠回收試劑盒、DNA抽提純化試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒和PCR引物(中美泰和)；Lipofectamine 2000(Invitrogen)；pIRES2-EGFP慢病毒載體(Promega)。

2主要方法

2.1引物設計與目的基因擴增 根據(jù)GenBank的B7-H6基因序列設計擴增引物。上游引物為5’-GGAATTCACCATGACGTGGAGGGCTGC-3’，下游引物為5’-CGGGATCCTTACTGTAGGGGTAACAG-3’，劃線部分為引入酶切位點(EcoR I和BamH I)，酶切位點前為保護堿基。利用 TRIzol試劑(Invitrogen)提取K562細胞總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。以此為模板進行PCR擴增，PCR循環(huán)參數(shù)如下： 94 ℃ 預變性5 min； 94 ℃ 變性30 s， 55 ℃ 退火30 s， 72 ℃ 延伸30 s，完成30個循環(huán)；最后72 ℃ 延伸10 min，置于4 ℃ 保存。取擴增產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳，鑒定PCR 擴增結(jié)果。

2.2pIRES2-EGFP-B7-H6重組質(zhì)粒的構(gòu)建 分別以EcoR I和BamH I雙酶切PCR產(chǎn)物及pIRES2-EGFP，將含酶切位點黏性末端的B7-H6全長ORF序列和線性化質(zhì)粒pLVX-IRES-ZsGreen按(2～6)∶1混合，經(jīng)T4 DNA連接酶連接過夜。連接后的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，經(jīng)含氨芐青霉素培養(yǎng)基篩選后，挑取單克隆菌株培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒，并以之為模板行PCR及瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并將重組質(zhì)粒進行測序。

2.3細胞轉(zhuǎn)染 細胞接種于24孔板，按Lipofectamine 2000 使用說明書轉(zhuǎn)染 293T 細胞，轉(zhuǎn)染后48 h用熒光顯微鏡觀察標簽蛋白 EGFP 的表達。

2.4qRT-PCR實驗 采用qRT-PCR檢測L02細胞B7-H6的mRNA表達。L02細胞轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pIRES2-EGFP-B7-H6 48 h后收集細胞，利用 TRIzol試劑提取總RNA。隨后，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。使用SYBR Green PCR試劑盒，通過ABI 7500序列檢測系統(tǒng)(Applied Biosystems)進行實時定量PCR檢測。用于擴增B7-H6的引物序列是5’-TCACCAAGAGGCATTCCGACCT-3’(正義)和5’-ACCACCTCACATCGGTACTCTC-3’(反義)。管家基因GAPDH用作內(nèi)部對照。

2.5Western blot實驗 收獲轉(zhuǎn)染后 293T 細胞，利用裂解液(RIPA，含蛋白酶抑制劑)裂解細胞，收集上清，然后通過SDS-PAGE分離等量的蛋白質(zhì)提取物(30 μg)并轉(zhuǎn)移到PVDF膜中。5%脫脂牛奶封閉非特異性結(jié)合位點。加入抗B7-H6兔多克隆抗體(Abcam)，4 ℃ 孵育過夜。TBST液洗膜5次，每次5 min，過氧化物酶標記的 II 抗(1∶5 000)室溫孵育 1 h，TBST液洗膜5次，每次5 min。ECL法檢測B7-H6的表達。

2.6細胞毒分析 利用CCK-8實驗分析評估NK細胞對L02細胞的殺傷效應。將轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-B7-H6重組質(zhì)粒48 h的L02細胞用作靶細胞，NK-92細胞用作效應細胞。將靶細胞接種在96孔板中，每孔1×104個細胞。將效應細胞與靶細胞分別以效/靶比1∶1、1∶5、1∶10或1∶25混合，同時每孔加入15 μL CCK-8試劑，37 ℃孵育4 h后，利用酶標儀檢測540 nm和630 nm處的吸光度(A)值。NK細胞溶解L02細胞的百分率(%)=(AT-AE+T)/AT×100%，其中T為靶細胞，E為效應細胞，E+T為靶細胞和效應細胞共孵育4 h。

3統(tǒng)計學處理

用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，兩組間均數(shù)的比較用t檢驗，多組間均數(shù)的比較采單因素方差分析(one-way ANOVA)，以P<0.05差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1人B7-H6基因全長片段PCR擴增結(jié)果

人B7-H6基因全長擴增片段在約1.3 kb處出現(xiàn)明顯的條帶，與目的片段大小相符，見圖1。

Figure 1. Amplification of the full-length fragment ofB7-H6 gene by PCR.

圖1B7-H6基因全長片段的PCR擴增圖

2pIRES2-EGFP-B7-H6重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定

重組質(zhì)粒用EcoR I和BamH I雙酶切，會切出長片段及短片段，與預期結(jié)果一致，見圖2。質(zhì)粒和菌液測序結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒酶切位點及起始密碼子和終止密碼子均被測出，經(jīng)拼接技術(shù)拼接后再經(jīng)過GeneBank BLAST比對證實pIRES2-EGFP-B7-H6重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

Figure 2. The map of restriction enzyme double digestion for recombinant plasmid pIRES2-EGFP-B7-H6.

圖2重組質(zhì)粒pIRES2-EGFP-B7-H6雙酶切產(chǎn)物凝膠電泳圖

3pIRES2-EGFP-B7-H6重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染L02細胞后B7-H6的mRNA和蛋白表達

pIRES2-EGFP-B7-H6重組質(zhì)粒脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染L02細胞后48 h后，在熒光顯微鏡下觀察到較強綠色熒光表達，利用流式細胞技術(shù)檢測pIRES2-EGFP-B7-H6的轉(zhuǎn)染效率為92.6%，見圖3A；qRT-PCR和Western blot結(jié)果證實L02細胞中B7-H6的mRNA和蛋白表達上調(diào)，見圖3B、C。

Figure 3. The expression of B7-H6 at mRNA and protein levels in the L02 cells transfected with recombinant pIRES2-EGFP-B7-H6 plasmid. EGFP expression was detected under fluorescence microscope (A)， and B7-H6 expression was confirmed by qRT-PCR (B) and Western blot(C). Mean±SD.n=3.**P<0.01vsmock group.

圖3重組質(zhì)粒pIRES2-EGFP-B7-H6轉(zhuǎn)染L02細胞后B7-H6mRNA和蛋白表達分析

4NK-92細胞對轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-B7-H6質(zhì)粒的L02細胞的殺傷效應

當NK-92細胞與轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-B7-H6質(zhì)粒48 h的 L02細胞以不同的效靶比共培養(yǎng)4 h后, 通過CCK-8實驗分析發(fā)現(xiàn)，相對于正常L02細胞和轉(zhuǎn)染了空載體pIRES2-EGFP的L02細胞，NK-92細胞對轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-B7-H6質(zhì)粒的L02細胞具有顯著的殺傷效應(P<0.05)，見圖4。

Figure 4. The cytotoxic effect of NK-92 cells against L02 cells transfected with recombinant plasmid pIRES2-EGFP-B7-H6. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsother groups.

圖4NK-92細胞對轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-B7-H6重組質(zhì)粒的L02細胞的殺傷效應

討 論

B7-H6 分子是近年來發(fā)現(xiàn)的B7家族新成員[1-3]。Brandt等[1]應用生物素化的NKp30-Fc 蛋白作為探針，通過免疫共沉淀技術(shù)將與NKp30-Fc 蛋白結(jié)合的相反結(jié)構(gòu)的多肽進行質(zhì)譜分析捕獲了假定蛋白DKFZp686024166。DKFZp686024166編碼454個氨基酸的I型跨膜蛋白, 胞內(nèi)區(qū)含有SaYtpL、SH2和SH3等多種信號分子以及一個Gag同源序列。DKFZp686024166與B7家族成員B7-H1和B7-H3具有序列相似性，其中與B7-H1的序列相似性達20%。受體NKp30序列和結(jié)構(gòu)分析表明NKp30與CD28家族成員cTLA4同源，進一步證實了DKFZp686024166來源于B7家族，將之命名為B7-H6。Brandt等[1]進一步證實，B7家族成員B7-H6為人類NK細胞細胞毒性受體NKp30的配體，可以選擇性地表達在一些腫瘤細胞和惡性血液病細胞的血和骨髓，但在大多數(shù)正常組織細胞表達缺失或弱表達。

最近的研究進一步表明，B7-H6 可被誘導表達于抗原呈遞細胞(antigen-presenting cells，APC)表面，參與NK-APC 對話[4]。而且B7-H6在某些炎癥環(huán)境中也可以被誘導表達。Matta等[5]發(fā)現(xiàn)膿毒血癥患者外周血促炎癥單核細胞(CD14+CD16+)表達B7-H6，并且與死亡率升高密切相關(guān)。體外通過Toll樣受體配體及炎癥細胞因子IL-1β和TNF-α刺激單核細胞和粒細胞，B7-H6也可以被誘導表達。我們前期的研究報道，NK細胞在人類重癥乙型肝炎患者肝臟顯著活化和大量募集，外周血NK細胞細胞毒性受體(NKp30和NKp46)的表達也顯著增強[6]。最近我們又發(fā)現(xiàn)，在重癥乙型肝炎病人肝組織中，B7-H6可以被誘導表達，這可能與重癥乙型肝炎肝臟的高炎癥狀態(tài)及細胞因子的“瀑布級聯(lián)效應”密切相關(guān)。為進一步研究重癥乙型肝炎B7-H6的表達在NK細胞介導的肝細胞凋亡中的作用,我們構(gòu)建了B7-H6過表達真核表達載體并轉(zhuǎn)染肝細胞系L02實現(xiàn)了肝細胞B7-H6的過表達，進一步通過CCK-8分析評估了NK-92細胞對過表達B7-H6的肝細胞的殺傷效應。我們的研究結(jié)果顯示, NK-92細胞對轉(zhuǎn)染過表達B7-H6真核表達載體的肝細胞具有顯著的殺傷效應，表明在重癥乙型肝炎中，NK細胞可能通過NKp30-B7-H6識別通路介導肝細胞損傷，其精確的分子機制需進一步深入研究。

[1] Brandt CS, Baratin M, Yi EC, et al. The B7 family member B7-H6 is a tumor cell ligand for the activating natural killer cell receptor NKp30 in humans[J]. J Exp Med, 2009, 206(7):1495-1503.

[2] Li Y, Wang Q, Mariuzza RA. Structure of the human activating natural cytotoxicity receptor NKp30 bound to its tumor cell ligand B7-H6[J]. J Exp Med, 2011, 208(4):703-714.

[3] Cao G, Wang J, Zheng X, et al. Tumor therapeutics work as stress inducers to enhance tumor sensitivity to natural killer (NK) cell cytolysis by up-regulating NKp30 ligand B7-H6[J]. J Biol Chem, 2015, 290(50):29964-29973.

[4] Rusakiewicz S, Nocturne G, Lazure T, et al. NCR3/NKp30 contributes to pathogenesis in primary Sjogren’s syndrome[J]. Sci Transl Med, 2013, 5(195):195ra96.

[5] Matta J, Baratin M, Chiche L, et al. Induction of B7-H6, a ligand for the natural killer cell-activating receptor NKp30, in inflammatory conditions[J]. Blood, 2013, 122(3):394-404.

[6] Zou Y, Chen T, Han M, et al. Increased killing of liver NK cells by Fas/Fas ligand and NKG2D/NKG2D ligand contributes to hepatocyte necrosis in virus-induced liver failure[J]. J Immunol, 2010, 184(1):466-475.

(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Role of B7-H6 over-expression in NK cell-mediated apoptosis of hepatocytes

ZOU Yong1, LIN Zhe-sheng1, CHEN Yu-chan1，LIAO Si-hong1, YUAN Qing1, LIN Dong-jun1, 2

(1DepartmentofBloodTransfusion，2DepartmentofHematology,TheThirdAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China.E-mail:zouyong0205@163.com;lindongjun0168@163.com)

AIM: To investigate the role of B7 homologue 6 (B7-H6) over-expression in natural killer (NK) cell-mediated hepatocyte apoptosis.METHODSThe full-length fragment ofB7-H6 gene was amplified by PCR and subcloned into linearized eukaryotic expression vector pIRES2-EGFP to construct recombinantB7-H6 over-expression vector pIRES2-EGFP-B7-H6. The recombinant plasmid was identified by double digestion, PCR and sequencing, and was then transfected into L02 cells. The expression of EGFP was observed by fluorescence microscopy and the transfection efficiency was evaluated by flow cytometry. B7-H6 expression was confirmed by qRT-PCR and Western blot. The L02 cells transfected with pIRES2-EGFP-B7-H6 recombinant plasmid were co-cultured with NK-92 cells at different effector/target ratios, and the cytotoxicity of NK-92 cells was evaluated by CCK-8 assay.RESULTSThe strong green fluorescence in the L02 cells was observed under fluorescence microscope 48 h after transfection. The transfection efficiency reached 92.6%. The expression of B7-H6 at mRNA and protein levels was remarkably increased 48 h after transfection. The cytotoxicity of NK-92 cells against L02 cells transfected with pIRES2-EGFP-B7-H6 plasmid was significantly higher than that of the null vector transfection group (P<0.05).CONCLUSIONThe recombinant eukaryotic expression vector pIRES2-EGFP-B7-H6 was constructed successfully. The cytotoxic effect of NK-92 cells against L02 cells can be enhanced by transfecting L02 cells with pIRES2-EGFP-B7-H6 plasmid.

B7 homologue 6; Eukaryotic expression vector; Natural killer cells; Hepatocytes; Apoptosis

1000- 4718(2017)11- 2095- 04

2017- 05- 12

2017- 09- 01

廣東省科技計劃資助項目(No. 2014A020212575； No. 2016A020215215)；廣東省自然科學基金資助項目(No. 2016A030313357)

△通訊作者 鄒勇 Tel： 020-85252526； E-mail： zouyong0205@163.com； 林東軍 Tel: 020-85252389; E-mail： lindongjun0168@163.com

R329.21； R575.1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.11.028