康攀攀， 劉映雪， 郭甜甜， 張公安， 李東軒， 田 華， 周 健， 秦樹(shù)存△， 姚樹(shù)桐, △

(泰山醫(yī)學(xué)院 1動(dòng)脈粥樣硬化研究所， 2人口與計(jì)劃生育學(xué)院， 3口腔醫(yī)學(xué)院，4生命科學(xué)學(xué)院， 5基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 山東 泰安 271000； 6承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院， 河北 承德 067000)

大蒜素通過(guò)抑制caspase-12減輕巨噬源性泡沫細(xì)胞凋亡*

康攀攀1, 6， 劉映雪2▲， 郭甜甜3， 張公安4， 李東軒5， 田 華1， 周 健6， 秦樹(shù)存1△， 姚樹(shù)桐1, 5△

(泰山醫(yī)學(xué)院1動(dòng)脈粥樣硬化研究所，2人口與計(jì)劃生育學(xué)院，3口腔醫(yī)學(xué)院，4生命科學(xué)學(xué)院，5基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 山東 泰安 271000；6承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院， 河北 承德 067000)

目的研究大蒜素對(duì)巨噬源性泡沫細(xì)胞凋亡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)凋亡通路關(guān)鍵分子半胱天冬酶-12(caspase-12)的影響，并探討可能的分子機(jī)制。方法體外培養(yǎng)RAW264.7巨噬細(xì)胞，分別給予大蒜素(12.5、25和50 mg/L)和4-苯丁酸(4-phenylbutyric acid，PBA；4 mmol/L)預(yù)處理1 h后，加入氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL； 100 mg/L)或衣霉素(tunicamycin，TM；4 mg/L)處理24 h。分別采用MTT法和Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞活力和凋亡情況；采用相應(yīng)的試劑盒測(cè)定細(xì)胞內(nèi)caspase-3和培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDH)的活性；采用Western blot技術(shù)檢測(cè)caspase-12的表達(dá)變化；油紅O染色檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積；酶比色法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)總膽固醇含量。結(jié)果與ERS抑制劑PBA相似，大蒜素可減輕ox-LDL所致的巨噬細(xì)胞損傷，表現(xiàn)為細(xì)胞活力增加、LDH漏出減少、細(xì)胞凋亡率和caspase-3活性降低(P<0.05)；ERS誘導(dǎo)劑TM可導(dǎo)致巨噬細(xì)胞活力下降，LDH漏出增多及細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05)，大蒜素可明顯阻斷TM的上述作用；大蒜素明顯抑制ox-LDL所致的caspase-12活化(P<0.05)；與TM組相比，大蒜素也可顯著抑制TM所誘導(dǎo)的caspase-12活化(P<0.05)。另外，大蒜素還可顯著抑制ox-LDL所誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積和泡沫細(xì)胞形成(P<0.05)。結(jié)論大蒜素可減少 ox-LDL 所致的巨噬源性泡沫細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與抑制caspase-12活化有關(guān)。

大蒜素； 半胱天冬酶-12； 氧化低密度脂蛋白； 巨噬細(xì)胞； 細(xì)胞凋亡

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是心腦血管疾病的主要病理基礎(chǔ)，AS斑塊破裂是導(dǎo)致急性心血管事件如心源性猝死和急性心肌梗死的主要原因，而斑塊中巨噬源性泡沫細(xì)胞凋亡因可促進(jìn)斑塊壞死核心增大、減少細(xì)胞外基質(zhì)的分泌而成為斑塊不穩(wěn)定性的重要因素[1]。研究表明，由半胱天冬酶(caspase)-12和C/EBP同源蛋白等分子介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)凋亡途徑是介導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制，并與易損斑塊的形成有著密切關(guān)系，因此減輕巨噬細(xì)胞ERS凋亡途徑對(duì)增強(qiáng)粥樣斑塊穩(wěn)定性、降低急性心腦血管事件的發(fā)生率具有重要意義[2]。大蒜是中國(guó)等亞洲國(guó)家常見(jiàn)的藥食兩用食品，因其具有抗細(xì)菌、抗病毒、抗腫瘤、降血脂、調(diào)節(jié)血糖和免疫功能等生物活性而備受世人青睞[3-4]。大蒜素(allicin)是從大蒜鱗莖中提取的一種具有揮發(fā)性的硫化物，為大蒜的主要功能成分之一。研究表明大蒜素可降低膽固醇[5]，并通過(guò)抑制氧化應(yīng)激減輕氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[6]。本課題組既往研究證實(shí)，大蒜素可改善高脂血癥大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞功能，減輕肝損傷，并與非諾貝特具有協(xié)同作用[7]。王喜歡等[8]在ApoE-/-小鼠AS模型中研究發(fā)現(xiàn)，大蒜素可顯著減少主動(dòng)脈根部斑塊面積以及腹腔巨噬細(xì)胞泡沫化的形成。但是大蒜素是否可通過(guò)抑制caspase-12介導(dǎo)的ERS凋亡途徑減輕巨噬源性泡沫細(xì)胞凋亡，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)分別在ox-LDL和ERS誘導(dǎo)劑衣霉素(tunicamycin，TM)誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞損傷模型上研究大蒜素對(duì)細(xì)胞凋亡和caspase-12活化的影響，以探討其對(duì)巨噬細(xì)胞的作用及機(jī)制。

材 料 和 方 法

1細(xì)胞和試劑

鼠源RAW264.7巨噬細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫(kù)；DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自Gibco；ox-LDL購(gòu)自北京協(xié)生生物科技有限公司；大蒜素注射液和RIPA裂解液分別購(gòu)自上海禾豐制藥有限公司和北京索萊寶科技有限公司；四甲基偶氮唑藍(lán) [3-(4,5-dimethylthiazol-2-y-l)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide，MTT] 和Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒分別購(gòu)自Genview和南京凱基生物科技公司；兔抗caspase-12多克隆抗體和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG分別購(gòu)自Abcam和北京中杉金橋公司；caspase-3活性測(cè)定試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)和組織/細(xì)胞總膽固醇(total cholesterol，TC)測(cè)定試劑盒分別購(gòu)自南京建成生物和北京普利萊公司；抗β-actin抗體、TM、ERS抑制劑4-苯丁酸(4-phenylbutyric acid，PBA)和油紅O染色試劑均購(gòu)自Sigma；ECL增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑盒和PVDF膜分別購(gòu)自Pierce和Millipore；其余試劑均為分析純。

2方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)分組 巨噬細(xì)胞RAW264.7用含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。為研究大蒜素對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞凋亡的作用，細(xì)胞隨機(jī)分為：(1)正常對(duì)照(control)組：培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)；(2)ox-LDL組：培養(yǎng)液中加入100 mg/L ox-LDL；(3)不同濃度大蒜素預(yù)處理(allicin+ox-LDL)組：培養(yǎng)液中先加入大蒜素(12.5、25和50 mg/L)預(yù)處理1 h[9]，再加入100 mg/L ox-LDL；(4)PBA預(yù)處理(PBA+ox-LDL)組：培養(yǎng)液中先加入4 mmol/L PBA預(yù)處理1 h，再加入100 mg/L ox-LDL。上述各組細(xì)胞均于加入ox-LDL后24 h收集處理。另外，為了進(jìn)一步驗(yàn)證大蒜素與ERS的關(guān)系，我們?cè)O(shè)置了如下實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞隨機(jī)分為3組：(1)control組：培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)；(2)TM組：加入4 mg/L TM處理細(xì)胞24 h；(3)allicin+TM組：先給予50 mg/L大蒜素預(yù)處理1 h，再加入4 mg/L的TM處理24 h。

2.2細(xì)胞活力和LDH活性的測(cè)定 各組細(xì)胞接種于96孔板后每孔加入0.5 g/L的MTT，37 ℃避光培養(yǎng)4 h，吸棄培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，水平振蕩10 min，采用多功能酶標(biāo)儀在490 nm處測(cè)定吸光度(A)值。以正常對(duì)照組細(xì)胞活力為100%，其余各組細(xì)胞活力以其A值占正常對(duì)照組A值的百分比表示。另外按照LDH活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書測(cè)定各組培養(yǎng)液中LDH活性以評(píng)價(jià)細(xì)胞膜損傷情況。

2.3Annexin V-FITC/PI雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 細(xì)胞經(jīng)處理后，收集并重懸于500 μL上樣緩沖液中，加入Annexin V-FITC和PI各5 μL室溫避光孵育15 min。細(xì)胞凋亡率采用流式細(xì)胞儀分析測(cè)定。細(xì)胞總凋亡率(%)= 早期凋亡率(Annexin V+/PI-)+ 晚期凋亡率(Annexin V+/PI+)。

2.4細(xì)胞內(nèi)caspase-3活性的測(cè)定 收集處理后的細(xì)胞用PBS洗滌1次，以裂解液裂解15 min，4 ℃ 16 000 ×g離心15 min，取上清液采用Bradford法測(cè)定蛋白濃度。在96孔板中將10 μL上清液、80 μL反應(yīng)緩沖液和10 μL caspase-3底物混合并在37 ℃孵育2 h。在多功能酶標(biāo)儀405 nm處讀取A值，相同條件獲取標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算樣品caspase-3活性。以正常對(duì)照組caspase-3活性為100%，其余各組細(xì)胞caspase-3活性以其占正常對(duì)照組的百分比表示。

2.5Western blot分析 依據(jù)本課題組前期報(bào)道的方法[10]提取細(xì)胞蛋白，經(jīng)SDS-PAGE分離并電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，封閉、洗滌后與caspase-12多克隆抗體(1∶800)4 ℃孵育過(guò)夜，以β-actin為內(nèi)參照。洗膜后與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的 II 抗室溫孵育2 h?？乖?抗體復(fù)合物以增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯示，采集圖像，并用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件分析蛋白條帶累積吸光度(integrated absorbance，IA)值，以靶蛋白IA值與β-actinIA值的比值反映靶蛋白的相對(duì)水平。

2.6油紅O染色觀察細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積 將細(xì)胞培養(yǎng)于放有無(wú)菌蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中，經(jīng)PBS潤(rùn)洗3次，4%甲醛溶液固定30 min，PBS潤(rùn)洗后用油紅O染色液染色15 min，蒸餾水潤(rùn)洗后蘇木素染色 2 min，水性封片劑封固。Olympus BX51顯微鏡觀察并采圖，用Image-Pro Plus 6.0軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，細(xì)胞內(nèi)脂滴(油紅O陽(yáng)性)含量以細(xì)胞平均IA值表示。

2.7細(xì)胞內(nèi)TC含量的測(cè)定 按照組織/細(xì)胞TC測(cè)定試劑盒說(shuō)明書測(cè)定細(xì)胞內(nèi)TC含量，并以細(xì)胞中每克蛋白所含的TC量(μmol/g)表示。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

以SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1大蒜素減輕ox-LDL或TM誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞損傷

分別以 12.5、25、50和100 mg/L大蒜素處理 RAW264.7巨噬細(xì)胞24 h，除100 mg/L大蒜素處理組細(xì)胞活力較正常對(duì)照組降低(P<0.05)外，其它各組細(xì)胞活力與正常對(duì)照組比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明12.5～50 mg/L的大蒜素對(duì)細(xì)胞無(wú)明顯毒性作用，見(jiàn)圖1A。100 mg/L ox-LDL作用后，細(xì)胞活性明顯降低，大蒜素與PBA均可減輕ox-LDL所誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，表現(xiàn)為細(xì)胞活力增加和LDH漏出減少(P<0.05)，見(jiàn)圖1B、C。

此外在ERS誘導(dǎo)劑TM造成的巨噬細(xì)胞損傷模型上也觀察到大蒜素的類似保護(hù)作用，表現(xiàn)為與TM組比較，allicin+TM組細(xì)胞活力增加和LDH漏出減少(P<0.05)，見(jiàn)圖1D、E。

2大蒜素抑制ox-LDL或TM誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡

與ox-LDL組比較，大蒜素預(yù)處理組的細(xì)胞凋亡率和caspase-3活性均明顯降低，尤以50 mg/L大蒜素預(yù)處理組最為顯著(P<0.01)，結(jié)果與PBA預(yù)處理組相似，見(jiàn)圖2A、B；另外，大蒜素也可使TM所致的細(xì)胞凋亡率降低32.3%(P<0.05)，見(jiàn)圖2C，提示大蒜素可能通過(guò)抑制ERS信號(hào)通路減輕巨噬細(xì)胞凋亡。

3大蒜素抑制ox-LDL或TM誘導(dǎo)的caspase-12活化

與ox-LDL處理組比較，25 mg/L和50 mg/L大蒜素預(yù)處理組cleaved caspase-12水平分別減少了37.6%和51.6%(P<0.05)，其對(duì)caspase-12活化的抑制作用與PBA相似；此外，大蒜素也可抑制TM所致的caspase-12活化(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

4大蒜素抑制ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬源性泡沫細(xì)胞形成

油紅O染色和細(xì)胞內(nèi)TC測(cè)定結(jié)果均顯示，與正常對(duì)照組比較，ox-LDL 組巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積顯著增加(P<0.01)，而大蒜素則明顯抑制 ox-LDL 所誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積(P<0.05)，提示大蒜素可抑制巨噬源性泡沫細(xì)胞形成，見(jiàn)圖4。

Figure 1. Allicin inhibited the cell injury and LDH leakage of RAW264.7 cells induced by ox-LDL or TM. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsox-LDL group;&P<0.05vsTM group.

圖1大蒜素抑制ox-LDL或TM所致的RAW264.7巨噬細(xì)胞損傷

討 論

巨噬細(xì)胞與AS的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，尤其是晚期AS粥樣斑塊中巨噬源性泡沫細(xì)胞凋亡是造成粥樣斑塊破裂進(jìn)而導(dǎo)致急性心腦血管事件的關(guān)鍵因素[1]。ox-LDL是導(dǎo)致巨噬源性泡沫細(xì)胞形成和凋亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，在 AS發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要作用，因此減輕ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬源性泡沫細(xì)胞凋亡對(duì)于AS相關(guān)疾病的防治具有重要意義。一項(xiàng)隨機(jī)對(duì)照臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，與安慰劑對(duì)照組比較，冠心病患者服用大蒜片劑3個(gè)月后頸動(dòng)脈內(nèi)膜中層厚度增加速度明顯受到抑制[11]。作為大蒜中的主要功能成分，大蒜素對(duì)AS的防治作用及機(jī)制研究近年來(lái)國(guó)內(nèi)外有較多報(bào)道。大蒜素能有效降低老年高脂血癥患者血脂水平[12]，減輕血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷[6-7, 9]，并減少ApoE-/-小鼠AS斑塊面積[8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大蒜素明顯減輕ox-LDL所引起的巨噬細(xì)胞損傷，表現(xiàn)為細(xì)胞活力增加、LDH漏出減少、細(xì)胞凋亡率和caspase-3活性降低。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)蛋白合成、折疊的主要場(chǎng)所和調(diào)控鈣穩(wěn)態(tài)平衡的重要細(xì)胞器。缺氧、氧化應(yīng)激和膽固醇超負(fù)荷等因素均可導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂，出現(xiàn)以未折疊/錯(cuò)誤折疊蛋白聚集和鈣穩(wěn)態(tài)失衡為主要特征的ERS反應(yīng)。一定程度的ERS可通過(guò)暫時(shí)性抑制蛋白合成、上調(diào)分子伴侶表達(dá)和激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白降解途徑維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能，促進(jìn)細(xì)胞生存。但是過(guò)強(qiáng)或長(zhǎng)時(shí)間ERS則可誘發(fā)細(xì)胞凋亡，其中caspase-12是介導(dǎo)ERS相關(guān)凋亡途徑的重要分子之一[13]。在生理狀態(tài)下，caspase-12以酶原形式存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜胞漿側(cè)，而在ERS時(shí)被特異激活，通過(guò)激活caspase-9和caspase-3而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[14]。有研究表明，ox-LDL可通過(guò)激活caspase-12誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[15]。本課題組前期研究亦表明ox-LDL和晚期糖基化白蛋白通過(guò)激活caspase-12誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡，而蜂膠醇提物和載脂蛋白A1模擬肽D4F則通過(guò)抑制該信號(hào)通路減輕ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡[10, 16-17]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大蒜素減輕ox-LDL所致巨噬細(xì)胞損傷的作用與ERS抑制劑PBA相似，同時(shí)可減輕ERS誘導(dǎo)劑TM所誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷。另外，大蒜素不僅可抑制ox-LDL所誘導(dǎo)的caspase-12活化，還可以減輕TM所致的caspase-12活化，表明大蒜素可通過(guò)抑制caspase-12活化減輕ox-LDL所誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡。

Figure 2. Allicin inhibited RAW264.7 cell apoptosis induced by ox-LDL or TM. Mean±SD.n=6.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsox-LDL group;&P<0.05vsTM group.

圖2大蒜素抑制ox-LDL或TM所致的RAW264.7巨噬細(xì)胞凋亡

Figure 3. Allicin inhibited caspase-12 activation in the RAW264.7 cells induced by ox-LDL or TM. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsox-LDL group;&P<0.05vsTM group.

圖3大蒜素抑制ox-LDL或TM所誘導(dǎo)的caspase-12活化

細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積是導(dǎo)致巨噬細(xì)胞泡沫化和ERS凋亡途徑激活的重要因素[18-19]。本課題前期工作證實(shí)，ox-LDL可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積，進(jìn)而觸發(fā)ERS反應(yīng)，而D4F可抑制巨噬細(xì)胞泡沫化和ERS凋亡途徑介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[20-22]。文獻(xiàn)報(bào)道大蒜素可減少ApoE-/-小鼠腹腔巨噬細(xì)胞泡沫化的形成[8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大蒜素可抑制 ox-LDL 所誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積，提示大蒜素對(duì)caspase-12介導(dǎo)的ERS凋亡途徑的抑制作用可能與減輕脂質(zhì)蓄積有關(guān)。

Figure 4. Allicin inhibited intracellular lipid accumulation in the RAW264.7 cells. A: intracellular lipid droplets (scale bar=20 μm); B: total cholesterol (TC) content. Mean±SD.n=6.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsox-LDL group.

圖4大蒜素抑制ox-LDL所誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)大蒜素可減輕 ox-LDL 誘導(dǎo)的巨噬源性泡沫細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與抑制caspase-12活化有關(guān)。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 余小慧)

Allicin attenuates macrophage-derived foam cell apoptosis by inhibiting caspase-12

KANG Pan-pan1, 6, LIU Ying-xue2, GUO Tian-tian3, ZHANG Gong-an4, LI Dong-xuan5, TIAN Hua1, ZHOU Jian6, QIN Shu-cun1, YAO Shu-tong1, 5

(1InstituteofAtheroscleroofsis,2CollegeofPopulationandFamilyPlanning，3SchoolofDentistryandOralHealth，4CollegeofLifeSciences，5CollegeofBasicMedicalSciences,TaishanMedicalUniversity,Taian271000,China；6AffiliatedHospitalofChengdeMedicalUniversity，Chengde067000，China.E-mail:shucunqin@hotmail.com;yst228@126.com)

AIM: To investigate the inhibitory effect of allicin on apoptosis and caspase-12 activation of macrophage-derived foam cells, and to elucidate the underlying molecular mechanisms.METHODSRAW264.7 macrophages were pretreated with allicin (12.5, 25 and 50 mg/L) or 4-phenylbutyric acid (PBA, 4 mmol/L) for 1 h and then treated with oxidized low-density lipoprotein (ox-LDL, 100 mg/L) or tunicamycin (TM, 4 mg/L) for 24 h. The cell viability and apoptosis were examined by MTT assay and flow cytometry with Annexin V-FITC/PI staining, respectively. The activities of caspase-3 in the cells and lactic dehydrogenase (LDH) in the medium were measured. The protein levels of caspase-12 were determined by Western blot. The intracellular lipid accumulation was measured with oil red O staining and the content of intracellular total cholesterol was determined by enzymatic colorimetry.RESULTSSimilar to the endoplasmic reticulum stress (ERS) inhibitor PBA, allicin inhibited ox-LDL-induced injury of RAW264.7 macrophages in a concentration-dependent manner, as determined by the increased cell viability and the decreased LDH leakage, apoptosis and caspase-3 activity. The decrease in cell viability and increases in LDH leakage and apoptosis induced by TM (an ERS inducer) were also suppressed by allicin. Moreover, similar to PBA, allicin remarkably inhibited ox-LDL- or TM-induced activation of caspase-12. Furthermore, allicin remarkably attenuated ox-LDL-induced lipid accumulation in the RAW264.7 cells and foam cells formation in a concentration-dependent manner.CONCLUSIONAllicin may inhibit macrophage-derived foam cell apoptosis induced by ox-LDL, and the mechanism is partially related to suppressing the activation of caspase-12.

Allicin; Caspase-12; Oxidized low-density lipoprotein; Macrophages; Apoptosis

1000- 4718(2017)11- 1951- 07

2017- 04- 06

2017- 05- 10

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81570410； No. 81370381)；泰山醫(yī)學(xué)院國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目(No. 201510439099； No. 201510439126)；山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計(jì)劃(No. 2013WS0319)

△通訊作者 秦樹(shù)存 Tel: 0538-6237252; E-mail: shucunqin@hotmail.com; 姚樹(shù)桐 Tel： 0538-6225010； E-mail: yst228@126.com

▲并列第1作者

R285.5； R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.11.005