張 堃，朱克儉，譚旭儀，黃 剛，李 平，沈宏榮，朱 璐，馬思靜，朱 沛

(1.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院放射科，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合學院，湖南 長沙 410208；3.湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院內科，4.骨傷科，6.藥劑科，湖南 長沙 410006；5.湖南省人民醫(yī)院超聲科，湖南 長沙 410005)

MRT2mapping成像評估止痛健骨方治療膝骨性關節(jié)炎關節(jié)軟骨損傷療效的實驗研究

張 堃1,2，朱克儉2,3*，譚旭儀4，黃 剛4，李 平1，沈宏榮1，朱 璐5，馬思靜6，朱 沛6

(1.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院放射科，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合學院，湖南 長沙 410208；3.湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院內科，4.骨傷科，6.藥劑科，湖南 長沙 410006；5.湖南省人民醫(yī)院超聲科，湖南 長沙 410005)

目的探討MR T2 mapping成像評價止痛健骨方治療骨性關節(jié)炎軟骨損傷療效的價值。方法采用木瓜蛋白酶關節(jié)腔注射法制作新西蘭大白兔膝骨關節(jié)炎模型，根據治療方法不同將48只新西蘭大白兔隨機分為正常對照組、模型對照組、鹽酸氨基葡萄糖治療組、止痛健骨方治療組。各組治療4周后行膝關節(jié)MR T2 mapping成像并對關節(jié)軟骨基質金屬蛋白酶1(MMP-1)含量進行免疫組化分析。比較各組間關節(jié)軟骨T2值及關節(jié)軟骨MMP-1含量的差異，并分析不同干預方法、關節(jié)軟骨MMP-1含量與關節(jié)軟骨T2值的相關性。結果模型對照組關節(jié)軟骨T2值高于其他3組(P均<0.01)，其他3組間關節(jié)軟骨T2值差異無統計學意義。鹽酸氨基葡萄糖治療模型組、止痛健骨方治療模型組間關節(jié)軟骨MMP-1含量差異無統計學意義，但2組關節(jié)軟骨的MMP-1含量低于模型對照組(P均<0.05)、高于正常對照組(P均<0.05)。關節(jié)軟骨MMP-1含量與T2值間為非線性關系，隨著前者的升高，后者先緩慢上升再快速上升(P<0.05)。結論MR T2 mapping成像有助于評價止痛健骨方治療模型兔骨關節(jié)炎軟骨損傷的療效，關節(jié)軟骨MMP-1含量與T2值間可能為非線性關系。

骨性關節(jié)炎；軟骨；止痛健骨方；磁共振成像；T2圖；基質金屬蛋白酶1

骨性關節(jié)炎又稱退行性骨關節(jié)病，屬常見病，嚴重影響患者生活質量，并給社會帶來沉重的經濟負擔[1]。關節(jié)軟骨退變是骨性關節(jié)炎發(fā)生、發(fā)展的核心環(huán)節(jié)[2]，軟骨基質金屬蛋白酶1(matrix metalloprotease 1， MMP-1)在其中發(fā)揮了重要的作用[3]。止痛健骨方取自痰瘀同治、兼補肝腎之效驗方，其對膝關節(jié)骨性關節(jié)炎(knee osteoarthritis， KOA)關節(jié)軟骨損傷具有防治作用[4]。目前中西醫(yī)KOA藥物治療療效評估主要依靠病理、癥狀、X線等手段，存在有創(chuàng)、臨床可操作性差、特異性低、主觀性強等局限性，且在中醫(yī)藥領域表現的更為突出[5-6]。MR T2 mapping成像可無創(chuàng)、動態(tài)、準確地對關節(jié)軟骨損傷程度進行定量評估[7]，在中藥治療KOA領域展現出了良好的應用前景及價值。本研究旨在探索MR T2 mapping成像用于評價止痛健骨方治療KOA軟骨損傷療效的可行性，初步闡明定量T2值與關節(jié)軟骨內MMP-1含量的關系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級新西蘭健康成年大白兔48只，雌雄各半，月齡2～3個月，體質量1.40～2.46 kg，平均(2.00±0.21)kg，動物許可證號：SCXK(湘)2015-0008。

1.2 實驗用藥 止痛健骨方：當歸12 g，白芥子(炒)12 g，丹參105 g，豬牙皂1.5 g，鹿角霜7.5 g，鱉甲7.5 g，黃芪9 g，乳香(醋制)7.5 g，沒藥(醋制)7.5 g，獨活 3 g，千年健9 g，陸英9 g，共12味藥。均從湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院一次性購入，先水煎、再水浴濃縮至含止痛健骨方生藥濃度為0.298 g/ml。鹽酸氨基葡萄糖(四川新斯頓制藥有限責任公司，批號:2015150612)。

1.3 兔KOA模型建立和分組 將48只兔隨機分為4組，每組12只：正常對照組、模型對照組、鹽酸氨基葡萄糖治療組、止痛健骨方治療組。其中后3組采用木瓜蛋白酶關節(jié)腔注射法造模[8]，在第1、4、7天，對兔右膝關節(jié)每天注射0.3 ml 1.6%木瓜蛋白酶溶液(Wellbio公司)1次。正常對照組兔右膝關節(jié)注射同劑量生理鹽水。

適應性喂養(yǎng)1周后，于末次膝關節(jié)注射2周后開始接受不同的藥物干預治療，持續(xù)4周。止痛健骨方治療組每天給予止痛健骨方，劑量為每天2.98 g/kg體質量；鹽酸氨基葡萄糖治療組接受鹽酸氨基葡萄糖治療，劑量為每天0.067 2 g/kg體質量(為臨床等效劑量，依據人—兔等效劑量公式折算[9])。采用灌胃給藥，給藥容積為10 ml/kg體質量。正常對照組和模型對照組僅灌以相應容積的蒸餾水。所有動物單籠常規(guī)飼養(yǎng)，自由攝水，保持12 h晝夜輪替及恒溫環(huán)境。

表1 各組關節(jié)軟骨T2值及MMP-1含量比較[中位數(上下四分位數)]

1.4 MR檢查及圖像處理 灌胃治療4周后對各組動物行MR掃描。3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg體質量)經耳緣靜脈注射麻醉動物后，仰臥位固定動物雙膝，采用GE HDxT Signa 3.0T MRI系統、膝關節(jié)線圈，行兔右膝關節(jié)成像。掃描序列及參數：矢狀位和冠狀位脂肪抑制快速自旋回波質子加權序列，TR 1 500 ms，TE 30 ms，FOV 16 cm×16 cm，矩陣256×256，層厚 3 mm，層間隔0 mm；矢狀位多回波自旋回波T2 mapping序列，TR 1 100 ms，TE取9、18、27、36、45、54、63、72 ms，FOV 16 cm×16 cm，矩陣256×256，層厚 3 mm，層間隔0 mm。

采用Functool軟件對圖像進行后處理獲得T2 mapping偽彩圖，依據質子加權像三維定位并參考大體病理確定軟骨病變區(qū)域并放置ROI，ROI大小約為1.3 mm2，測量關節(jié)軟骨T2值，重復測量3次取平均值作為最終結果。

1.5 病理學檢查 采用空氣栓塞法處死動物，取下股骨髁，肉眼觀察確定股骨髁關節(jié)軟骨病變最嚴重區(qū)域并記錄位置供MR評估和病理切片參考。標本經常規(guī)固定、脫鈣、包埋后對軟骨病變最嚴重區(qū)域切片，行MMP-1免疫組化染色(Santa Cruz公司)，陽性區(qū)域為黃色或棕黃色，采過Image Pro Plus軟件計算每高倍視野內陽性細胞的積分光密度(IOD)，并選取6個高倍視野取平均值作為最終結果。

1.6 統計學分析 采用SPSS 20.0統計分析軟件。對連續(xù)變量先行正態(tài)性及方差齊性檢驗，分別用±s或中位數(上下四分位數)表示。非連續(xù)變量以例數、百分數表示。非連續(xù)變量比較采用χ2檢驗。多組間比較采用單因素方差分析或Kruskal-WallisH檢驗，Kruskal-WallisH檢驗中兩兩比較采用調整后的P值，多因素分析采用最優(yōu)尺度回歸[10]。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

各實驗組間動物的性別、體質量差異無統計學意義(χ2=0.667，P=0.881；F=0.275，P=0.843)。

各實驗組間關節(jié)軟骨T2值及MMP-1含量的總體差異有統計學意義(P均<0.001)。模型對照組關節(jié)軟骨T2值高于其他3組(P均<0.01)，正常對照組、鹽酸氨基葡萄糖治療組、止痛健骨方治療組間關節(jié)軟骨T2值差異無統計學意義。鹽酸氨基葡萄糖治療組、止痛健骨方治療組間關節(jié)軟骨MMP-1含量差異無統計學意義，但其關節(jié)軟骨MMP-1含量低于模型對照組(P均<0.05)、高于正常對照組(P<0.05)。見表1、圖1。

對全部實驗參數進行最優(yōu)尺度回歸分析，因變量為關節(jié)軟骨T2值，自變量為實驗分組(干預)情況和MMP-1含量。結果表明回歸模型具有統計學意義 (F=18.815，P<0.01)。該模型決定系數和調整后的決定系數分別為0.734、0.695，提示模型中約70%的部分可被目前的因素解釋，同時可能還有其他因素未納入模型。對所納入因素進行分析，實驗分組(干預)情況、關節(jié)軟骨內MMP-1含量與關節(jié)軟骨T2值有統計學關聯(P<0.05)，其重要程度分別為0.438、0.561，二者和為0.999，提示上述兩因素占目前模型總解釋度的99.9%(表2)。所有自變量的容差均>0.1，說明各因素之間無嚴重共線性，回歸模型可靠(表2)。變量轉換后的量化圖顯示：①模型對照組的軟骨T2值量化分級高于其他3組，且其他3組的T2值量化分級類似(圖2A)；②軟骨MMP-1含量與T2值量化分級為非線性關系，隨MMP-1含量的升高，T2值先緩慢上升再快速上升(圖2B)。

3 討論

關節(jié)軟骨退變與損傷時發(fā)生膠原纖維結構破壞、蛋白多糖丟失及軟骨內自由水含量增加[11]。此外，軟骨退變時MMP-1表達量上調，促進軟骨基質內Ⅱ型膠原降解，可導致軟骨水含量上升[3,12]。MR T2 mapping通過定量測量軟骨橫向弛豫時間(T2值)，可間接反映軟骨中水含量，是一種無創(chuàng)、準確評估軟骨早期退變并監(jiān)測軟骨修復的工具[7,13]。

止痛健骨方具有活血祛瘀、通絡止痛、補肝益腎、強健筋骨的作用，可以改善兔膝關節(jié)骨關節(jié)炎模型的關節(jié)活動度、增加關節(jié)軟骨未鈣化與鈣化厚度的比值、延緩軟骨退變[4]。本研究顯示，兔KOA模型中關節(jié)軟骨內MMP-1含量較正常對照組上升，但止痛健骨方和鹽酸氨基葡萄糖可以降低兔KOA模型關節(jié)軟骨內MMP-1含量，這驗證了KOA中存在由MMP-1過表達導致的軟骨基質降解的現象，與馮小波等[3，14]的研究相符，同時也提示止痛健骨方具有降低退變關節(jié)軟骨內MMP-1表達量的作用。

表2 最優(yōu)尺度回歸模型結果

圖1 各組關節(jié)軟骨MMP-1免疫組化染色、MR T2 mapping偽彩圖 A～D.依次為正常對照組、模型對照組、鹽酸氨基葡萄糖治療組、止痛健骨方治療組的軟骨MMP-1免疫組化染色圖(×400)； E～H.依次為對應組的T2 mapping偽彩圖，其T2值分別為49.50 ms、54.89 ms、48.00 ms、48.50 ms

圖2 量化轉換圖 A.實驗分組(A組：正常對照組；B組：模型對照組；C組：鹽酸氨基葡萄糖治療組；D組：止痛健骨方治療組)； B.軟骨MMP-1含量

本研究的單因素和多因素(最優(yōu)尺度回歸)分析均顯示模型對照組關節(jié)軟骨T2值高于正常對照組、鹽酸氨基葡萄糖治療組、止痛健骨方治療組，且后3組的關節(jié)軟骨T2值無明顯差異。該結果說明用關節(jié)軟骨T2值作為中藥療效的評價指標具有一定的可行性。此外，最優(yōu)尺度回歸還顯示關節(jié)軟骨T2值與MMP-1含量之間呈先緩慢上升后快速上升的非線性關系，這可以解釋單因素分析中各組間關節(jié)軟骨T2值與MMP-1含量分布趨勢存在的差異。隨著KOA進展，關節(jié)軟骨MMP-1表達量逐漸上升，軟骨基質的降解程度加重，其內水含量不斷累積，進而導致關節(jié)軟骨T2值上升，該過程的非線性關系可能來自兩方面：水含量與T2值間的非線性、MMP-1含量與水含量間的非線性。Wei等[15]在其MR T2 mapping成像診斷早期軟骨損傷的研究中雖然采用線性模型得到了可以令人接受的結果，但該研究中軟骨水含量與T2值的散點圖暗示了二者的非線性關系，且與本研究所得結果非常類似，支持了筆者關于該非線性關系來源的第一個推測。而是否存在關節(jié)軟骨MMP-1含量與水含量的非線性關系，還需要進一步研究探討。

本研究的局限性：①在影像和病理上分別采用軟骨T2值和MMP-1含量作為評價標準，雖然一定程度上克服了主觀評級的誤差，但軟骨退變還受其他多種因素影響[16-17]；②止痛健骨方復方中的有效成分本研究并未涉及，需要在今后的研究中進一步探討。

綜上所述，本研究初步證實了采用MR T2 mapping成像評價止痛健骨方治療KOA軟骨損傷療效的可行性，同時發(fā)現KOA關節(jié)軟骨T2值與MMP-1含量呈非線性關系，進一步拓寬了臨床醫(yī)生對KOA影像與病理相對關系的認識，具有一定的社會經濟價值。

[1] 沈思，王昊，張景，等.磁共振T1ρ成像對運動員與普通青年人群髕軟骨對照分析.中國介入影像與治療學,2015,13(6):353-356.

[2] Lotz M, Martel-Pelletier J, Christiansen C, et al. Republished: Value of biomarkers in osteoarthritis: Current status and perspectives. Postgrad Med J, 2014,90(1061):171-178.

[3] 馮小波，朱思剛.獨活寄生湯對髕骨軟化癥髕骨軟骨及膝關節(jié)液中IL-1,MMP-1,GAG的影響.中國實驗方劑學雜志,2015,21(17):156-160.

[4] 蘇新平，朱克儉，譚旭儀.止痛健骨方對兔膝骨關節(jié)炎模型滑膜及軟骨修復的影響.湖南中醫(yī)藥大學學報,2016，36(4):11-14.

[5] 中華醫(yī)學會風濕病學分會.骨關節(jié)炎診斷及治療指南.中華風濕病學雜志,2010,14(6):416-419.

[6] 吳啟富，范永中，葉志中.常見風濕病中西醫(yī)結合診療指南(草案).中藥藥理與臨床,2013，29(6):150-155.

[7] Binks DA, Hodgson RJ, Ries ME, et al. Quantitative parametric MRI of articular cartilage: A review of progress and open challenges. Br J Radiol, 2013,86(1023):20120163.

[8] 唐和斌，李婷婷，楊燕京，等.木瓜蛋白酶誘導骨關節(jié)炎模型中病理指標的動態(tài)變化.中南民族大學學報(自然科學版),2013，32(4):41-45.

[9] 魏偉，吳希美，李元建.藥理實驗方法學. 4版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2010:1698.

[10] 張堃，李曼，裴新龍，等.腰椎MR退變征象與慢性下腰痛關系的最優(yōu)尺度回歸研究.中華放射學雜志,2014,48(12):1019-1023.

[11] 王嬌,查云飛,邢棟,等.3D超短回波序列聯合T2*mapping評價腰椎間盤軟骨終板缺損與椎間盤退變的關系.中國醫(yī)學影像技術,2015,31(10):1470-1474.

[12] 李應池，王曉霞，邱桐，等.川芎嗪對鼠骨關節(jié)炎關節(jié)軟骨MMP-1、TIMP-1表達的影響.中華中醫(yī)藥學刊,2011，29(9):2120-2124.

[13] Kijowski R, Blankenbaker DG, Munoz Del Rio A, et al. Evaluation of the articular cartilage of the knee joint: Value of adding a T2 mapping sequence to a routine MR imaging protocol. Radiology,2013,267(2):503-513.

[14] 龔志賢，范杰，盧敏，等.跌打通痹膏對兔膝骨關節(jié)炎退變關節(jié)軟骨細胞MMP-1、MMP-3表達的影響.世界中西醫(yī)結合雜志,2016,11(9):1233-1237.

[15] Wei B, Mao F, Guo Y, et al. Using 7.0T MRI T2 mapping to detect early changes of the cartilage matrix caused by immobilization in a rabbit model of immobilization-induced osteoarthritis. Magn Reson Imaging, 2015,33(8):1000-1006.

[16] Mariani E, Pulsatelli L, Facchini A. Signaling pathways in cartilage repair. Int J Mol Sci, 2014,15(5):8667-8698.

[17] 王彩云.磁共振關節(jié)軟骨成像新技術——MapIt.磁共振成像,2011,2(2):152-156.

消息

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EvaluationofefficacyofZhitong-JiangurecipesintreatmentofcartilageinjuryinosteoarthritisusingMRT2mapping:Anexperimentalstudy

ZHANGKun1,2,ZHUKejian2,3*,TANXuyi4,HUANGGang4,LIPing1,SHENHongrong1,ZHULu5,MASijing6,ZHUPei6

(1.DepartmentofRadiology,FirstAffiliatedHospitalofHunanUniversityofChineseMedicine,Changsha410007,China; 2.CollegeofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine,HunanUniversityofChineseMedicine,Changsha410208,China; 3.DepartmentofInternalMedicine, 4.DepartmentofOrthopedics, 6.DepartmentofPharmacy,theAffiliatedHospitalofHunanAcademyofTraditionalChineseMedicine,Changsha410006,China; 5.DepartmentofUltrasound,thePeople'sHospitalofHunanProvince,Changsha410005,China)

ObjectiveTo explore the value of MR T2 mapping imaging in evaluation of the effection of Zhitong-Jiangu recipes in treatment of cartilage injury in osteoarthritis.MethodsThe models of osteoarthritis in the knee of New Zealand white rabbits were made with intra-articular injection of papain. Totally 48 New Zealand white rabbits were randomly divided into normal control group, model control group, glucosamine hydrochloride treatment group and Zhitong-Jiangu recipes treatment group. MR T2 mapping was performed on the knee and the content of MMP-1 in articular cartilage was analyzed with immunohistochemistry 4 weeks after treatment. The differences of T2 value and MMP-1 content of articular cartilage among the four groups were compared. The correlation among the different intervention methods, MMP-1 content of articular cartilage and the T2 value of articular cartilage were analyzed.ResultsT2 value of articular cartilage in the model control group was significantly higher than that in the other three groups (allP<0.01), and there was no significant difference of T2 value among the other three groups. The MMP-1 content of articular cartilage in glucosamine hydrochloride treatment group and Zhitong-Jiangu recipes treatment group was lower than that in model control group (bothP<0.05), and was higher than that in normal control group (bothP<0.05). There was no significant difference between the two groups. The relationship between MMP-1 content and T2 value of articular cartilage was nonlinear. With the increase of MMP-1 content, T2 value first increased slowly and then increased rapidly (P<0.05).ConclusionMR T2 mapping imaging is helpful to evaluating the efficacy of Zhitong-Jiangu recipes in treatment of cartilage injury in osteoarthritis in rabbit models. The relationship between MMP-1 content and T2 value of articular cartilage may be nonlinear.

Osteoarthritis; Cartilage; Zhitong-Jiangu recipes; Magnetic resonance imaging; T2 mapping; Matrix metalloprotease 1

國家自然科學基金青年科學基金項目(81603482、81503452)、湖南省自然科學基金資助項目(2016JJ6115)、湖南中醫(yī)藥大學校級青年教師科研基金項目(校行科字[2015]5號)。

張堃(1987—)，男，甘肅金昌人，博士，副主任醫(yī)師。研究方向：醫(yī)學影像在中西醫(yī)結合臨床研究中的價值和影像引導下的介入治療。E-mail： kunzhang0102@163.com

朱克儉，湖南中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合學院，410208；湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院內科，410006。E-mail： 0731zkjo@263.net

2017-08-04

2017-10-12

R681; R445.2

A

1672-8475(2017)11-0694-05

10.13929/j.1672-8475.201708005