高煜，劉家輝，王新，劉東

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斑馬魚遺傳操作進(jìn)展

高煜，劉家輝，王新，劉東

南通大學(xué)教育部江蘇省神經(jīng)再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南通 226001

高煜, 劉家輝, 王新, 等. 斑馬魚遺傳操作進(jìn)展. 生物工程學(xué)報(bào), 2017, 33(10): 1674–1692.Gao Y, Liu JH, Wang X, et al. Genetic manipulation in zebrafish. Chin J Biotech, 2017, 33(10): 1674–1692.

斑馬魚已經(jīng)成為在發(fā)育生物學(xué)與疾病模型研究中應(yīng)用最廣泛的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物之一，其中多種遺傳操作方法和高分辨率活體成像技術(shù)對(duì)斑馬魚的應(yīng)用起了重要推動(dòng)作用。斑馬魚在功能基因組學(xué)研究上有許多優(yōu)勢(shì)，如可以快速便捷地鑒定脊椎動(dòng)物新基因的功能。本文嘗試以示意圖來簡要總結(jié)應(yīng)用于斑馬魚的遺傳操作方法和基本原理，包括ENU化學(xué)誘變篩選的基本原理和隱性突變3代篩選的流程，逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的插入突變的原理及其隱性突變3代篩選的流程，轉(zhuǎn)座子Sleeping Beauty (SB) 和Tol2介導(dǎo)的基因捕獲載體系統(tǒng) (Gene-breaking transposon，GBT) 為基礎(chǔ)的基因捕獲突變的基本原理，Morpholino介導(dǎo)的基因下調(diào)和microRNA下調(diào)技術(shù)，TILLING (Targeting induced local lesions in genomes) 技術(shù)和CEL1分析的基本原理和實(shí)驗(yàn)流程，鋅指核酸酶ZFN(Zinc finger nuclease) 與TALEN (Transcription activator-like effector nuclease)、CRISPR/Cas9定向基因失活的基本原理，斑馬魚上廣泛采用的轉(zhuǎn)基因技術(shù)的幾種類型等。

斑馬魚，遺傳操作，突變，轉(zhuǎn)基因，轉(zhuǎn)座子，基因編輯

在過去的20多年里，斑馬魚已經(jīng)成為最廣泛應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物之一，這主要?dú)w功于在這種硬骨魚上胚胎操作、遺傳操作的可行性以及近年來流行的高分辨率成像技術(shù)。隨著斑馬魚在發(fā)育生物學(xué)與疾病模型等應(yīng)用領(lǐng)域的擴(kuò)展，針對(duì)斑馬魚的遺傳操作方法取得了全新的發(fā)展；起源于其他物種的遺傳操作方法，如誘變篩選也被引入到斑馬魚上。本文嘗試以示意圖的方式簡要總結(jié)應(yīng)用于斑馬魚的遺傳操作方法，對(duì)于這些方法的具體實(shí)驗(yàn)流程并未涉及，如有需求可查閱相關(guān)參考文獻(xiàn)。

1 斑馬魚基因組

斑馬魚的基因組為二倍體，由25對(duì)染色體組成。這些染色體之間區(qū)分困難，其組成DNA大約包含1.4×109個(gè)堿基，大致為人類基因組的一半大小[1-2]。據(jù)估計(jì)，斑馬魚的基因組包含了大約25 000個(gè)已知的編碼基因以及6 000個(gè)非編碼基因[2-4]。真哺乳亞綱 (Eutherian) 中不同物種間的基因組非常相似[5-13]。通過熒光原位雜交和比較減數(shù)分裂圖揭示，在人類、貓、牛、豬和綿羊中整個(gè)染色體臂包含了幾乎完全相同的一套遺傳信息。因此在哺乳動(dòng)物之間，不僅有同源基因 (Orthologous genes) 還有同源染色體(Orthologous chromosomes)。在一對(duì)同源染色體中，基因排列的順序具有可變性，這也提示在基因組中染色體易位 (Chromosomal translocation)比染色體倒位 (Chromosomal inversion) 發(fā)生的頻率更高[14]。哺乳動(dòng)物種間的染色體同源性讓我們能夠根據(jù)一個(gè)物種上基因的位置去預(yù)測另一個(gè)物種同源基因的位置。在進(jìn)化上，小鼠和人類的最后一個(gè)共同的祖先大約在1億年前，而斑馬魚和人類最后一個(gè)共同祖先大約在4億2千萬年前。我們能否用哺乳動(dòng)物的基因位置來預(yù)測斑馬魚的基因位置，或反之？比較基因組學(xué)分析顯示，斑馬魚與哺乳動(dòng)物基因組之間的共線性 (Synteny) 高度保守，而且斑馬魚基因組與人類基因組之間的共線性比小鼠與人類基因組之間的共線性更強(qiáng)[15]，可能是因?yàn)橄啾绕渌恍┎溉閯?dòng)物，小鼠的基因組呈現(xiàn)出了大量的重排。斑馬魚和其他硬骨魚的基因組分析揭示，在硬骨魚的物種大發(fā)生之前，在大量基因丟失之后，斑馬魚基因組經(jīng)歷了一次復(fù)制，導(dǎo)致與其他哺乳動(dòng)物的同源基因相比，斑馬魚中大約30%的基因有兩個(gè)拷貝，許多人類染色體的片段在斑馬魚中也有兩個(gè)拷貝，這種現(xiàn)象在基因組的組裝和基因功能研究中也得到了印證[16]。在基因組中一個(gè)基因有兩個(gè)位點(diǎn)，針對(duì)研究的具體問題來說既可以是優(yōu)點(diǎn)也可以是缺點(diǎn)。對(duì)于大多數(shù)已經(jīng)研究的重復(fù)基因來說，其表達(dá)調(diào)控區(qū)域是差異最大的部分。一般觀點(diǎn)認(rèn)為這些重復(fù)的基因在功能上是相似的，但它們的時(shí)空表達(dá)是特異的。這在正向遺傳學(xué)研究中可以被認(rèn)為是優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)閱蝹€(gè)基因的突變會(huì)產(chǎn)生比較特異的表型；但是，如果這對(duì)重復(fù)基因時(shí)空表達(dá)相同或者很相似，就會(huì)造成功能的冗余和補(bǔ)償。當(dāng)一個(gè)基因位點(diǎn)的突變被另一個(gè)拷貝所補(bǔ)償，就會(huì)減弱或消除相應(yīng)的表型，這將增加表型分析的難度。近年來，基于斑馬魚基因組特點(diǎn)，大量遺傳學(xué)操作策略得以實(shí)現(xiàn)，包括正向遺傳學(xué)、反向遺傳學(xué)、轉(zhuǎn)基因技術(shù)、光遺傳學(xué)等[17-22]。

2 正向遺傳學(xué)

傳統(tǒng)的遺傳學(xué)策略大致可分為兩類：正向遺傳學(xué) (Forward genetics) 和反向遺傳學(xué) (Reverse genetics)。正向遺傳學(xué)是指通過生物個(gè)體或細(xì)胞的基因組的自發(fā)突變或人工誘變，尋找相關(guān)表型或性狀的改變，然后從這些特定性狀變化的個(gè)體或細(xì)胞中找到對(duì)應(yīng)的突變基因，并揭示其功能[18]，包括ENU誘變[23]、插入突變[24]等技術(shù)。

2.1 ENU誘變

突變篩選在早期對(duì)推動(dòng)斑馬魚作為模式生物起了重要的作用，其中主要以乙基亞硝基脲 (Ethylnitrosourea，ENU) 誘發(fā)突變，其突變率高，從20世紀(jì)90年代中期一直延續(xù)到現(xiàn)在[25-26]。多數(shù)發(fā)育異常的表型篩選需要通過幾代的交配來得到純合的隱性突變，顯性突變個(gè)體在F1代就可以獲得，其表型不能是胚胎致死，否則不能遺傳到下一代。最早期的斑馬魚ENU大規(guī)模誘變篩選開始于兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室，一個(gè)是位于Tübingen的Christiane Nüsslein-Volhard實(shí)驗(yàn)室，另一個(gè)是位于Boston/Freiburg的Wolfgang Driever實(shí)驗(yàn)室，他們通過顯微鏡觀察，篩選了大量的異常胚胎表型，其中F3代出現(xiàn)了純合的隱性突變體，其研究結(jié)果發(fā)表于1996年Development[25,27-28]。突變篩選流程簡要描述如圖1所示。ENU處理的雄性斑馬魚和野生型雌魚側(cè)交 (Out-cross)，產(chǎn)生大量的F1代個(gè)體，培養(yǎng)至成魚，通過剪尾鰭的方法進(jìn)行基因型鑒定，篩選突變體。篩選出的F1代可以通過不同的雜交方式產(chǎn)生F2代雜合突變攜帶者，例如F1代可以在品系內(nèi)異性自交 (In-cross)，增加F2代中突變基因組的數(shù)目；也可以用F1代品系與含有遺傳多態(tài)性標(biāo)志的完全不同的野生型品系進(jìn)行側(cè)交，F(xiàn)2代繁殖的后代進(jìn)行接下來F3代的連鎖分析 (Linkage analysis)。F2代個(gè)體之間自交將產(chǎn)生許多可以鑒別的胚胎表型，Tübingen和Boston兩個(gè)研究組得到了超過6 000個(gè)突變表型，其中大約1/3與細(xì)胞分化、器官發(fā)生等有關(guān)[27-28]，其余的大部分與發(fā)育延遲 (Developmental delay or growth retardation) 和壞死 (Necrosis) 相關(guān)[29]，對(duì)一些特異性表型進(jìn)行分析鑒定，發(fā)現(xiàn)了大約600個(gè)不連續(xù)的位點(diǎn)與原腸胚形成、胚胎圖式發(fā)生以及器官發(fā)生有關(guān)[30-31]。

圖1 經(jīng)典的ENU三代隱性突變篩選

2.2 插入突變

2.2.1 逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的插入突變

插入突變可以利用外源DNA作為誘變劑，而插入的DNA片段可以作為分子標(biāo)簽來鑒定突變基因。插入突變的方法在突變發(fā)生技術(shù)中有豐富的歷史，可以使用多種不同的載體和方法[24]。插入突變的一個(gè)關(guān)鍵問題是突變產(chǎn)生的機(jī)制。在大多數(shù)脊椎動(dòng)物基因組中外顯子一般占1%–2%左右[32]，插入基因組的片段要求對(duì)基因以及基因表達(dá)的產(chǎn)物沒有任何影響，或者影響很少。無論選擇何種載體，DNA隨機(jī)插入基因組破壞外顯子的幾率都不高。突變插入可能有多種原因，例如插入序列提前引入了終止密碼子，翻譯提前終止，或者表現(xiàn)在RNA水平導(dǎo)致RNA降解[24,33]。在ENU大規(guī)模誘變篩選過后不久，MIT的Nancy H Hopkins在斑馬魚上啟動(dòng)了逆轉(zhuǎn)錄病毒突變篩選，此方法的基本原理是通過DNA片段的隨機(jī)插入，破壞基因的正常表達(dá) (圖2)[34-35]。這種篩選的優(yōu)點(diǎn)是導(dǎo)致表型產(chǎn)生的突變基因可以通過PCR來鑒定，比較容易；缺點(diǎn)是這種大片段DNA插入突變的效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于ENU誘導(dǎo)的點(diǎn)突變。插入突變篩選的流程與ENU誘變的流程相似，其篩選流程總結(jié)如下 (圖3)。在斑馬魚胚胎1-2細(xì)胞發(fā)育階段，顯微注射外源DNA作為突變劑建立F0代，通過F0代之間的交配，得到用來篩選的F1代[36-37]。從F1代中預(yù)篩選出插入拷貝數(shù)比較多的，來提高下一代突變的頻率。接下來的篩選類似于ENU誘變，但這種篩選與ENU誘變相比需要更大的工作量。

圖2 逆轉(zhuǎn)錄病毒插入突變的原理

2.2.2 轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的基因捕獲突變

基因捕獲突變 (Gene-trap mutagenesis)，即通過隨機(jī)插入報(bào)告基因到基因組中來研究基因的功能和表達(dá)。這種方法在應(yīng)用于斑馬魚之前，已經(jīng)成功地在小鼠上實(shí)現(xiàn)捕獲調(diào)控發(fā)育的相關(guān)基因、增強(qiáng)子和啟動(dòng)子[38-41]。脊椎動(dòng)物中Sleeping Beauty (SB) 和Tol2轉(zhuǎn)座子的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用提高了外源DNA整合到基因組的效率[42-43]。在轉(zhuǎn)座酶 (Transposase) 存在的情況下，SB和Tol2載體可以通過“剪切”和“粘貼”機(jī)制整合到基因組中 (圖4)[44]。一般情況下認(rèn)為，SB和Tol2插入基因組是隨機(jī)的方式，但是據(jù)一些報(bào)道稱SB總是插入TA位點(diǎn)，而Tol2沒有固定的偏愛的插入位點(diǎn)[45]。目前，SB和Tol2轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的基因捕獲突變方法在斑馬魚上得到較好的應(yīng)用和發(fā)展[46-50]。應(yīng)用于斑馬魚的基因捕獲載體 (Gene-breaking transposon，GBT) 系統(tǒng)至少包含一個(gè)5′端的突變區(qū)和3′端的報(bào)告基因區(qū)[50]，如圖5所示。以GBT為基礎(chǔ)的載體應(yīng)用在基因捕獲突變中，已經(jīng)成功地產(chǎn)生了一些隱性突變體，如Tnnt2的突變體，其純合子斑馬魚胚胎心臟停跳；此外也捕獲了一系列基因的表達(dá)譜，例如特異表達(dá)于大腦、肌肉纖維和心臟等[51]。

圖3 逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的插入突變篩選流程

圖4 轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的外源DNA片段插入的兩種方式

3 反向遺傳學(xué)

反向遺傳學(xué)是相對(duì)于正向遺傳學(xué)而言的，在已知DNA序列的基礎(chǔ)上，通過DNA重組、定點(diǎn)突變、插入/缺失等[52-54]遺傳學(xué)手段構(gòu)建突變體并研究突變?cè)斐傻谋硇?，從而研究基因的生物學(xué)功能，闡釋生命現(xiàn)象和規(guī)律[19]。

3.1 Morpholino介導(dǎo)的基因下調(diào)和microRNA下調(diào)

目前，RNAi在斑馬魚上的應(yīng)用有待進(jìn)一步研究[55]。2011年在非洲蟾蜍 (Xenopus) 上的研究發(fā)現(xiàn)限制Ago2蛋白活性，能夠抑制RNAi和miRNA生物合成，暗示RNAi在斑馬魚上應(yīng)用的可能性[56]，盡管還沒有其他研究報(bào)道佐證。另一種嗎啉環(huán)修飾的反義寡核苷酸 (Morpholino，MO) 介導(dǎo)的基因下調(diào)方法在非洲蟾蜍 (Xenopus) 和斑馬魚上得到了很好的應(yīng)用。MO的骨架中嗎啉環(huán)取代了核苷酸中的脫氧核糖[57-58]，MO下調(diào)基因表達(dá)通常有兩種途徑：一種是通過與編碼區(qū)前25個(gè)堿基的5′上游互補(bǔ)配對(duì)來抑制翻譯，另一種是在細(xì)胞核內(nèi)通過與剪切連接點(diǎn) (Splice junctions) 或者剪切調(diào)控位點(diǎn) (Splice regulatory site) 互補(bǔ)配對(duì)來阻止mRNA前體 (Pre-mRNA) 的正確剪切，可以造成外顯子丟失、內(nèi)含子或內(nèi)含子的一部分保留在剪切產(chǎn)物中 (圖6)、移碼突變或mRNA的降解[59-60]等。MO下調(diào)基因的效率可以通過檢測蛋白的表達(dá)水平來驗(yàn)證，對(duì)于修飾mRNA前體剪切的方式也可以通過RT-PCR來驗(yàn)證[60](圖6)。除此之外，MO還可以用來抑制microRNA (miRNA) 的生物合成及其功能[61-62]。MO既可以和miRNA的前體通過堿基互補(bǔ)配對(duì)在Dicer或者Drosha的剪切位點(diǎn)形成雜合雙鏈，阻止miRNA前體的剪切 (圖7)；也可以與miRNA和mRNA作用的靶位點(diǎn)通過堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，阻止miRNA對(duì)其靶分子的調(diào)控[63](圖7)。但是，MO的應(yīng)用也有許多的局限性，下調(diào)基因表達(dá)的方式不是通過穩(wěn)定的遺傳操作，所以其效率很不穩(wěn)定，而且維持時(shí)間也較短。通過顯微注射到斑馬魚胚胎中的MO，一般認(rèn)為只能維持3 d左右[64-65]。通過MO產(chǎn)生的斑馬魚的表型有許多是由于其脫靶效應(yīng)造成的，MO的顯微注射也會(huì)在很多情況下導(dǎo)致一些組織的細(xì)胞凋亡，實(shí)驗(yàn)中可以通過共注射p53的MO來抑制這種副作用[66]。

圖5 轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的基因捕獲突變

圖6 Morpholino介導(dǎo)的基因下調(diào)通過兩種途徑

圖7 Morpholino抑制microRNA的生物合成及其功能

3.2 DNA/RNA顯微注射

研究基因功能的另一個(gè)常見方法就是直接顯微注射此基因的mRNA或DNA到單細(xì)胞階段的受精卵中，待發(fā)育到一定階段后分析其表型。所注射的mRNA和DNA可以編碼基因的全長、部分功能結(jié)構(gòu)域或者顯性負(fù)性突變體等。用DNA作為模板體外轉(zhuǎn)錄mRNA，注射到1-2細(xì)胞階段的胚胎中可以高效、均一地表達(dá)目的蛋白。在許多情況下為了方便檢測表達(dá)水平，常常將目的基因與報(bào)告基因組成融合蛋白，如與綠色熒光蛋白 (GFP) 組成融合蛋白。注射的mRNA一般在受精后4–5 h開始表達(dá)，2–4 d后開始降解，因此可以用來研究胚胎發(fā)育的早期階段。DNA最好在單細(xì)胞階段注射到胚胎細(xì)胞中，與mRNA注射不同，DNA注射通常產(chǎn)生嵌合表達(dá)。在Tol2轉(zhuǎn)座系統(tǒng)存在的情況下可以提高DNA整合及表達(dá)效率[45]。

3.3 TILLING

無論是Morpholino還是mRNA顯微注射都無法遺傳給下一代，為了產(chǎn)生可遺傳的突變，建立了一種TILLING (Targeting induced local lesions in genomes) 的反向遺傳學(xué)技術(shù)[67-68]。這種方法利用CEL1分析來檢測ENU誘導(dǎo)突變產(chǎn)生的F1個(gè)體DNA中的雜合隨機(jī)突變 (圖8A)。CEL1內(nèi)切酶能夠特異性剪切在野生型和突變型雜交DNA雙鏈中單個(gè)堿基錯(cuò)配的3′端[69]。從突變體中提取基因組DNA作為PCR的模板來擴(kuò)增特異的基因，野生型的DNA和突變的DNA都會(huì)從雜合子基因組中復(fù)制出來。PCR產(chǎn)物片段通過變性和緩慢退火形成雜交的雙鏈。通過CEL1內(nèi)切酶的消化，DNA片段可以在測序膠上分開，從而確定突變的位點(diǎn) (圖8A)，其篩選流程如下 (圖8B)。在ENU誘變的F1代中得到精子并凍存，通過CEL1分析鑒定突變的基因，然后可以從精子恢復(fù)所需的相應(yīng)突變體。在TILLING技術(shù)的發(fā)展過程中，多個(gè)實(shí)驗(yàn)室起到了重要的推動(dòng)作用。Hubrecht Institute 建立了4 608個(gè)ENU誘導(dǎo)突變的F1代文庫，應(yīng)用TILLING技術(shù)已經(jīng)成功篩選到了16個(gè)突變基因[70]；Moens實(shí)驗(yàn)室報(bào)道了運(yùn)用TILLING技術(shù)大規(guī)模篩選斑馬魚ENU誘變產(chǎn)生的點(diǎn)突變[23]；Sanger研究所也主持了一項(xiàng)基于TILLING技術(shù)的斑馬魚突變篩選計(jì)劃 (Zebrafish mutation project，ZMP)，通過大規(guī)模ENU誘變的方法獲得大量突變位點(diǎn)，構(gòu)成一個(gè)突變位點(diǎn)庫，然后根據(jù)需要選擇特定的基因，通過測序的方法尋找該基因的突變并進(jìn)行表型檢測[71]。在運(yùn)用TILLING技術(shù)時(shí)，可能會(huì)出現(xiàn)多位點(diǎn)的突變，后代的表型鑒定比較繁瑣。目前，TILLING技術(shù)運(yùn)用較少。

圖8 CEL1分析和TILLING實(shí)驗(yàn)流程

3.4 ZFN/TALEN定向基因失活

在小鼠的胚胎干細(xì)胞 (Embryonic stem cell，ESC) 上建立的基因打靶策略 (Gene targeting strategy) 是通過DNA同源重組實(shí)現(xiàn)基因的特異性敲除[72-73]。在斑馬魚上已經(jīng)成功建立了ES樣的細(xì)胞，并且這些細(xì)胞可以貢獻(xiàn)到生殖細(xì)胞系中并傳至下一代[74]，但是這種基因打靶策略并沒有成功地應(yīng)用到斑馬魚上產(chǎn)生基因敲除斑馬魚?，F(xiàn)在兩種定向基因失活技術(shù)ZFN和TALEN都已經(jīng)成功地應(yīng)用到斑馬魚上[75-79]。鋅指核酸酶(Zinc finger nuclease，ZFN)是一種人工改造合成的核酸內(nèi)切酶，由一個(gè)DNA識(shí)別結(jié)構(gòu)域 (ZF) 和一個(gè)非特異性核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域 (Fok1) 組成，其中DNA識(shí)別結(jié)構(gòu)域能夠識(shí)別并結(jié)合特異的DNA序列，非特異性核酸內(nèi)切酶具有DNA剪切的功能。通過兩個(gè)功能結(jié)構(gòu)域的組合就可以在DNA序列的特定靶位點(diǎn)產(chǎn)生雙鏈斷裂(Double strand break，DSB)[80-81]。雙鏈斷裂通過非同源末端連接 (Nonhomologous end-joining，NHEJ) 和同源重組修復(fù) (Homologous recombination repair，HRR)，從而引入小的基因片段，其中非同源末端連接通過隨機(jī)的刪減或添加堿基可以引起移碼突變[82]。ZFN的DNA識(shí)別結(jié)構(gòu)域是由一連串的Cys2-His2鋅指蛋白單位組成，每個(gè)鋅指蛋白單位能夠特異地識(shí)別和結(jié)合3′到5′方向DNA單鏈上3個(gè)連續(xù)的堿基組合 (圖9) 和5′到3′方向的1個(gè)堿基[83]。當(dāng)識(shí)別DNA雙鏈的一對(duì)ZFN的識(shí)別位點(diǎn)相距在6到8個(gè)堿基之間時(shí) (圖9)，兩個(gè)ZFN上的核酸內(nèi)切酶 (FokI) 結(jié)構(gòu)域形成異二聚體[84]產(chǎn)生核酸酶切功能，達(dá)到DNA定向剪切的效果。除了ZFN之外，轉(zhuǎn)錄激活因子樣核酸酶 (Transcription activator-like effector nuclease，TALEN) 也是一種近來被應(yīng)用到許多物種的位點(diǎn)特異性的核酸酶[85]。TALEN的組成結(jié)構(gòu)也和ZFN類似，包括非特異性核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域FokI和DNA識(shí)別結(jié)構(gòu)域TALEN[86]，TALEN的DNA識(shí)別結(jié)構(gòu)域TALEN來自于植物的致病菌黃單胞菌[87]，ZFN的每一模塊能夠識(shí)別3個(gè)連續(xù)堿基，而TALEN每個(gè)模塊識(shí)別1個(gè)堿基 (圖9)。在斑馬魚上，ZFN和TALEN通過體外轉(zhuǎn)錄得到的mRNA后注射到單細(xì)胞階段的受精卵中，篩選并獲得靶基因失活的突變體。2011年，北京大學(xué)張博教授首次利用TALEN技術(shù)在斑馬魚中成功實(shí)現(xiàn)可穩(wěn)定遺傳的基因組定點(diǎn)突變[77]；2013年又在此基礎(chǔ)上，利用TALEN造成的DNA雙鏈斷裂，大大提高了同源重組效率，從而在模式生物斑馬魚中實(shí)現(xiàn)了真正意義上的同源重組基因打靶[88]。雖然ZFN和TALEN技術(shù)均能用于基因定向失活，應(yīng)用范圍有一定的重合，但是這兩種技術(shù)有各自不同的缺陷。ZFN技術(shù)脫靶效率高，設(shè)計(jì)依賴上下游序列；TALEN技術(shù)模塊組裝過程繁瑣、需要大量測序工作、成本高。目前，ZFN和TALEN技術(shù)有被CRISPR/Cas9系統(tǒng)取代的趨勢(shì)。

圖9 TALEN和ZFN的工作示意圖

3.5 CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9是繼ZFN和TALEN之后的第3代RNA介導(dǎo)的定向基因編輯技術(shù)，來源于細(xì)菌和古細(xì)菌的獲得性免疫系統(tǒng)[89-91]。具體的原理是：crRNA (CRISPR-derived RNA) 與tracrRNA (Trans-activating RNA) 結(jié)合形成tracrRNA/crRNA復(fù)合物，引導(dǎo)核酸酶Cas9在與crRNA配對(duì)的序列靶位點(diǎn)處剪切雙鏈DNA，形成DSB，通過NHEJ修復(fù)機(jī)制產(chǎn)生基因序列的缺失或者增加 (圖10)。為了簡化操作過程，通過人工設(shè)計(jì)、改造這兩種RNA，形成具有導(dǎo)向作用的sgRNA (Single guide RNA)，引導(dǎo)Cas9對(duì)DNA的定點(diǎn)切割，剪切位點(diǎn)位于sgRNA互補(bǔ)序列下游PAM區(qū) (Protospacer adjacent motif, PAM) 附近，以NGG形式存在(N為任意堿基)[92]。sgRNA設(shè)計(jì)簡單，長度為20個(gè)堿基，并且在3′端下游緊鄰NGG序列。在2013年1月，張峰率領(lǐng)的研究小組首次證實(shí)CRISPR/Cas9系統(tǒng)能夠在真核細(xì)胞中發(fā)揮基因編輯作用[93]。在斑馬魚中，CRISPR/Cas9已被證明可產(chǎn)生基因敲除，Joung實(shí)驗(yàn)室首次利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在斑馬魚中實(shí)現(xiàn)基因組編輯，他們將特異的sgRNA和Cas9 mRNA共同注射至斑馬魚1細(xì)胞期受精卵中，在特定基因位點(diǎn)處檢測到堿基缺失和插入的突變[94-95]。同時(shí)北京大學(xué)熊敬維實(shí)驗(yàn)室也報(bào)道了CRISPR/Cas9系統(tǒng)在斑馬魚中進(jìn)行特定基因敲除(Knockout，KO) 的方法，敲除血管發(fā)育相關(guān)基因，發(fā)現(xiàn)突變體血管發(fā)育異常，與已有的化學(xué)誘變產(chǎn)生的突變體表型一致[96-97]。如果在CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基礎(chǔ)上引入一個(gè)修復(fù)的模板質(zhì)粒，這樣能夠按照提供的模板在修復(fù)過程中引入片段插入，實(shí)現(xiàn)基因的敲入。中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院神經(jīng)科學(xué)研究所杜久林課題組利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)開發(fā)出了一種以內(nèi)含子為基礎(chǔ)的基因敲入(Knockin，KI) 方法，將改造的綠色熒光蛋白EGFP的DNA序列插入到斑馬魚() 基因的外顯子內(nèi)，標(biāo)記內(nèi)源性蛋白[98-99]。CRISPR/Cas9系統(tǒng)設(shè)計(jì)簡單、成本低廉、制備簡便、快捷高效等優(yōu)點(diǎn)，使其在基因編輯領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。

圖10 CRISPR/Cas9工作示意圖

3.6 NgAgo-gDNA

河北科技大學(xué)韓春雨實(shí)驗(yàn)室報(bào)道了一種新的DNA介導(dǎo)的基因編輯系統(tǒng)NgAgo-gDNA (Natronobacterium gregoryi Argonaute，NgAgo)，由核酸內(nèi)切酶NgAgo和具有導(dǎo)向作用的特異性5′-磷酸化的單鏈DNA (Single-stranded guide DNA，gDNA) 組成，NgAgo結(jié)合單鏈gDNA，并導(dǎo)致靶DNA發(fā)生雙鏈斷裂[100]。目前NgAgo-gDNA系統(tǒng)存在一些爭議，機(jī)理還有待于進(jìn)一步研究[101-102]。我們利用NgAgo-gDNA在斑馬魚中實(shí)現(xiàn)了基因敲低 (Knock down，KD)，針對(duì)斑馬魚基因，設(shè)計(jì)靶向的第2和第3個(gè)外顯子5′-磷酸化單鏈DNA，與NgAgo mRNA共同注射至斑馬魚一細(xì)胞期受精卵中，檢測到fabp11a mRNA表達(dá)水平下降[103]。韓國國立首爾大學(xué)Jin-Soo Kim課題組在BioRxiv上發(fā)表了他們的研究，通過體外生化實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)NgAgo具有DNA依賴的RNA酶活性，并且他們還發(fā)現(xiàn)其與NgAgo結(jié)合的DNA (Guide oligodeoxyribonucleotides，gODNs) 序列必須與RNA反向互補(bǔ)，而正義DNA (Sense DNA) 序列則不能引導(dǎo)NgAgo切割靶RNA。

4 轉(zhuǎn)基因

以顯微注射為基礎(chǔ)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)是利用斑馬魚為模式生物研究的有力工具。在轉(zhuǎn)基因生物中，外源基因被整合到宿主基因組中，在子代穩(wěn)定遺傳。目前有多種方法可以獲得轉(zhuǎn)基因斑馬魚，其中一種方法就是向斑馬魚受精卵中注入外源DNA，培養(yǎng)至成魚，然后從中篩選出整合了外源基因的轉(zhuǎn)基因品系。這種方法效率不高，但是因?yàn)轱@微注射和表型篩選容易，以前常被采用。一般來說，顯微注射外源性DNA的斑馬魚中大約5%有外源基因整合，這些嵌合體中又有約5%的可以將外源基因傳到下一代。這個(gè)概率取決于許多因素，包括外源性表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)、DNA注入量以及操作者的技能。轉(zhuǎn)基因斑馬魚遵循孟德爾遺傳規(guī)律。表型篩選可以利用熒光蛋白 (例如GFP) 的表達(dá)來鑒定，也可能需要PCR來鑒定。通過簡單的DNA注射方法實(shí)現(xiàn)的轉(zhuǎn)基因通常含有多個(gè)目的基因的串聯(lián)拷貝。多拷貝轉(zhuǎn)基因可以提高目的基因表達(dá)效率，但有時(shí)根據(jù)目的也需要單拷貝插入。近年來發(fā)展出的轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)Tol2[45]和Sleeping Beauty[46]，可以實(shí)現(xiàn)單拷貝插入，相比簡單的顯微注射效率提高很多。提高目的基因拷貝插入效率也可以使用核酸酶Ⅰ-SceⅠ[104]來實(shí)現(xiàn)，其基本原理如圖11所示。

利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究基因功能的一個(gè)常見問題就是轉(zhuǎn)基因可能引起的顯性致死，無法建立穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因品系。解決這個(gè)問題的方法有多種，包括基因誘導(dǎo)表達(dá)和雙組分系統(tǒng) (Binary systems)，即通過兩個(gè)轉(zhuǎn)基因品系的交配來實(shí)現(xiàn)目的基因的表達(dá) (圖12C、D)?；蛘T導(dǎo)表達(dá)體系通常含有一個(gè)在正常情況下處于沉默狀態(tài)的轉(zhuǎn)基因，當(dāng)在一些外部因素刺激下這個(gè)基因才啟動(dòng)表達(dá)。例如，28.5 ℃時(shí)斑馬魚熱休克蛋白HSP70的啟動(dòng)子在所有組織中 (除了晶狀體之外) 有很低的活性[105-106]，Hsp70的表達(dá)可以被高溫激活，即37 ℃熱處理胚胎1 h可激活Hsp70活性。通過使用聚焦激光局部加熱的方法也可以誘導(dǎo)Hsp70在局部表達(dá)[107]。另外使用糖皮質(zhì)類固醇也可以實(shí)現(xiàn)斑馬魚轉(zhuǎn)基因的誘導(dǎo)表達(dá)[108]。雙組分系統(tǒng)利用兩個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因品系的交配來調(diào)控基因表達(dá)。在GAL4/UAS系統(tǒng)中，轉(zhuǎn)基因斑馬魚在組織特異性啟動(dòng)子調(diào)控下表達(dá)酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4，另一個(gè)外源基因由含有UAS序列的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，它在沒有外在因素刺激下是沉默的，而當(dāng)GAL4識(shí)別UAS序列時(shí)，啟動(dòng)外源基因表達(dá)。GAL4/UAS系統(tǒng)的建立可以方便地實(shí)現(xiàn)多種遺傳操作[109](圖12C)。另一個(gè)雙組分系統(tǒng)由位點(diǎn)特異性重組酶Cre和其識(shí)別序列l(wèi)oxP組成。如圖12D所示，Cre重組酶作用之前表達(dá)一個(gè)基因 (目標(biāo)基因cDNA1)，Cre重組酶作用之后調(diào)控表達(dá)另一個(gè)基因 (目標(biāo)基因cDNA2)，這種轉(zhuǎn)變通過Cre重組酶和loxP序列相互作用所調(diào)控[110]，現(xiàn)在基因誘導(dǎo)表達(dá)和雙組分系統(tǒng)可以組合起來應(yīng)用圖12E。除此之外基因誘導(dǎo)表達(dá)和雙組分系統(tǒng)還有一些其他類型，其原理各不相同，但是最終可以實(shí)現(xiàn)相似的目的，在此不作一一介紹。

圖11 用Ⅰ-SceⅠ來產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因斑馬魚

圖12 轉(zhuǎn)基因表達(dá)系統(tǒng)

目前常用于生命科學(xué)研究的模式生物有酵母、線蟲、果蠅、斑馬魚、小鼠等，相關(guān)遺傳操作技術(shù)發(fā)展迅速，各有優(yōu)勢(shì)。例如，模式生物秀麗隱桿線蟲是多細(xì)胞無脊椎動(dòng)物，在自然狀態(tài)下具有雄性和雌雄同體這兩種性別特征，在遺傳研究上具有無可比擬的優(yōu)勢(shì)，突變體篩選效率高[20]；小鼠屬于哺乳動(dòng)物，生理和發(fā)育過程與人類相似，基因組與人類高度同源，能夠在ES細(xì)胞上進(jìn)行遺傳操作，利用同源重組構(gòu)建基因敲除系[111-112]。

近年來，斑馬魚作為一種重要的模式生物，也被廣泛地運(yùn)用于生命科學(xué)研究，其易于在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)繁育，一般每周可以產(chǎn)卵一次，每次有100–300枚，遺傳學(xué)操作和篩選十分方便。這些遺傳操作方法在斑馬魚上的單一使用以及組合使用大大增強(qiáng)了斑馬魚作為模式生物的優(yōu)勢(shì)。同時(shí)，一些新技術(shù)的出現(xiàn)必將進(jìn)一步推動(dòng)其在發(fā)育生物學(xué)與疾病模型上的應(yīng)用，例如光遺傳學(xué) (Optogenetics)。光遺傳學(xué)將重組DNA技術(shù)與光學(xué)技術(shù)結(jié)合起來，成為細(xì)胞生物學(xué)研究的有力工具，用于活細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)蛋白質(zhì)的跟蹤以及選擇性地控制某類細(xì)胞特定的生物學(xué)活動(dòng)[113]。斑馬魚作為胚胎通體透明的模式動(dòng)物則更是理想的運(yùn)用光遺傳學(xué)開展研究的對(duì)象[114]，2010年Didier YR Stainier 實(shí)驗(yàn)室成功實(shí)現(xiàn)了利用光來控制心臟的功能[115]。斑馬魚模型上豐富的遺傳操作策略將越來越幫助我們認(rèn)識(shí)生命過程、揭示生命的奧秘。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

Genetic manipulation in zebrafish

Yu Gao, Jiahui Liu, Xin Wang, and Dong Liu

MOE Jiangsu Key Laboratory of Neuroregeneration, Nantong University, Nantong 226001, Jiangsu, China

The increasing number of genetic manipulation approaches and high-resolution live imaging technique applied in zebrafish have propelled the rise of this organism as a mainstream model for developmental biology and human diseases studies. Zebrafish has many advantages for functional genomics analysis, allowing for easy, cheap and fast functional characterization of novel genes in the vertebrate genome. Here we provide an overview of the principles of genetic manipulation in zebrafish, such as Ethylnitrosourea (ENU) mutagenesis, insertional mutagenesis, gene trapping mutagenesis, Morpholino mediated gene knockdown, targeting induced local lesions in genomes (TILLING), genome editing with engineered nucleases ZFN (Zinc finger nuclease), TALEN (Transcription activator-like effector nuclease) and CRISPR/Cas9 system, and transgenic methods used in zebrafish.

zebrafish, genetic manipulation, mutation, transgenic, transposon, gene editing

May 5, 2017;

August 31, 2017

Dong Liu. Tel: +86-513-85051593; Fax: +86-513-85511585; E-mail: liudongtom@gmail.com

Supported by:Postgraduate Research Notation Project of Jiangsu Province Ordinary University (No. KYLX16-0964).

2017-09-06

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20170906.1058.003.html

江蘇省普通高校學(xué)術(shù)學(xué)位研究生科研創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目 (No. KYLX16-0964) 資助。

劉東 博士。于2011年獲德國馬克斯-德爾布呂克分子醫(yī)學(xué)中心(Max-Delbrück Center for Molecular Medicine)/柏林自由大學(xué) (Free University of Berlin)自然科學(xué)博士學(xué)位。從2012年8月起任南通大學(xué)神經(jīng)再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室副教授?，F(xiàn)為中國解剖學(xué)會(huì)再生醫(yī)學(xué)專業(yè)委員會(huì)委員，江蘇省發(fā)育與細(xì)胞學(xué)會(huì)理事，江蘇省神經(jīng)科學(xué)會(huì)理事。主要研究方向?yàn)椋?) 鑒定參與血管新生以及神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中的全新的調(diào)控分子。2) 組織再生過程中血管化的過程及調(diào)控機(jī)制。3) 利用多種遺傳操作技術(shù)建立轉(zhuǎn)基因和基因敲除斑馬魚模型，以及研發(fā)用于斑馬魚模型的遺傳操作方法。4) 篩選調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元行為的天然化合物。