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(山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山西太原 030006)

高速逆流色譜法分離制備金銀木葉中蘆丁

李晨,寧麗娜

(山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山西太原 030006)

應(yīng)用高速逆流色譜法分離制備金銀木葉中的蘆丁,經(jīng)過(guò)選擇優(yōu)化,確定以乙酸乙酯-正丁醇-水(5∶2∶5,v∶v)為兩相溶劑系統(tǒng),以上相為固定相,下相為流動(dòng)相,在主機(jī)轉(zhuǎn)速800 r/min,流速2 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)256 nm條件下進(jìn)行分離制備,得到4個(gè)分離組分。對(duì)所得分離產(chǎn)物進(jìn)行高效液相檢測(cè),發(fā)現(xiàn)組分II為蘆丁,其純度達(dá)到96%以上,得率為10.7%。本實(shí)驗(yàn)從金銀木葉中分離制備蘆丁,方法簡(jiǎn)便,所得產(chǎn)物純度高,為進(jìn)一步擴(kuò)大金銀木的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

金銀木葉,蘆丁,高速逆流色譜

金銀木(LoniceramaackiiMaxim)是忍冬科忍冬屬的落葉灌木,具有優(yōu)良的觀花、觀果價(jià)值,在我國(guó)種植十分廣泛。目前,人們已從忍冬屬植物中發(fā)現(xiàn)多種化學(xué)成分,如黃酮類(lèi)、有機(jī)酸及三萜類(lèi)等[1]。忍冬屬一些植物的花如金銀花具有營(yíng)養(yǎng)保健作用,果實(shí)含有必需微量元素及不飽和脂肪酸等營(yíng)養(yǎng)成分[2]。因此,對(duì)忍冬屬植物資源的開(kāi)發(fā)具有廣闊的市場(chǎng)。金銀木全株可入藥,具有清熱解毒、殺菌消炎之功效[3]。研究發(fā)現(xiàn)金銀木含有黃酮類(lèi)化合物,在不同生長(zhǎng)期金銀木的花、葉、果中均含有蘆丁,其中尤以金銀木葉中含量為最高,其含量甚至高于傳統(tǒng)藥材金銀花葉子中蘆丁含量[4-5]。蘆丁又名蕓香甙,維生素P,屬于黃酮類(lèi)物質(zhì),其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1。蘆丁等黃酮類(lèi)物質(zhì)具有抗氧化、清除自由基、降糖降脂等多種作用,在保健食品或藥品等領(lǐng)域應(yīng)用前景廣泛[6-8]。目前,對(duì)金銀木葉總黃酮的提取工藝已有研究[9],但有關(guān)金銀木葉黃酮類(lèi)物質(zhì)分離制備的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

圖1 蘆丁的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of rutin

高速逆流色譜(high speed counter-current chromatography HSCCC)為液液分配色譜,無(wú)需固體載體,不會(huì)發(fā)生樣品的不可逆吸附等作用,具有樣品回收完全、成本低、儀器操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn),近年來(lái)在天然產(chǎn)物、食品分離、生物制藥等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用和關(guān)注[10-11]。宋學(xué)英等建立了從白芍粗提物中分離純化五沒(méi)食子?；咸烟堑腍SCCC方法[12],石雪萍等應(yīng)用HSCCC分離制備花椒中的黃酮化合物[13],朱琳等應(yīng)用HSCCC法分離苦蕎中的蘆丁和槲皮素[14]。本研究采用高速逆流色譜分離金銀木葉中的一種黃酮成分蘆丁,有利于進(jìn)一步研究金銀木的藥效及其機(jī)理,以期為更好地開(kāi)發(fā)金銀木的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

金銀木葉(山西大學(xué)植物學(xué)孔冬梅老師鑒定,為金銀木金銀屬,LoniceramaackiiMaxim) 采于山西大學(xué)校園內(nèi);蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 純度98%,上海生工生物工程股份有限公司;氯仿、正己烷、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、磷酸 分析純,高效液相色譜所用的甲醇為色譜純,天津市化學(xué)試劑二廠;水 二次蒸餾水。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 金銀木葉粗提物的制備 采集新鮮金銀木葉,清水沖洗干凈后,自然陰干。用中藥粉碎機(jī)粉碎,過(guò)40目篩。稱取10.000 g粉末置于具塞錐形瓶中,按液料比25∶1加入70%(v∶v)乙醇溶液,于65 ℃水浴鍋中提取1 h,12000 r/min離心20 min,取上清,重復(fù)提取三次。合并提取液后于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮,得到棕褐色粘稠浸膏。向浸膏中加入100 mL乙酸乙酯,于65 ℃水浴中超聲波提取30 min,超聲波功率為250 W,趁熱過(guò)濾,取上清,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后,得到黃色粉末即為金銀木葉粗提物,4 ℃避光保存?zhèn)溆肹5]。

1.2.2 高效液相色譜分析條件 色譜柱:大連依利特HYPERSILC18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),流動(dòng)相為甲醇-0.4%磷酸(體積比50∶50),流速為1.0 mL/min,柱溫為25 ℃,檢測(cè)波長(zhǎng)256 nm。

精密配制20、40、60、80、100、120 μg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別取10 μL進(jìn)樣,以濃度x (μg/mL)為橫坐標(biāo),峰面積Y(A)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算回歸方程。

取一定量金銀木葉提取物,用甲醇溶解,0.22 μm針頭過(guò)濾器過(guò)濾后,進(jìn)行HPLC分析。

1.2.3 高速逆流色譜溶劑系統(tǒng)的選擇 參考高速逆流色譜分離黃酮類(lèi)化合物的相關(guān)報(bào)道及蘆丁的性質(zhì)選擇兩相體系[15],如乙酸乙酯、正己烷、甲醇、正丁醇和水等,按照一定比例混合配制溶劑體系(見(jiàn)表1),通過(guò)高效液相色譜測(cè)定蘆丁在不同體系中的分配系數(shù)K,篩選K值在0.5～2.0的溶劑系統(tǒng)用于高速逆流色譜[16]。

分配系數(shù)的測(cè)定[17]:分別取10.0 mL上相和下相溶液于分液漏斗中,加入10 mg金銀木葉粗提物,充分劇烈振搖,靜置至分配平衡后,分別各取4.0 mL上相和下相溶液減壓旋干后用1 mL甲醇溶解,過(guò)0.22 μm濾膜,按照方法1.2.2用HPLC測(cè)定蘆丁在兩相中的峰面積,并按照公式K=Su/Sd計(jì)算分配系數(shù)K。其中,Su和Sd分別為蘆丁在上相和下相溶劑中的HPLC峰面積。

1.2.4 高速逆流色譜法分離制備金銀木葉中黃酮化合物蘆丁 配制乙酸乙酯-正丁醇-水(5∶2∶5,v∶v)兩相溶劑系統(tǒng),于分液漏斗中充分振搖后在室溫下靜置12 h。分離上相和下相,分別進(jìn)行超聲脫氣30 min,冷卻。以10 mL/min的流速將上相泵入主機(jī)。待HSCCC分離管中充滿上相后,再以2 mL/min的流速泵入下相,同時(shí)調(diào)整主機(jī)轉(zhuǎn)速為800 r/min。待流動(dòng)相流出后,兩相在分離管中已達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡。開(kāi)啟AKTA prime檢測(cè)系統(tǒng),設(shè)置檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm,采集數(shù)據(jù),待基線平穩(wěn)后,上樣。取樣品100 mg,用等量上下相液體(各5 mL)溶解,由進(jìn)樣閥上樣,記錄色譜圖,收集各分離組分。

2 結(jié)果與討論

2.1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品及金銀木葉粗提物HPLC譜圖

圖2(A)為蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC色譜圖,圖2(B)為金銀木葉粗提物的HPLC色譜圖。由圖2(A)可知,蘆丁的保留時(shí)間為5.44 min。按照1.2.2方法,計(jì)算得到蘆丁的線性回歸方程為Y=1474.2x-126.35,R2=0.9997。從圖2(B)可見(jiàn),金銀木葉粗提物中的主要成分為蘆丁,而且按照本實(shí)驗(yàn)的HPLC條件進(jìn)行檢測(cè),蘆丁與其它組分得到了較好的分離。

圖2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(A)和金銀木葉粗提物(B)的HPLC圖譜Fig.2 HPLC chromatogram of rutin(A) and the extract of Lonicera maackii Maxim leaves(B)

2.2HSCCC分配系數(shù)的測(cè)定

HSCCC能否達(dá)到好的分離效果,兩相溶劑系統(tǒng)的選擇至關(guān)重要。一個(gè)好的溶劑系統(tǒng)應(yīng)該具備以下三個(gè)條件,即分配系數(shù)在0.5～2.0,兩相溶劑系統(tǒng)能較快分層,分層時(shí)間小于30 s,同時(shí)固定相要有高的保留率。根據(jù)蘆丁的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和文獻(xiàn)報(bào)道,本研究選擇了7種不同的溶劑體系,采用高效液相色譜測(cè)定了蘆丁在不同體系中的分配系數(shù),各溶劑體系及相應(yīng)分配系數(shù)K值見(jiàn)表1。

表1 樣品在不同溶劑體系中的分配系數(shù)KTable 1 Partition coefficients(K)of the extract of Lonicera maackii Maxim leaves in different two phase solvent systems

根據(jù)表1的數(shù)據(jù)可以看出,1號(hào)溶劑正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(4∶5∶4∶5,v∶v)分層時(shí)間大于30 s,溶劑系統(tǒng)2、3、4的分配系數(shù)均小于0.5。因此,以上四種溶劑系統(tǒng)不適合用于高速逆流色譜。溶劑5、6、7的K值符合要求,但5號(hào)溶劑氯仿-甲醇-水(4∶3∶2,v∶v)上機(jī)后固定相流失較為嚴(yán)重,另外,氯仿毒性也較大,不宜用作實(shí)驗(yàn)溶劑。6、7號(hào)溶劑系統(tǒng)毒性較小,然而,6號(hào)溶劑的K值略微顯小,7號(hào)溶劑系統(tǒng)的親水性增強(qiáng),K值增大,因此選用7號(hào)溶劑系統(tǒng)乙酸乙酯-正丁醇-水(5∶2∶5,v∶v)進(jìn)行高速逆流色譜分離制備金銀木葉的黃酮單體蘆丁。

2.3HSCCC分離結(jié)果

采用溶劑系統(tǒng)乙酸乙酯-正丁醇-水(5∶2∶5,v∶v),按照1.2.4的方法進(jìn)行高速逆流色譜分離金銀木葉粗提物,得到4個(gè)分離組分,見(jiàn)圖3。

圖3 金銀木葉粗提物的高速逆流色譜圖Fig.3 HSCCC chromatogram of the crude extract from Lonicera maackii Maxim leaves注:溶劑系統(tǒng):乙酸乙酯-正丁醇-水(5∶2∶5,v∶v); 固定相:上相;流動(dòng)相:下相;流速:2.0 mL/min; 轉(zhuǎn)速:800 r/min;檢測(cè)波長(zhǎng):254 nm。

收集圖3中的各組分進(jìn)行紫外-可見(jiàn)光譜掃描。其中,峰II樣品(洗脫體積150 mL)與標(biāo)準(zhǔn)蘆丁的特征吸收峰一致,結(jié)果見(jiàn)圖4。將各組分將按照1.2.2的HPLC條件進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)峰Ⅱ?yàn)閱我唤M分,結(jié)果如圖5所示。將其HPLC譜圖與對(duì)照品蘆丁的HPLC譜圖比較,二者保留時(shí)間一致,表明該組分為蘆丁,經(jīng)峰面積歸一法測(cè)得其純度為96.1%,經(jīng)計(jì)算得知在本實(shí)驗(yàn)條件下蘆丁得率為10.7%。

圖4 峰Ⅱ組分的紫外可見(jiàn)吸收?qǐng)D譜Fig.4 Absorption spectra of effluent fraction Ⅱ

圖5 峰Ⅱ組分的HPLC圖譜Fig.5 HPLC chromatogram of effluent fraction Ⅱ

3 結(jié)論

本文應(yīng)用高速逆流色譜法首次從金銀木葉粗提物中一步分離制備了黃酮化合物蘆丁。選用的兩相溶劑體系為乙酸乙酯-正丁醇-水(5∶2∶5,v∶v),上相為固定相,下相為流動(dòng)相,在轉(zhuǎn)速800 r/min、流速2 mL/min的條件下,150 min時(shí)收集得到蘆丁。經(jīng)HPLC測(cè)定,蘆丁純度為96.1%。本實(shí)驗(yàn)所用的高速逆流色譜法為液液層析,無(wú)需色譜柱,也不會(huì)發(fā)生色譜柱污染等問(wèn)題,所需耗材僅為溶劑體系,較制備型HPLC方法相比,HSCCC具有制備量大、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)[18]。本文建立了從金銀木葉中分離純化蘆丁的HSCCC方法,為進(jìn)一步研究金銀木的功效、提高金銀木的綜合利用奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

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IsolationandpreparationofrutinfromLoniceramaackiiMaximleavesbyhighspeedcountercurrentchromatography

LIChen,NINGLi-na

(School of Life Science,Shanxi University,Taiyuan 030006,China)

High-speed counter-current chromatography(HSCCC)was developed for separation and purification of rutin from crude extract ofLoniceramaackiiMaxim leaves. 10.7 mg of rutin was separated from 100 mg of the crude extract. The separation was performed using a two-phase solvent system composed of ethyl acetate-n-butanol-water(5∶2∶5,v∶v),in which the upper phase as stationary phase and the lower phase was used as the mobile phase,at a flow rate of 2.0 mL/min. The rotation speed and detection wavelength were set at 800 r/min and 256 nm,respectively. Four peaks were displayed on HSCCC chromatogram. The collected fractions were analyzed by HPLC and peak II contained the target compound of rutin,with a purity over 96% and a yield of 10.7%. This paper provided an easier method to purify rutin from crude extract ofLoniceramaackiiMaxim leaves. It can provide reference basis for full use ofLoniceramaackiiMaxim.

LoniceramaackiiMaxim leaves;rutin;high-speed counter-current chromatography(HSCCC)

2017-04-14

李晨(1981-)，女，博士，副教授，研究方向：蛋白質(zhì)與酶工程，E-mail:lichen@sxu.edu.cn。

山西省青年科學(xué)基金(2015021047)；山西省高校科技創(chuàng)新項(xiàng)目(2016116)。

TS207.3

A

1002-0306(2017)21-0237-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.21.047