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(1.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,四川綿陽(yáng) 621010; 2.肉類(lèi)加工四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川成都 610016)

響應(yīng)面法優(yōu)化臘肉酶解工藝條件

王艷蓉1,王衛(wèi)2,黃業(yè)傳1,*,劉芝君1,蔣萍1

(1.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,四川綿陽(yáng) 621010; 2.肉類(lèi)加工四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川成都 610016)

為探究臘肉最佳酶解工藝,為其進(jìn)一步深加工奠定理論基礎(chǔ)。以川味臘肉為原料,采用堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、風(fēng)味酶及動(dòng)物蛋白酶對(duì)其進(jìn)行酶解,以水解度(Degree of hydrolysis,DH)為測(cè)定指標(biāo),確定中性蛋白酶與風(fēng)味酶的復(fù)配酶為最佳用酶;選取中性蛋白酶與風(fēng)味酶的配比、料液比、加酶量、時(shí)間、pH及溫度進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn),再在此基礎(chǔ)上,以水解度為響應(yīng)值,采用響應(yīng)面法優(yōu)化工藝條件,確定最佳酶解條件為中性蛋白酶與風(fēng)味酶配比為1∶2、自然pH(5.9～6.0),加酶量0.35%、料液比1∶2 (g/mL)、酶解溫度47 ℃,酶解時(shí)間5 h。在此條件下,水解度實(shí)測(cè)值為8.77%,理論值為8.84%,實(shí)測(cè)值與理論值相差較小。

臘肉,響應(yīng)面法,酶解,水解度

臘肉在我國(guó)歷史悠久,是用食鹽等調(diào)味香料將原料肉腌制后,經(jīng)煙熏、晾曬等工藝加工而成的生肉類(lèi)產(chǎn)品,具有風(fēng)味獨(dú)特、保存性好等特點(diǎn)[1]?，F(xiàn)在對(duì)臘肉的研究主要集中在幾方面:一、改善臘肉加工工藝[2];二、對(duì)臘肉風(fēng)味物質(zhì)鑒定[3];三、微生物在臘肉成熟中的作用[4];四、臘肉安全性研究[5];五、臘肉抗氧化方面的研究[6]。

現(xiàn)在臘肉產(chǎn)品形式較單一,為增加其附加值,開(kāi)展臘肉深加工方面的研究迫在眉睫。研究表明,酶解技術(shù)是先進(jìn)的風(fēng)味提取技術(shù),能有效改善產(chǎn)物的口感與營(yíng)養(yǎng)特性;且其作用過(guò)程溫和,在加工過(guò)程中能最大限度減少臘肉的風(fēng)味損失[7]。目前,在肉制品方面,酶解技術(shù)應(yīng)用于魚(yú)類(lèi)、雞肉[8]、豬骨[9]、豬皮、豬血及火腿[10]等的研究較多,如王文莉等[11]研究酸性蛋白酶酶解大鯢肉的最佳酶解條件及酶解產(chǎn)物的抗氧化作用,結(jié)果表明,酶解的最佳工藝條件為酸性蛋白酶添加量0.4%、底物濃度0.1 g/mL、酶解溫度45 ℃、pH2.0、時(shí)間5.5 h,大鯢酶解產(chǎn)物清除羥基自由基和DPPH自由基的能力隨濃度升高而增強(qiáng);蘇偉等[12]將新鮮豬皮用胃蛋白酶進(jìn)行酶解,優(yōu)化酶解工藝,研究酶解產(chǎn)物的抗氧化功能,結(jié)果表明,最佳酶解條件為加酶量0.25%、料液比1∶2 (g/mL)、酶解時(shí)間1.65 h、酶解溫度41.15 ℃,在此酶解條件下有較好的抗氧化能力,其產(chǎn)物清除·OH的IC50值為6.36 mg/mL;對(duì)DNA損傷保護(hù)作用的IC50值為1.86 mg/mL。

但酶解技術(shù)在臘肉方面應(yīng)用報(bào)道較少,大部分研究集中在腌制品制作過(guò)程中的應(yīng)用[13]。因此本實(shí)驗(yàn)以川味臘肉為原料,選五種酶中水解效果最佳的酶與風(fēng)味酶進(jìn)行復(fù)配,復(fù)配酶作為實(shí)驗(yàn)酶對(duì)其進(jìn)行酶解,旨在改善臘肉酶解物生物活性及酶解液風(fēng)味,得到更多活性肽及氨基酸,來(lái)制備風(fēng)味較好的臘肉香精等,為臘肉酶解液的進(jìn)一步研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

新鮮豬肉 綿陽(yáng)八品農(nóng)產(chǎn)品開(kāi)發(fā)有限公司;臘肉 實(shí)驗(yàn)室自制;食鹽;堿性蛋白酶 酶活力200000 U/g,木瓜蛋白酶 酶活力100000 U/g,中性蛋白酶 酶活力200000 U/g,動(dòng)物蛋白水解酶 酶活力1500 U/g,風(fēng)味蛋白酶 酶活力15000 U/g 所有酶均購(gòu)于江蘇銳陽(yáng)生物科技有限公司;甲醛,鹽酸,氫氧化鈉,酚酞等所用其他化學(xué)試劑 均為分析純。

PHS-3CB型pH計(jì) 上海越平科學(xué)儀器有限公司;BS223S型電子天平 德國(guó)賽多利斯公司(北京);DHG-9053A電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;FW-200型高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 北京中興偉業(yè)儀器有限公司;HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州澳華儀器有限公司;SZ-1型快速混勻器 常州普天儀器制造有限公司;G20-PHOH電磁爐 上海奔騰企業(yè)有限公司;美國(guó)布林克曼煙熏爐;真空腌味機(jī) 深圳市瑞豐電器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 臘肉制作流程與預(yù)處理 稱(chēng)取適量豬背脊肉切成厚度為4～6 cm的肉條,再用蒸餾水沖洗肉條表面3～5遍后懸掛晾干,備用[14];稱(chēng)取豬背脊肉重量5%的鹽均勻揉抹在備用的肉條上,揉抹均勻后,將肉條放入滾揉機(jī)里,轉(zhuǎn)動(dòng)25～30 min以促進(jìn)腌制劑的吸收,之后將肉條在4 ℃左右腌制24 h[14-15]。

將上述腌制好的肉條懸掛進(jìn)煙熏爐,用柏枝為柴火,利用其不完全燃燒釋放出的植物油脂青煙對(duì)肉條進(jìn)行熏烤,直至肉條表面微微起焦、呈金黃色時(shí),取出掛于通風(fēng)處自然風(fēng)干,進(jìn)行后熟。

取出臘肉條并用刀刮除肉表面焦黑部分,再用蒸餾水沖洗干凈后用刀削片,切成肉末備用。

1.2.2 臘肉酶解工藝流程 稱(chēng)取10.00 g臘肉按1∶3 (g/mL)的比例加入蒸餾水→加入0.30%的酶(臘肉質(zhì)量比)→攪拌,混勻→恒溫水浴鍋內(nèi)酶解→100 ℃水浴滅酶15 min→4000 r/min離心20 min→過(guò)濾→指標(biāo)測(cè)定

1.2.3 酶的選擇 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)在水解時(shí),隱藏在蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水氨基會(huì)暴露出來(lái),顯示出苦味;選擇復(fù)配酶,讓疏水氨基進(jìn)一步被水解,而風(fēng)味酶同時(shí)具有內(nèi)切和外切兩種活性,可用于脫除水解液苦味,改善水解液風(fēng)味[16]。風(fēng)味酶作為復(fù)配酶之一。根據(jù)文獻(xiàn)[17-18]及前期預(yù)實(shí)驗(yàn),初步確定各酶的酶解條件,按1.2.2的步驟進(jìn)行酶解,通過(guò)測(cè)定臘肉蛋白的水解度,確定水解效果最佳的酶,并與風(fēng)味酶進(jìn)行復(fù)配,為后續(xù)生產(chǎn)風(fēng)味較好的臘肉香精,提供指導(dǎo)和打下基礎(chǔ)。

1.2.4 臘肉酶解單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 中性蛋白酶與風(fēng)味酶配比 分別稱(chēng)取10.00 g備用臘肉肉末,料液比1∶3 (g/mL),加酶量為0.30%(臘肉質(zhì)量比),中性蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶按一定比例進(jìn)行配比(1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6),在自然pH(5.9～6.0),50 ℃水浴,酶解4 h后,在100 ℃水浴滅酶15 min后離心過(guò)濾,取濾液進(jìn)行水解度測(cè)定。

1.2.4.2 料液比 分別稱(chēng)取10.00 g備用臘肉肉末,按料液比(1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7 g/mL)加入蒸餾水,加酶量0.30%(臘肉質(zhì)量比),中性蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶1∶2配比,在自然pH(5.9～6.0),50 ℃水浴,酶解4 h后,在100 ℃水浴滅酶15 min后離心過(guò)濾,取濾液進(jìn)行水解度測(cè)定。

1.2.4.3 加酶量 分別稱(chēng)取10.00 g備用臘肉肉末,料液比1∶3 (g/mL),按加酶量(0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%、0.35%、0.40%),中性蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶1∶2配比,在自然pH(5.9～6.0),50 ℃水浴,酶解4 h后,100 ℃水浴滅酶15 min后離心過(guò)濾,取濾液進(jìn)行水解度測(cè)定。

1.2.4.4 酶解時(shí)間 分別稱(chēng)取10.00 g備用臘肉肉末,料液比1∶3 (g/mL),加酶量0.30%(臘肉質(zhì)量比),中性蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶1∶2配比,自然pH(5.9～6.0),水浴50 ℃,分別酶解(0、1、2、3、4、5、6 h)后,100 ℃水浴滅酶15 min后離心過(guò)濾,取濾液進(jìn)行水解度測(cè)定。

1.2.4.5 酶解pH 分別稱(chēng)取10.00 g備用臘肉肉末,料液比1∶3 (g/mL),加酶0.30%(臘肉質(zhì)量比),中性蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶1∶2配比,在pH為(5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、自然pH),水浴50 ℃,酶解4 h后,100 ℃水浴滅酶15 min后離心過(guò)濾,取濾液進(jìn)行水解度測(cè)定。

1.2.4.6 酶解溫度 分別稱(chēng)取10.00 g備用臘肉肉末,料液比1∶3 (g/mL),加酶0.30%(臘肉質(zhì)量比),中性蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶為1∶2配比,在自然pH(5.9～6.0),水浴(40、45、50、55、60、65 ℃),酶解4 h后,100 ℃水浴滅酶15 min后離心過(guò)濾,取濾液進(jìn)行水解度測(cè)定。

1.2.5 酶解工藝條件的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理,以臘肉酶解過(guò)程中的水解度為響應(yīng)值,選取加酶量、酶解時(shí)間、料液比及溫度為影響因子,進(jìn)行4因素3水平響應(yīng)面實(shí)驗(yàn),確定臘肉酶解的最佳工藝參數(shù)。實(shí)驗(yàn)因素水平表見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels table of response surface experiment

1.2.6 水解度的測(cè)定

表2 各酶粗酶解條件及結(jié)果(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)Table 2 The hydrolysis conditions and resultsof each enzyme(mean±SD)

式(1)

采用甲醛滴定法[19-20]測(cè)游離氨基態(tài)氮,取酶解液20.00 mL于100 mL容量瓶中,定容,混勻后取10.00 mL稀釋樣品入三角瓶中,加入10.00 mL中性甲醛,再加入2～3滴酚酞指示劑,用0.05 mol/L標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液滴定至微紅,同時(shí)用10.00 mL蒸餾水代替酶解液做空白對(duì)照。記錄所消耗的標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液的體積?？偟坑萌詣?dòng)凱氏定氮儀,微量凱氏定氮法測(cè)定[19]。

式(2)

式(2)中,c為標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液濃度,mol/L;V1為樣品消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積,mL;V0為試劑空白消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積,mL;V為測(cè)定時(shí)吸取樣品稀釋體積,mL。

1.3數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次,采用Excel、SPSS 13.0和Design Expert 8.0.6對(duì)各實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1酶的確定

五種酶在其粗酶解條件下得到的臘肉水解情況如表2,因不同酶對(duì)底物的酶切方式不同,使酶解液疏水性等指標(biāo)不同,從而影響水解度[17]。由表2可知中性蛋白酶水解度最高,水解效果最好,因此選擇中性蛋白酶與復(fù)配酶之一的風(fēng)味酶進(jìn)行復(fù)配,增強(qiáng)水解效果,改善水解液風(fēng)味,為后續(xù)制備風(fēng)味好的臘肉香精產(chǎn)品打下基礎(chǔ)。

2.2中性蛋白酶與風(fēng)味酶的配比對(duì)水解度的影響

由圖1可知,隨著配比的增加水解度先增加后減少,在1∶2時(shí),水解度達(dá)到最高為6.01%,隨后呈遞減趨勢(shì)。說(shuō)明中性蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶在1∶2配比時(shí),作用基團(tuán)范圍相對(duì)較大,水解比較充分[18]。綜合考慮實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及經(jīng)濟(jì)成本,中性蛋白酶與風(fēng)味酶的配比定為1∶2。

圖1 中性蛋白酶與風(fēng)味酶配比對(duì)水解度影響Fig.1 Effects of the ratio of neutrase and flavor enzyme on degree of hydrolysis

圖2 料液比對(duì)水解度的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on degree of hydrolysis

2.3料液比對(duì)水解度的影響

由圖2可知,隨著料液比的增加,水解度遞減,在料液比為1∶1 (g/mL)時(shí)達(dá)到最高,但在此時(shí)得到的酶解產(chǎn)物含雜質(zhì)較多稍渾濁,酶解液損失嚴(yán)重,不利于后續(xù)檢測(cè)和研究。鄧楠[16]研究海產(chǎn)品下腳料酶解料液比時(shí),料液比在1∶1 (g/mL),水解度達(dá)到最大,可知料液比對(duì)酶解反應(yīng)的影響較大,水分不夠,酶在底物中流動(dòng)性差,兩者不能充分結(jié)合;而料液比較大時(shí),使底物濃度降低,酶不能得到充分利用。綜合考慮,選擇料液比1∶2、1∶3、1∶4 (g/mL)三個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

2.4加酶量對(duì)水解度的影響

由圖3可知,隨著酶添加量的增加,水解度呈上升趨勢(shì),到0.30%時(shí),增加的幅度變小,趨勢(shì)變緩,說(shuō)明酶濃度已達(dá)到飽和。吳爽等[17]用堿性蛋白酶酶解谷朊粉時(shí),隨著酶添加量增大,堿性蛋白酶對(duì)谷朊粉的酶解作用也逐漸增加,當(dāng)達(dá)到一定值時(shí),變化不明顯,繼續(xù)增加酶添加量對(duì)酶解速率影響較小。王嵐等[21]用蛋白酶酶解蝦肉時(shí),隨著酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加,水解度逐漸上升,在0.20%～0.30%之間時(shí),水解度上升較快;而當(dāng)酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過(guò)0.30%后,水解度上升平緩,與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。綜合考慮,選擇0.25%、0.30%、0.35%三個(gè)水平做響應(yīng)面優(yōu)化。

圖3 加酶量對(duì)水解度的影響Fig.3 Effect of enzyme addition on degree of hydrolysis

2.5酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響

固定加酶量、料液比、pH及酶解溫度,考察酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響。由圖4可知,水解度隨著酶解時(shí)間的增加,呈上升的趨勢(shì)。在3 h之后,水解度增加的趨勢(shì)變緩,可能是因?yàn)樗庖堰_(dá)到平衡,而在6 h時(shí)水解度稍有下降。吳爽等[17]研究時(shí)間對(duì)谷朊粉酶解的影響時(shí),發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間的增長(zhǎng),水解度隨之上升,當(dāng)水解到180 min時(shí),水解度趨于平緩,與本實(shí)驗(yàn)結(jié)論相似。綜合考慮能源節(jié)約等因素,選用3、4、5 h三個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化,既不造成能源浪費(fèi),又能得到較好的酶解效果。

圖4 酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響Fig.4 Effect of enzymolysis time on degree of hydrolysis

2.6酶解pH對(duì)水解度的影響

不同的酶對(duì)應(yīng)最適pH范圍不同,酶解時(shí)pH會(huì)對(duì)酶分子極性基團(tuán)解離狀態(tài)的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響,從而影響酶解反應(yīng)的效果[17]。實(shí)驗(yàn)選用5.5、6.0、6.5、7.0、7.5以及自然pH(5.9～6.0)為實(shí)驗(yàn)水平,固定料液比、加酶量、酶解時(shí)間以及溫度,以研究pH對(duì)水解度的影響。其結(jié)果如圖5所示,隨著pH的增加,水解度呈遞減趨勢(shì);自然pH在5.5～6.0之間,有較好的水解效果。鄧楠[16]研究海產(chǎn)品下腳料酶解pH影響時(shí),表示時(shí)間和溫度等因素也會(huì)對(duì)水解度產(chǎn)生影響,所以表現(xiàn)出水解度最高對(duì)應(yīng)的pH不是精確的在某個(gè)值上,但酶在其最適pH范圍內(nèi),酶活力是最強(qiáng)的。綜合考慮,選用自然pH(5.9～6.0)。

圖5 pH對(duì)水解度的影響Fig.5 Effect of pH on degree of hydrolysis

2.7溫度對(duì)水解度的影響

酶解反應(yīng)的效果與酶解溫度關(guān)系密切,溫度過(guò)低,反應(yīng)慢;溫度升高,反應(yīng)速率加快;但溫度過(guò)高,會(huì)使酶失活,影響酶解反應(yīng)效果[17]。結(jié)果如圖6所示,隨著溫度的上升,水解度先增加后減小,在45～55 ℃變化趨勢(shì)不大,55 ℃之后水解度開(kāi)始降低,酶活性可能受損。王文莉[11]等酶解大鯢肉,隨著溫度的升高,水解度升高,達(dá)到一定溫度,水解度達(dá)到最大值,再提高溫度,水解度出現(xiàn)下降趨勢(shì)。李俊江[22]等對(duì)鵝肉進(jìn)行酶解時(shí),隨著溫度的升高,水解度和酶解液的抗氧化活性逐漸增大,當(dāng)溫度達(dá)到50 ℃左右時(shí),水解度和酶解液的抗氧化活性均達(dá)到最大值,與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。綜合考慮實(shí)驗(yàn)結(jié)果及節(jié)約能源,選擇45、50、55 ℃做響應(yīng)面優(yōu)化。

圖6 酶解溫度對(duì)水解度的影響Fig.6 Effect of enzymolysis temperature on degree of hydrolysis

2.8臘肉酶解的響應(yīng)面優(yōu)化

根據(jù)上述單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,中性蛋白酶與風(fēng)味酶1∶2的配比,選擇自然pH(5.9～6.0),并對(duì)酶添加量、料液比、酶解時(shí)間、溫度四個(gè)因素,按表3進(jìn)行4因素3水平的Box-Behnken的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)Table 3 Results of response surface experiments(mean±SD)

表4 響應(yīng)面二次回歸方程模型方差分析結(jié)果Table 4 ANOVA results of quadratic regression model for response surface

注：p<0.05,表示顯著*,p<0.01,表示極顯著**。

采用Design Expert 8.0.6統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)表3實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合分析,得到加酶量、料液比、溫度和時(shí)間4個(gè)因素的二次多項(xiàng)回歸方程為:

水解度(%)=5.80-0.011A-1.94B+0.29C-0.13D-0.045AB+5.000×10-3AC-0.013AD-0.050BC+0.28BD-0.14CD+0.031A2+0.42B2+0.097C2-0.48D2

對(duì)表4回歸系數(shù)進(jìn)行顯著性分析,結(jié)果表明,B、C、D、BD、B2、D2為極顯著項(xiàng)(p<0.01),CD為顯著項(xiàng),其他項(xiàng)均不顯著。B的F值最大,其次是C和D,A相對(duì)較小,表明四個(gè)因素對(duì)酶解過(guò)程水解度影響的大小順序?yàn)锽>C>D>A,即料液比>時(shí)間>溫度>加酶量。交互作用中,只有BD和CD項(xiàng)有顯著交互作用,因此,料液比和酶解溫度、酶解時(shí)間和酶解溫度兩組因素存在明顯交互作用,對(duì)兩組因素進(jìn)行響應(yīng)面分析,考察因素間的交互規(guī)律。

通過(guò)響應(yīng)面軟件最優(yōu)組合分析得到臘肉的最佳酶解條件為加酶量0.35%、料液比1∶2 (g/mL)、酶解時(shí)間5.00 h、酶解溫度47.00 ℃,最優(yōu)條件下水解度為8.84%。

2.8.1 料液比和酶解溫度間的交互作用分析 圖7為料液比與溫度之間的交互作用,料液比與溫度對(duì)水解度影響的交互作用極顯著(p=0.0002);加酶量0.30%,酶解時(shí)間為4 h,當(dāng)溫度一定時(shí),隨著料液比的減小,臘肉的水解度呈直線(xiàn)上升趨勢(shì);當(dāng)料液比一定時(shí),隨著溫度的增加,水解度先上升后下降,但總的變化較小,酶解溫度存在臨界值。對(duì)酶解溫度臨界值計(jì)算,進(jìn)一步分析酶溫度與料液比的交互規(guī)律,結(jié)果如表5所示,當(dāng)料液比為1∶2 (g/mL)時(shí),臨界溫度為47.83 ℃;料液比為1∶3 (g/mL)時(shí),臨界溫度49.31 ℃;料液比為1∶4 (g/mL)時(shí),臨界溫度為50.79 ℃。在不同料液比,酶解溫度都存在臨界值使水解度有最大值,隨著料液比的增加,臨界溫度增加,水解度最大值減小。表明溫度過(guò)高過(guò)低都不利于臘肉的酶解,料液比過(guò)大使得底物濃度變小,不利于酶解。料液比對(duì)水解度的影響明顯大于溫度,反應(yīng)體系的水分可以使蛋白酶分散均勻,與底物充分接觸,保證酶解完全[25]。

表5 不同料液比下酶解溫度對(duì)水解度影響的臨界值Table 5 Temperature critical values influencing the degree of hydrolysis under the conditions of different solid-liquid ratio

表6 不同酶解時(shí)間下酶解溫度對(duì)水解度影響的臨界值Table 6 Temperature critical values influencing the degree of hydrolysis under the conditions of different enzymolysis time

圖7 料液比和溫度對(duì)水解度影響的響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface graph of temperature and solid-liquid ratio on the degree of hydrolysis

2.8.2 酶解時(shí)間和酶解溫度間的交互作用分析 圖8為酶解時(shí)間與酶解溫度之間的交互作用,加酶量0.30%、料液比1∶3。等高線(xiàn)呈橢圓形,酶解時(shí)間與酶解溫度交互顯著(p=0.0247)。當(dāng)溫度一定時(shí),隨著時(shí)間的增長(zhǎng),水解度呈上升趨勢(shì);當(dāng)酶解時(shí)間不變時(shí),水解度隨著溫度的增加而先升高后下降,酶解溫度存在臨界值[26]。對(duì)不同時(shí)間下溫度的臨界值進(jìn)行求解,進(jìn)一步分析酶解時(shí)間與溫度的交互作用,結(jié)果如表6所示,當(dāng)酶解時(shí)間為3 h時(shí),臨界溫度為50.06 ℃;酶解時(shí)間為4 h時(shí),臨界溫度49.31 ℃;酶解時(shí)間為5 h時(shí),臨界溫度為48.56 ℃。說(shuō)明在不同酶解時(shí)間,酶解溫度都存在臨界值使水解度有最大值,隨著時(shí)間增加,臨界溫度減小,水解度的最大值增加。

圖8 酶解時(shí)間和溫度對(duì)水解度影響的響應(yīng)面圖Fig.8 Response surface graph of temperature and enzymolysis time on the degree of hydrolysis

2.8.3 酶解最佳工藝條件的確定及驗(yàn)證結(jié)果 為驗(yàn)證響應(yīng)面所得結(jié)果的可靠性,根據(jù)Design Expert 軟件,預(yù)測(cè)出臘肉酶解的最佳工藝條件。并對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證,酶解所得的平均水解度為8.77%,與預(yù)測(cè)值8.84% 基本相符,誤差較小。因此用響應(yīng)面法分析優(yōu)化得到的臘肉酶解條件與實(shí)際擬合較好,具有可靠性和實(shí)用價(jià)值。

3 結(jié)論

通過(guò)比較不同蛋白酶對(duì)臘肉酶解的效果,選用中性蛋白酶與風(fēng)味酶按1∶2進(jìn)行復(fù)配,自然pH(5.9～6.0),在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用響應(yīng)面法對(duì)酶解過(guò)程中加酶量、料液比、酶解時(shí)間、酶解溫度四個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化,得到臘肉酶解的最佳工藝條件為:加酶量0.35%、料液比1∶2 (g/mL)、酶解溫度47 ℃,酶解時(shí)間5 h。驗(yàn)證得到的水解度為8.77%,與預(yù)測(cè)值8.84%十分接近。響應(yīng)面法能對(duì)臘肉酶解工藝進(jìn)行較好的優(yōu)化,同時(shí)為臘肉酶解物的進(jìn)一步研究及美拉德反應(yīng)生產(chǎn)香精產(chǎn)品等提供了理論依據(jù)。

[1]孫東躍. 中國(guó)傳統(tǒng)肉制品現(xiàn)代化工業(yè)加工研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)食品添加劑,2012(5):203-206.

[2]周明月,陳韜. 低鹽傳統(tǒng)臘肉的研制與加工[J]. 肉類(lèi)研究,2012,26(2):17-21.

[3]黃業(yè)傳,李鳳,黃甜等. 利用電子鼻和氣質(zhì)聯(lián)用研究臘肉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的形成規(guī)律[J]. 食品工業(yè)科技,2014,35(6):73-80.

[4]陳美春,楊勇,石磊. 四川臘肉生產(chǎn)過(guò)程中理化及微生物特性的研究[J]. 食品科學(xué),2008,29(5):149-152.

[5]熊敏,秦建. 黔式傳統(tǒng)腌臘肉食用安全性探析[J]. 微量元素與健康研究,2016,33(4):45-47.

[6]楊佳藝,王國(guó)棟,楊佳,等. 添加抗氧化劑對(duì)冷藏(0 ℃)臘肉脂肪降解的影響[J]. 食品工業(yè)科技,2012,33(7):327-332.

[7]肖月娟,李潤(rùn)豐,鄭立紅,等. 斑鰶魚(yú)蛋白控制酶解及其酶解物抗氧化活性研究[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào),2010,10(5):91-96.

[8]Liu J H,Tian Y G,Wang Y. Characterization and in vitro antioxidation of papain hydrolysate from black-bone silky fowl(GallusgallusdomesticusBrisson) muscle and its fractions[J]. Food Research International,2011,44:133-138.

[9]Jordi Pagan,Albert Ibarz,Victor Falguera,et al. Enzymatic hydrolysis kinetics and nitrogen recovery in the protein hydrolysate production from pig bones[J]. Journal of Food Engineering,2013,119:655-659.

[10]Caroline Thomas,Frédéric Mercier,Pascal Tournayre. Effect of nitrite on the odourant volatile fraction of cooked ham[J]. Food Chemistry,2013,139:432-438.

[11]王文莉,張偉,于新瑩,等. 大鯢肉酶解產(chǎn)物的制備及其抗氧化性的研究[J]. 河北漁業(yè),2012,9(1):1-4.

[12]蘇偉,楊旭卉,王瑜,等. 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化基于膠原特性酶解豬皮工藝及其抗氧化特性[J]. 食品科學(xué),2015,36(24):70-76.

[13]朱建軍,胡曉宇,胡萍,等.組織蛋白酶對(duì)腌肉制品風(fēng)味的影響[J]. 食品工程,2013(3):4-6.

[14]芮露明. 傳統(tǒng)煙熏臘肉綠色制造技術(shù)研究[D]. 南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2013:27-32.

[15]李斌. 淺談肉類(lèi)加工的腌制工藝[J]. 肉類(lèi)工業(yè),2016,(3):8-13.

[16]鄧楠. 海產(chǎn)品下腳料酶解液制備肉味香精[D]. 山東青島:中國(guó)海洋大學(xué),2012:21-26.

[17]吳爽. 谷朊粉酶解物美拉德反應(yīng)生產(chǎn)肉味香精的研宄[D].無(wú)錫:江南大學(xué),2013:10-16.

[18]白騰輝,潘潤(rùn)淑,馬亞萍,等. 響應(yīng)面法優(yōu)化酪蛋白酶法水解條件[J]. 食品工業(yè)科技,2014,35(23):203-206.

[19]李和生主編. 食品分析實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M]. 北京:科學(xué)出版社,2012:29-35.

[20]巫亮. 酶解豬皮制備豬肉調(diào)味料的研究[D]. 廣州:華南理工大學(xué),2010:22-28.

[21]王嵐,王龍耀. 蝦肉的蛋白酶酶解過(guò)程研究[J]. 天津化工,2017,21(4):19-21.

[22]李俊江,潘道車(chē)，郭宇里,等. 鵝肉蛋白酶酶解條件優(yōu)化及酶解產(chǎn)物抗氧化活性研究[J]. 食品科學(xué),2013,33(3):126-130.

[23]I V Nikolaec S Sforza,F Lambertini,D Yu Ismailova,et al. Biocatalytic conversion of poultry processing leftovers:Optimization of hydrolytic conditions and peptide hydrolysate characterization[J]. Food Chemistry,2016,197:611-621.

[24]靳國(guó)鋒. 干腌培根加工過(guò)程中脂質(zhì)氧化調(diào)控機(jī)制研究[D]. 南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2011:109-113.

[25]Alemán A,Pérez-Santín E,Bordenave-Juchereau S,et al. Squid gelatin hydrolysates with antihypertensive,anticancer and antioxidant activity[J]. Food Research International,2011,44(4):1044-1051.

[26]Satish Cingadi,Katla Srikanth,Arun E V R,et al. Statistical optimization of cassava fibrous waste hydrolysis by response surface methodology and use of hydrolysate based media for the production of optically pured-lactic acid[J]. Biochemical Engineering Jurnal,2015,102:82-90.

Optimizationofenzymatichydrolysisconditionsforbaconbyresponsesurfacemethod

WANGYan-rong1,WANGWei2,HUANGYe-chuan1,*,LIUZhi-jun1,JIANGPing1

(1.College of Life Science and Engineering,Southwest University of Science and Technology,Mianyang 621010,China; 2.Sichuan Key Laboratory of Meat Processing,Chengdu 610016,China)

To investigate the optimal enzymatic hydrolysis conditions of bacon and to lay theoretical foundation for further processing,the Sichuan bacon was hydrolyzed by alcalase,neutrase,papain,flavor enzyme,and animal protease respectively. The compound enzyme of neutrase and flavor enzyme was the best enzyme for the progress according to the determination of degree of hydrolysis. Single factor tests were conducted to determine the ratio of neutrase and flavor enzyme,solid-liquid ratio,enzyme addition,time,pH,and temperature. The optimal processes conditions were obtained using response surface methodology and the degree of hydrolysis was used as the response value,and the optimum conditions were neutrase-flavor enzyme ratio of 1∶2,original pH(5.9～6.0),enzyme addition of 0.35%,solid-liquid ratio of 1∶2,enzymolysis temperature of 47 ℃,enzymolysis time of 5 h. Under the conditions,the DH could reach 8.77%,which was close to the predicted value of 8.84%.

bacon;response surface method;enzymatic hydrolysis;degree of hydrolysis

2017-05-08

王艷蓉(1993-)，女，在讀碩士研究生，研究方向：肉制品加工與酶工程，E-mail：790010315@qq.com。

*

黃業(yè)傳(1975-)，男，博士，副教授，研究方向：肉制品加工與酶工程，E-mail：563248056@qq.com。

肉類(lèi)加工四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金(15-R17)；四川省科技廳應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目(2016JY0110)。

TS251.9

B

1002-0306(2017)21-0209-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.21.041