, ,,, ,,*

(1.東北林業(yè)大學,黑龍江哈爾濱 150040; 2.哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院,黑龍江哈爾濱 150086; 3.東北農(nóng)業(yè)大學,黑龍江哈爾濱 150030)

橡子粉酶法制備低聚異麥芽糖的工藝研究

張智1,李晴1,化洪苓1,尹文哲2,李杰3,馬建章1,*

(1.東北林業(yè)大學,黑龍江哈爾濱 150040; 2.哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院,黑龍江哈爾濱 150086; 3.東北農(nóng)業(yè)大學,黑龍江哈爾濱 150030)

對橡子粉酶法制備低聚異麥芽糖的工藝過程進行優(yōu)化,以期提高低聚異麥芽糖中異麥芽糖、潘糖和異麥芽三糖的含量。采用Box-Benhnken響應面法,優(yōu)化以耐高溫α-淀粉酶液化橡子粉的工藝條件。最佳的液化工藝條件為:以DE值13%為最佳液化指標,液化時間31 min、液化溫度95 ℃、液化pH6.6、酶添加量13 U/g,結(jié)合生產(chǎn)實際最佳條件下的DE值為12.91%;繼而采用正交實驗,優(yōu)化以普魯蘭酶、β-淀粉酶糖化橡子粉液化液的工藝條件,得到最佳的糖化工藝條件為:普魯蘭酶添加量25 U/g、β-淀粉酶添加量130 U/g、溫度60 ℃、時間10 h,在此最佳工藝條件下糖化轉(zhuǎn)苷后的(IG2+P+IG3)含量為36.11%±0.17%;轉(zhuǎn)苷工藝過程的α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶最佳添加量為1.5 U/g,最佳條件下異麥芽糖、潘糖、異麥芽三糖含量之和為36.27%±0.18%。

低聚異麥芽糖,橡子粉,液化,糖化,轉(zhuǎn)苷,工藝

橡子(acorn),殼斗科,為麻櫟屬橡樹和常綠櫧栲類橡樹所結(jié)果實,全球此樹種有8屬900多種,而在我國就有7屬300多種,充分說明了我國橡子資源豐富[1]。橡子仁營養(yǎng)豐富,含有淀粉約50.6%～58.7%、蛋白質(zhì)11.7%～15.8%、脂肪2.1%～2.8%、單寧10.2%～14.1%[2]。其淀粉含量不亞于大豆等谷物,與玉米淀粉含量相似[3]。橡子粉可以開發(fā)成各種產(chǎn)品,例如橡子涼粉[4]、橡子餅干[5]等,同時橡子粉還可以進一步加工成變性淀粉、糖漿、環(huán)狀糊精、淀粉膠和生物多糖等深層次的產(chǎn)品,從而可有效提高橡實產(chǎn)品的經(jīng)濟效益以及科學價值,在橡子粉的凝沉穩(wěn)定性、顆粒晶體等淀粉特性方面的研究[6-8]也有了進展。

低聚異麥芽糖(isomalto-oligosaccharide)又稱分枝低聚糖,是指由葡萄糖以α-(1-6)糖苷鍵結(jié)合而成的單糖數(shù)為2～5不等的低聚糖[9],主要成分為異麥芽糖(IG2)、潘糖(P)、異麥芽三糖(IG3)。自然界中純天然游離的低聚異麥芽糖較少,一般存在于蜂蜜、黃酒、醬油等。含有豐富的食物纖維,具有防齲齒的功效,可降低膽固醇及血脂水平,同時作為益生菌可促進雙歧桿菌的增殖,既是保健品又是營養(yǎng)物質(zhì),可謂是21世紀的新型保健品[10-11]。目前低聚異麥芽糖的制備多以玉米淀粉及大米淀粉居多[12-13],然而以橡子粉為原料制備低聚異麥芽糖工藝過程的研究尚未發(fā)現(xiàn)。

本研究以橡子粉為原料,使橡子資源更加合理地被利用,為以橡子粉為原料的優(yōu)質(zhì)低聚異麥芽糖的制備提供了新的理論依據(jù),提高了生產(chǎn)效率。

1 材料與儀器

1.1材料與儀器

橡子粉 撫順金宇食品有限公司;耐高溫α-淀粉酶、β-淀粉酶、普魯蘭酶、α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶(酶活性分別為20000 U/mL、700000 U/mL、1000 ASP U/mL、100000 U/mL) 上海源葉生物科技有限公司;異麥芽糖(IG2)、潘糖(P)、異麥芽三糖(IG3)標準品 美國Miragen公司;硫酸銅、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、葡萄糖、次甲基藍、鹽酸等均為分析純 天津市天力化學試劑有限公司。

FA-B/JA-N電子分析天平 上海佑科儀器儀表有限公司;DL-6M落地離心機 湖南星科科學儀器有限公司;PHS-3精密pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司;2WAJ型阿貝折射儀 上海光學儀器五廠;SHZ-C型水浴恒溫振蕩器 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠;101型電熱鼓風干燥箱 北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司;LC-10A高效液相色譜儀 日本島津公司。

1.2測定指標及方法

1.2.1 工藝流程

1.2.2 橡子粉去單寧實驗 常規(guī)水浸提法[14]。

1.2.3 液化適宜DE值范圍的確定 將橡子粉用水配制濃度為25%,調(diào)節(jié)pH到6.0～7.0,加入耐高溫α-淀粉酶16 U/g,于95 ℃水浴條件下液化不同時間后調(diào)酸升溫滅酶,分別測得DE值,將液化液冷卻至60 ℃左右,加入普魯蘭酶20 U/g,β-淀粉酶130 U/g糖化10 h左右后加入α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶1.5 U/g,水浴加熱35 h后滅酶,用HPLC法測(IG2+P+IG3)含量。以此確定液化的適宜DE值范圍。

1.2.4 液化單因素實驗 橡子粉用水分別配制濃度為10%、15%、20%、25%、30%,調(diào)節(jié)pH為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5,分別加入耐高溫α-淀粉酶8、16、24、32、40 U/g,在80、85、90、95、100 ℃水浴條件下分別加熱10、20、30、40、50 min后調(diào)酸升溫滅酶,測液化液DE值。

1.2.5 液化條件優(yōu)化實驗 在單因素實驗設計基礎上,根據(jù)中心組合實驗設計原理,以DE值為指標,設計4因素3水平Box-Benhnken響應面分析實驗[15],數(shù)據(jù)用Design-Expert軟件統(tǒng)計,確定最優(yōu)液化工藝參數(shù)。因素水平表如表1所示。

表1 Box-Benhnken實驗因素水平表Table 1 Factors and levels table of Box-Benhnken experimental design

1.2.6 糖化轉(zhuǎn)苷工藝的優(yōu)化 最佳條件下的液化液,分別加入普魯蘭酶5、10、15、20、25、30 U/g,β-淀粉酶40、70、100、130、160、190 U/g,在45、50、55、60、65 ℃水浴條件下糖化4、6、8、10、12、14 h后于80 ℃下加熱5 min滅酶后加入α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶1.5 U/g在55 ℃條件下水浴加熱35 h,測(IG2+P+IG3)含量,根據(jù)單因素實驗結(jié)果,進行L9(34)的正交實驗,獲取最佳糖化工藝條件;最后以(IG2+P+IG3)含量為指標,加入0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 U/g的α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶,在55 ℃條件下水浴加熱35 h,考察不同的α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶添加量對(IG2+P+IG3)含量的影響。

1.2.7 酶活力的測定 耐高溫α-淀粉酶酶活力的測定:參考GB/T 24401-2009;β-淀粉酶酶活力的測定:分光光度計法[16];普魯蘭酶酶活力的測定:分光光度計法[17]。

1.2.8 DE值的測定 參考GB/T 5009.7-2008《食品中還原糖含量的測定》直接滴定法;固形物含量的測定:采用阿貝折射儀,DE值按照公式(1)計算。

式(1)

1.2.9 低聚異麥芽糖中(IG2+P+IG3)含量的測定 LC-10A高效液相色譜儀檢測制備的低聚異麥芽糖中各糖組分含量。色譜條件為:色譜柱:Waters ultrahydrogel(7.8 mm×300 mm);柱溫:40 ℃;流動相:超純水;進樣量:10 μL;流速:0.8 mL/min。以標準樣品保留時間定性,以峰面積歸一化定量。

1.3數(shù)據(jù)處理

利用Design Expert 8.0軟件中的Box-Benhnken Design模型,對酶添加量、液化溫度、液化pH、底物濃度4個因素進行響應面分析,并對所獲得的響應面回歸模型進行顯著性檢驗;并采用Microsoft Excel 2003和Origin 8.6進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1液化實驗

2.1.1 液化適宜DE值范圍的確定 當DE值過低時,液化不完全導致液化液粘度大,反應效率降低,從而不利于接下來糖化的進行;而當DE值過大時,液化液中的糊精較多,不利于之后糖化過程中大量麥芽糖的產(chǎn)生,所以控制液化液的DE值范圍為10%～16%的反應進度[18]。由圖1可以看出,當DE值在7%～13%時,(IG2+P+IG3)含量是逐漸增加的,這是因為DE值較低時,呈近凝膠狀,且淀粉顆粒沒有水解為糊精等小分子物質(zhì),不利于下一步工藝的進行;當DE值在13%～17%時,(IG2+P+IG3)含量減少,這是因為DE值越大在糖化過程中會產(chǎn)生過多的葡萄糖致使(IG2+P+IG3)含量減少[19]。因此,以DE值13%為液化指標。

圖1 液化DE值與(IG2+P+IG3)含量的關(guān)系Fig.1 The relationship between DE of liquefying liquor and the content of(IG2+P+IG3)

2.1.2 單因素實驗

圖2 液化時間對液化液DE值的影響Fig.2 Effect of liquefying time on DE of liquefying liquor

2.1.2.1 液化時間對液化液DE值的影響 由圖2可以看出,隨著液化時間的增加,DE值也逐漸增大,當液化時間>40 min時,DE值增長變緩,其原因是耐高溫α-淀粉酶隨機水解淀粉內(nèi)部的α-1,4葡萄糖苷鍵,對長鏈淀粉水解速度比短鏈淀粉更快速且更有活性[20],當液化到一定時間時,液化液中的短鏈淀粉增多,因此水解速度變慢。與此同時,耐高溫α-淀粉酶先作用于直鏈淀粉而后作用于支鏈淀粉,生成葡萄糖、麥芽糖和糊精[21]。選定液化DE值在13%為宜,因此最佳液化時間在20～30 min。

2.1.2.2 液化溫度對液化液DE值的影響 由圖3可以看出,隨著液化溫度的高,DE值也逐漸增大,當溫度達95 ℃左右時酶活力達到最佳狀態(tài),且DE值達到最佳范圍。其原因為溫度對酶活性以及對淀粉的糊化作用破壞了其晶體結(jié)構(gòu)的影響。此時滿足DE值的要求,因此其最適液化溫度為95 ℃左右。

圖3 液化溫度對液化液DE值的影響Fig.3 Effect of liquefying temperature on DE of liquefying liquor

2.1.2.3 液化pH對液化液DE值的影響 由圖4可以看出,隨著pH的升高,DE值也逐漸增大,當pH升至6.5時,DE值達到最佳范圍,這是因為pH的變化影響著耐高溫α-淀粉酶的酶活力以及淀粉的糊化作用。故選取最適液化pH為6.5左右。

圖4 液化pH對液化液DE值的影響Fig.4 Effect of liquefying pH on DE of liquefying liquor

2.1.2.4 底物濃度對液化液DE值的影響 由圖5可以看出,隨著底物濃度的逐漸增大,DE值也逐漸增大,當?shù)孜餄舛冗_25%時,DE值達到最大值,且只有在最大底物濃度時才能達到最佳DE值范圍。底物濃度繼續(xù)增大,DE值開始下降,其原因為底物濃度過大時,由于橡子粉的獨特結(jié)構(gòu)性質(zhì),易形成膠凝體及結(jié)塊,不利于耐高溫α-淀粉酶對其進行酶解[22],故選擇最佳底物濃度為25%。

圖5 底物濃度對液化液DE值的影響Fig.5 Effect of the substrate content on DE of liquefying liquor

2.1.2.5 酶添加量對液化液DE值的影響 由圖6可以看出,隨著酶添加量的逐漸增加,DE值也逐漸增大,當酶添加量達到32 U/g時,DE值得到最大,之后稍微下降。這是由于隨著酶添加量的增加,水解作用就逐漸增強。選取DE值在13%,因此選擇耐高溫α-淀粉酶的添加量范圍為16 U/g左右最佳。

圖6 酶添加量對液化液DE值的影響Fig.6 Effect of the quantity of enzyme on DE of liquefying liquor

2.1.3 響應面優(yōu)化及結(jié)果分析 設計表2中29個實驗,中心實驗進行5次用來估計實驗誤差,其余為析因點?？刂频孜餄舛葹?5%。具體設計組合及實驗結(jié)果如表2所示。

表2 Box-Benhnken響應面實驗設計及結(jié)果Table 2 Box-Benhnken experimental design arrangement and results

表3 響應面實驗回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance with regression model

利用設計軟件Design-Expert對數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合,獲得液化時間(A)、液化溫度(B)、液化pH(C)和酶添加量(D)的二次多項回歸方程為:

DE(%)=13.04+0.47A+0.25B+0.088C+0.15D-1.47A2-0.92B2-0.44C2-0.33D2+0.21AB+0.09AC-0.32AD+0.065BC+0.21BD-0.16CD

以DE值13%為優(yōu)化目標值,得到最優(yōu)的液化條件為:液化時間31.1 min、液化溫度94.75 ℃、液化pH6.575、酶添加量13.44 U/g。

為檢驗實驗方案的準確性,結(jié)合生產(chǎn)實際,將各因素調(diào)整為:液化時間31 min、液化溫度95 ℃、液化pH6.6、酶添加量13 U/g。在此條件下通過5次平行實驗進行驗證,液化液的平均DE值為12.91%,與目標值較為吻合。

圖7中AB的曲面圖表明液化時間和液化溫度的交互作用較強,在液化pH為6.5、酶添加量為16 U/g時,若液化溫度一定,則隨著液化時間的增加,液化液DE值先增大后逐漸減小。若液化時間一定,則隨著液化溫度的升高,液化液DE值先增大后減小;AD的曲面圖表明液化時間和酶添加量的交互作用較強,在液化溫度為95 ℃、液化pH為6.5時,若酶添加量一定,則隨著液化時間的增加,液化液DE值先增大后趨于平穩(wěn)。若液化時間一定,則隨著酶添加量的增大,液化液DE值逐漸減小。

圖7 AB、AD交互作用對液化液DE值的影響Fig.7 Effects of AB and AD interaction on DE of liquefying liquor

2.2糖化轉(zhuǎn)苷實驗

2.2.1 糖化單因素實驗

圖8 普魯蘭酶添加量對(IG2+P+IG3)含量的影響Fig.8 Effect of the quantity of pullulanase on the content of(IG2+P+IG3)

2.2.1.1 普魯蘭酶及β-淀粉酶添加量對(IG2+P+IG3)含量的影響 由圖8和圖9可以看出,普魯蘭酶添加量的逐漸增加,會使(IG2+P+IG3)含量極速增大,在添加量為20 U/g時,(IG2+P+IG3)含量達到最大,此后稍有下降,這可能是因為普魯蘭酶在糖化體系中已達到飽和。普魯蘭酶作為一種脫支酶,添加量要適中,用量太少時不能夠切斷糊精中所有的α-1,6糖苷鍵,殘余的支鏈片段可能干擾β-淀粉酶和α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶的作用從而產(chǎn)生較多的葡萄糖,因此最佳普魯蘭酶添加量為20 U/g;β-淀粉酶是一種外切酶,從淀粉側(cè)鏈的非還原端開始水解相隔的α-1,4糖苷鍵,依次切下一個麥芽糖單位,但它不能水解α-1,6糖苷鍵[23],當β-淀粉酶添加量逐漸增加時,(IG2+P+IG3)含量也逐漸增大,當添加量達到130 U/g時,(IG2+P+IG3)含量達到最大,之后稍有下降。

圖9 β-淀粉酶添加量對(IG2+P+IG3)含量的影響Fig.9 Effect of the quantity of glucoamylase on the content of(IG2+P+IG3)

2.2.1.2 溫度對(IG2+P+IG3)含量的影響 由圖10可以看出,溫度為60 ℃時(IG2+P+IG3)含量達到最大,超過60 ℃后(IG2+P+IG3)含量下降可能是因為酶在溫度較高時被鈍化影響了酶的活性,因此最佳溫度為60 ℃。

圖10 溫度對(IG2+P+IG3)含量的影響Fig.10 Effect of temperature on the content of(IG2+P+IG3)

2.2.1.3 時間對(IG2+P+IG3)含量的影響 由圖11可以看出,當糖化時間超過10 h后,(IG2+P+IG3)含量開始趨于穩(wěn)定,這是因為反應至一定時間后,底物濃度會相對降低,所以酶反應也會減速,因此考慮生產(chǎn)效率問題,選擇10 h為最適糖化時間。

2.2.2 正交實驗及結(jié)果分析 由表4極差分析可知,因素對橡子粉糖化工藝的影響程度順序依次為:A>D>B>C,橡子粉糖化工藝過程最佳工藝條件為:A3B2C2D2,即普魯蘭酶添加量25 U/g、β-淀粉酶添加量130 U/g、溫度60 ℃、時間10 h,在此工藝條件下進行三次平行實驗后得到最佳條件下的(IG2+P+IG3)含量為36.11%±0.17%,此時橡子粉糖化效果最好。

表5 反應產(chǎn)物中低聚異麥芽糖成分Table 5 Elements of isomaltooligosaccharides products

圖11 時間對(IG2+P+IG3)含量的影響Fig.11 Effect of time on the content of(IG2+P+IG3)

注：G. Glucose(葡萄糖)；M. Maltose(麥芽糖);IG2. Isomaltose(異麥芽糖);P. Panose(潘糖);IG3. Isomaltotriose(異麥芽三糖)。

表4 正交實驗設計及結(jié)果Table 4 Design and results of orthogonal experiment

2.3轉(zhuǎn)苷實驗

α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶能催化雙糖、低聚糖和其他類似物的非還原端α-1,4糖苷鍵斷裂,釋放出D-葡萄糖;也能專一地進行糖苷鍵轉(zhuǎn)移反應,將葡萄糖苷轉(zhuǎn)移到糖類受體底物上形成α-1,6糖苷鍵。如圖12所示,隨著酶添加量的逐漸增加,通過HPLC檢測出IG2、P、IG3含量,觀察不同α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶添加量下的變化。酶添加量為1.5 U/g時,IG2、P、IG3含量達到最大,且異麥芽糖含量占的比例最大,之后隨著酶添加量增加逐漸減小,且異麥芽三糖所占比例越來越小,這是因為隨著轉(zhuǎn)苷酶添加量的增加,就有更多的轉(zhuǎn)苷酶將麥芽糖和麥芽三糖轉(zhuǎn)苷為異麥芽糖、潘糖和異麥芽三糖,但是α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶的作用底物可以為麥芽二糖～八糖,其中異麥芽糖、潘糖和異麥芽三糖都是其的底物,當酶過量時,就會開始降解異麥芽糖、潘糖和異麥芽三糖,其中的三糖開始降解為雙糖[24-25]。

圖12 α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶添加量對IG2、P、IG3含量的影響Fig.12 Effect of α-transglucosidase dosage on the content of IG2,P and IG3

當酶添加量為1.5 U/g,制得的樣品經(jīng)HPLC法檢測,由表5可以看出,樣品中以麥芽糖(M)居多,含有少量的葡萄糖(G)。麥芽糖含量為52.6%±0.14%,葡萄糖含量為11.13%±0.22%,(IG2+P+IG3)含量約為36.27%±0.18%。

3 結(jié)論

利用橡子粉制備低聚異麥芽糖,確定了液化最佳工藝條件為液化時間31 min、液化溫度95 ℃、pH6.6、耐高溫α-淀粉酶添加量13 U/g,此條件下所得液化液DE值為12.91%;糖化最佳工藝條件為糖化溫度60 ℃、糖化時10 h、加酶量(β-淀粉酶130 U/g,普魯蘭酶25 U/g),此條件下所得(IG2+P+IG3)含量為36.11%±0.17%;轉(zhuǎn)苷工藝過程最佳α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶添加量為1.5 U/g,制備的低聚異麥芽糖中異麥芽糖、潘糖和異麥芽三糖之和(IG2+P+IG3)為36.27%±0.18%,符合由中國發(fā)酵工業(yè)協(xié)會擬定的低聚異麥芽糖產(chǎn)品的相關(guān)標準,即異麥芽糖(IG2)、潘糖(P)、異麥芽三糖(IG3)占總糖的百分比之和≥35%[26]。

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Studyonthepreparationofisomalto-oligosaccharidebyenzymaticmethodsofacornstarch

ZHANGZhi1,LIQing1,HUAHong-ling1,YINWen-zhe2,LIJie3,MAJian-zhang1,*

(1.Northeast Forestry University,Harbin 150040,China; 2.Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University,Harbin 150086,China; 3.Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

With the acorn starch as raw material,the process of preparation of isomalto-oligosaccharide by enzymatic methods were optimized in order to increase the content of isomaltose,panose and isomaltotriose of isomalto-oligosaccharide. Box-Benhnken response surface analysis method was used to optimize the process conditions of liquefying acorn starch with thermostableα-amylase.The results showed that the DE value of 13% as the best liquefaction index,the optimal liquefaction conditions were 31 min of liquefaction time,95 ℃ of liquefaction temperature,6.6 of liquefying pH value,13 U/g of thermostableα-amylase,at this point,in combination with the production practice,the value of the liquefied liquid DE was 12.91%,then through single factor experiments,the process conditions of saccharifying acorn starch liquefying liquor with pullulanase and glucoamylase were investigated,the saccharification conditions were optimized to be 25 U/g of pullulanase,130 U/g of glucoamylase,60 ℃ of saccharification temperature and 10 h of saccharification time,at this optimal condition,the content of(IG2+P+IG3)was predicted to 36.11%±0.17%,the optimum concentration ofα-glucosidase in transglycosylation process was 1.5 U/g,under the optimal condition,the total content of isomaltose,panose,and isomaltotriose were 36.27%±0.18%.

isomalto-oligosaccharide;acorn starch;liquefaction;saccharification;transglycosylation;technology

2017-03-10

張智 (1964-)，女，博士，教授，研究方向：微生物于發(fā)酵工程,E-mail:ldzhangzhi@163.com。

*

馬建章 (1937-)，男，博士，院士，研究方向：野生動物生態(tài)與管理,E-mail:lq_233@163.com。

大熊貓益生菌制劑的研究(SG1409);黑龍江省應用技術(shù)研究與開發(fā)計劃項目(GA15B203)。

TS210.9

B

1002-0306(2017)21-0151-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.21.031