,,,,,

(中國(guó)藥科大學(xué)工學(xué)院,江蘇南京 211198)

肉桂醛對(duì)熒光假單胞菌生物膜形成的抑制作用

綦國(guó)紅,井佳麗,楊志萍,陳貴堂,王海翔,程抒劼

(中國(guó)藥科大學(xué)工學(xué)院,江蘇南京 211198)

本文擬研究肉桂醛在非抑菌濃度條件下對(duì)熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)FML05-2生物膜形成的抑制作用。首先測(cè)定了肉桂醛對(duì)模式細(xì)菌紫色桿菌(Chromobacteriumviolaceum)CVO26紫色素產(chǎn)生的影響;再對(duì)熒光假單胞菌FML05-2形成的生物膜以及與生物膜形成有關(guān)的重要因素胞外多糖進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果表明:在非抑菌濃度40、20 μg/mL條件下,肉桂醛對(duì)紫色桿菌CVO26紫色素的產(chǎn)生具有抑制作用,抑制率分別為31.53%、17.90%;對(duì)熒光假單胞菌FML05-2生物膜形成的抑制率分別為44.22%、21.77%;對(duì)熒光假單胞菌FML05-2胞外多糖產(chǎn)生的抑制率分別為15.72%、5.34%。因此,肉桂醛在非抑菌濃度條件下對(duì)熒光假單胞菌FML05-2生物膜的形成具有抑制作用。

肉桂醛,群體感應(yīng)抑制,熒光假單胞菌,生物膜,胞外多糖

細(xì)菌生物膜(biofilm,BF)是細(xì)菌為了適應(yīng)環(huán)境和維持自身生命而形成的形如膜狀的結(jié)構(gòu),保護(hù)膜內(nèi)細(xì)菌免受外界惡劣環(huán)境的影響,為細(xì)菌生長(zhǎng)提供天然屏障。食品腐敗菌以及食源性致病菌常常通過形成生物膜附著在食品、食品加工設(shè)備、包裝材料等表面,難以消殺與清除,從而形成持續(xù)性的污染,成為食品安全的一大隱患[1-2]。因此研究如何減少食源性致病菌與食品腐敗菌生物膜的形成具有重要意義。研究表明細(xì)菌生物膜的形成受群體感應(yīng)現(xiàn)象調(diào)控[3-5],因此可以通過群體感應(yīng)抑制原理來減少或抑制生物膜的產(chǎn)生,此方法不同于基于抑菌與殺菌而抑制目標(biāo)菌生物膜的形成的原理,不會(huì)導(dǎo)致抗性菌株的產(chǎn)生。目前研究較多的群體感應(yīng)抑制方法是利用群體感應(yīng)抑制劑即群體感應(yīng)信號(hào)分子的類似物來干擾群體感應(yīng)現(xiàn)象,從而減少或抑制由群體感應(yīng)現(xiàn)象調(diào)控的目標(biāo)性狀的表達(dá)[6-7]。

肉桂醛(cinnamaldhyde),又名桂皮醛,有獨(dú)特的香味,是肉桂揮發(fā)油的主要活性物質(zhì)。研究表明,肉桂醛對(duì)食源性致病菌大腸桿菌、李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌以及導(dǎo)致番茄、胡蘿卜等霉變的霉菌等均具有很好的抑制作用[8-10];對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、煙曲霉菌等產(chǎn)生的生物膜也具有抑制作用[8,10]。國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道,肉桂醛對(duì)歐文氏菌、耶爾森氏菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)具有抑制作用[11],但對(duì)熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)群體感應(yīng)抑制作用目前國(guó)內(nèi)外未見報(bào)道。

熒光假單胞菌是一種典型的嗜冷菌,是導(dǎo)致食品腐敗的常見細(xì)菌,多數(shù)菌株生長(zhǎng)過程中產(chǎn)生生物膜。且該菌生物膜的形成受其自身群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控[12-13]。本文基于群體感應(yīng)抑制的原理研究肉桂醛在非抑菌濃度條件下對(duì)熒光假單胞菌生物膜形成的抑制作用,研究的視角不同于已有的研究,即在抑菌條件下對(duì)食品腐敗菌生物膜形成的抑制作用,從而揭示肉桂醛對(duì)熒光假單胞菌群體感應(yīng)的抑制作用。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

菌種與培養(yǎng)條件：熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)FML05-2產(chǎn)生生物膜與N-?；呓z氨酸內(nèi)酯類信號(hào)分子[12];紫色桿菌(Chromobacteriumviolaceum)CVO26,是工程菌株,不產(chǎn)生N-己酰高絲氨酸內(nèi)酯,也不產(chǎn)生紫色色素,并且色素的產(chǎn)生受N-己酰高絲氨酸內(nèi)酯(N-hexanoyl-homoserine lactone,C6-HSL)信號(hào)分子的調(diào)控[12]。二者均使用LB培養(yǎng)基(氯化鈉10 g,胰蛋白胨10 g,酵母粉5 g,蒸餾水1 L,pH7.0)于28 ℃ 150 r/min振蕩培養(yǎng)。紫色桿菌CVO26培養(yǎng)時(shí)添加卡那霉素至終濃度為20 μg/mL。

肉桂醛分析標(biāo)準(zhǔn)品≥99.5%(GC) Aladdin試劑公司;C6-HSL Sigma公司;硫酸卡那霉素注射液 四川華蜀動(dòng)物藥業(yè)有限責(zé)任公司;二甲基亞砜(AP) 上海泰坦化學(xué)有限公司;苯酚(AP) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;濃硫酸(AP) 南京化學(xué)試劑股份有限公司。

FLX800多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)伯騰儀器有限公司;TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;Microscope Eclipse 80i光學(xué)顯微鏡 日本Nikon;CR21G 高速冷凍離心機(jī) 日立高新技術(shù)公司;HZC-250恒溫振蕩培養(yǎng)箱 蘇州太倉(cāng)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 肉桂醛溶液的制備 取2.00 mg肉桂醛溶于1 mL 1%的二甲基亞砜溶液中,得到濃度為2000 μg/mL的肉桂醛母液,-20 ℃保存?zhèn)溆?。肉桂醛測(cè)試濃度用無菌LB培養(yǎng)基對(duì)母液按比例進(jìn)行稀釋。

1.2.2 對(duì)紫色桿菌CVO26、熒光假單胞菌FML05-2最小抑菌濃度(MIC)的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[4]將活化好的菌液按2%比例接種于無菌新鮮LB培養(yǎng)基中,培養(yǎng)至菌體密度OD600 nm約為0.4,取4.5 mL的菌液分裝于標(biāo)記好的無菌大試管中,加入0.5 mL不同濃度的肉桂醛溶液,對(duì)照組為等量無菌LB培養(yǎng)基,于28 ℃,150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h,觀察菌液是否渾濁,同時(shí)測(cè)定菌液OD600 nm值,確定MIC。

1.2.3 對(duì)紫色桿菌CVO26、熒光假單胞菌FML05-2的生長(zhǎng)抑制作用 參照文獻(xiàn)[4],按1.2.2方法制備含有不同濃度肉桂醛的菌液,分別于0、2、4、6、8、10、12 h時(shí)取200 μL培養(yǎng)液加入96孔板中,用酶標(biāo)儀測(cè)定OD630 nm值,取三次測(cè)量數(shù)值的平均值,繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.4 對(duì)紫色桿菌CVO26紫色素產(chǎn)生的抑制作用 參照文獻(xiàn)[5]按1.2.2方法制備含有不同濃度肉桂醛的CVO26菌液,肉桂醛的最終質(zhì)量濃度為20、40 μg/mL,對(duì)照組為無菌LB培養(yǎng)基。同時(shí)添加C6-HSL至終濃度為5 μmol/mL,于28 ℃,150 r/min振蕩培養(yǎng)約7 h。取3 mL培養(yǎng)液10000 r/min 4 ℃離心10 min,棄上清,加入3 mL二甲基亞砜,充分混勻。10000 r/min 4 ℃離心10 min,取上清,分光光度計(jì)測(cè)定580 nm吸光度。按下式計(jì)算紫色素抑制率:

抑制率(%)=(對(duì)照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值)/對(duì)照組OD值×100

1.2.5 對(duì)熒假單胞菌FML05-2生物膜形成的抑制作用 光學(xué)顯微鏡對(duì)生物膜的定性觀察,根據(jù)文獻(xiàn)[5],按1.2.2方法制備含有不同濃度肉桂醛的菌液,分裝于錐形瓶中,將1.5 cm×1.5 cm的無菌玻璃片置于錐形瓶?jī)?nèi),28 ℃靜置培養(yǎng)48 h后,棄培養(yǎng)液,添加含有肉桂醛的新鮮LB培養(yǎng)基后繼續(xù)靜置培養(yǎng)48 h。取出玻璃片,無菌水沖洗表面浮菌,45 ℃干燥30 min,0.2%的結(jié)晶紫溶液染色2 min。無菌水洗掉多余的染色劑,45 ℃干燥30 min。用光學(xué)顯微鏡觀察,拍照。對(duì)生物膜的定量測(cè)定,參照文獻(xiàn)[6],按上述方法操作,無菌輸液管片代替玻璃片。輸液管片45 ℃干燥后,用無水乙醇洗脫3 min,取200 μL洗脫液加入96孔板中,酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm處的吸光度。按1.2.4方法計(jì)算抑制率。

1.2.6 對(duì)熒光假單胞菌FML05-2胞外多糖的抑制作用 按1.2.2的方法制備含有肉桂醛的菌液,28 ℃振蕩培養(yǎng)24 h。取菌液10000 r/min 4 ℃離心30 min,取上清,加入上清液3倍體積的冷乙醇,4 ℃靜置24 h,12000 r/min 4 ℃離心10 min,得沉淀,2倍體積的蒸餾水稀釋沉淀,參照苯酚硫酸法[14]進(jìn)行測(cè)定,即2 mL樣品溶液加入1 mL 5%的苯酚溶液,再加入5 mL的濃硫酸,充分搖勻,靜止30 min后于490 nm處測(cè)量吸光度,蒸餾水對(duì)照,按1.2.4方法計(jì)算抑制率。

2 結(jié)果與分析

2.1對(duì)紫色桿菌CVO26和熒光假單胞菌FML05-2最小抑菌濃度(MIC)

觀察紫色桿菌CVO26與熒光假單胞菌FML05-2在含有不同濃度肉桂醛的培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況,同時(shí)測(cè)定培養(yǎng)物的OD600 nm值,確定紫色桿菌CVO26的MIC為100 μg/mL,熒光假單胞菌FML05-2的MIC為150 μg/mL。

2.2對(duì)紫色桿菌CVO26和熒光假單胞菌FML05-2生長(zhǎng)抑制作用

為進(jìn)一步驗(yàn)證肉桂醛在MIC濃度以下對(duì)CVO26的抑制作用,對(duì)其生長(zhǎng)曲線進(jìn)行了測(cè)定,并與對(duì)照進(jìn)行了顯著性檢驗(yàn),結(jié)果表明(圖1),肉桂醛濃度≤40 μg/mL時(shí),紫色桿菌CV026的生長(zhǎng)趨勢(shì)與對(duì)照組無顯著差異(p>0.05),即肉桂醛在此濃度下對(duì)其生長(zhǎng)沒有抑制作用;而肉桂醛濃度≥50 μg/mL時(shí),生長(zhǎng)情況與對(duì)照相比有顯著差異(p<0.05)(50 μg/mL以上濃度數(shù)據(jù)未顯示)。

圖1 肉桂醛對(duì)CVO26的生長(zhǎng)抑制作用Fig.1 The growth inhibition of cinnamalhyde to CVO26

用同樣的方法,對(duì)熒光假單胞菌FML05-2的生長(zhǎng)曲線進(jìn)行了測(cè)定和分析,結(jié)果(圖2)表明,肉桂醛濃度在≤40 μg/mL時(shí)對(duì)熒光假單胞菌FML05-2生長(zhǎng)無抑制作用,與對(duì)照無顯著性差異(p>0.05),而濃度為50 μg/mL 時(shí)對(duì)FML05-2生長(zhǎng)具有抑制作用,與CVO26一樣其抑制作用主要發(fā)生在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,而到達(dá)穩(wěn)定期時(shí)菌液的OD630 nm值與對(duì)照無顯著差異。因此后續(xù)肉桂醛對(duì)二菌的測(cè)試濃度均確定為≤40 μg/mL。

圖2 肉桂醛對(duì)FML05-2的生長(zhǎng)抑制作用Fig.2 The growth inhibition of cinnamalhyde to FML05-2

2.3對(duì)紫色桿菌CVO26紫色素產(chǎn)生的抑制作用

由圖3可知,肉桂醛在非抑菌濃度條件下對(duì)CVO26紫色素的產(chǎn)生具有抑制作用,并且隨肉桂醛濃度的增加紫色素的抑制率也隨之增加,濃度為40 μg/mL時(shí)抑制率達(dá)31.53%。

圖3 肉桂醛對(duì)CVO26紫色素產(chǎn)生的抑制作用Fig.3 Violacein production inhibition in CVO26 by cinnamaldhyde

2.4對(duì)熒光假單胞菌FML05-2生物膜產(chǎn)生的抑制作用

利用光學(xué)顯微鏡在400倍條件下對(duì)細(xì)胞爬片上的生物膜形態(tài)進(jìn)行觀察,結(jié)果表明(圖4),肉桂醛對(duì)熒光假單胞菌FML05-2生物膜的形成具有抑制作用,生物膜上的細(xì)胞密度、細(xì)胞團(tuán)塊的大小隨著肉桂醛濃度的升高而降低。當(dāng)肉桂醛濃度為40 μg/mL時(shí),膜上細(xì)胞密度變得很稀疏。為進(jìn)一步驗(yàn)證肉桂醛對(duì)生物膜的抑制作用,進(jìn)行了定量測(cè)定。結(jié)果如圖5所示,生物膜的抑制率隨著肉桂醛濃度的升高而增大,40 μg/mL時(shí)達(dá)到44.22%,與顯微鏡觀察結(jié)果相吻合。

圖4 肉桂醛對(duì)FML05-2生物膜形成的抑制作用(400×)Fig.4 Inhibition of cinnamalhyde on biofilm formation of FML05-2(400×)注:A:對(duì)照;B:20 μg/mL;C:30 μg/mL;D:40 μg/mL。

圖5 肉桂醛對(duì)FML05-2生物膜形成的抑制作用Fig.5 Inhibition of cinnamalhyde on biofilm formation of FML05-2

2.5對(duì)熒光假單胞菌FML05-2胞外多糖產(chǎn)生的抑制作用

胞外多糖是構(gòu)成生物膜的重要成分,影響生物膜產(chǎn)生的因素也會(huì)影響胞外多糖的產(chǎn)生,因此對(duì)熒光假單胞菌FML05-2胞外多糖的產(chǎn)生進(jìn)行了測(cè)定,由圖6可知,肉桂醛在不抑制熒光假單胞菌胞生長(zhǎng)的情況下對(duì)其胞外多糖的產(chǎn)生具有抑制作用,且隨著濃度增加,抑制率隨之增加,40 μg/mL時(shí)抑制率為15.72%。

圖6 肉桂醛對(duì)FML05-2胞外多糖產(chǎn)生的抑制作用Fig.6 Inhibition of EPS production to FML05-2 by cinnamalhyde

3 結(jié)論

本文首先利用群體感應(yīng)抑制研究的模式菌紫色桿菌CVO26對(duì)肉桂醛的群體感應(yīng)抑制活性進(jìn)行了初步測(cè)定,發(fā)現(xiàn)肉桂醛具有抑制其紫色素產(chǎn)生的能力,40 μg/mL時(shí)抑制率為31.53%。然后研究了肉桂醛在非抑菌濃度條件下對(duì)熒光假單胞菌FML05-2生物膜形成的抑制作用,發(fā)現(xiàn)肉桂醛處理導(dǎo)致生物膜結(jié)構(gòu)松散,細(xì)胞密度與細(xì)胞團(tuán)塊大小明顯降低;對(duì)生物膜定量測(cè)定結(jié)果表明40 μg/mL時(shí)生物膜抑制率為44.22%;對(duì)生物膜的主要構(gòu)成成分胞外多糖進(jìn)行測(cè)定,40 μg/mL時(shí)胞外多糖的抑制率為15.72%。因此,肉桂醛對(duì)熒光假單胞菌FML05-2生物膜形成具有抑制作用,此種作用不是由于肉桂醛對(duì)FML05-2抑制生長(zhǎng)所致,而是通過對(duì)其群體感應(yīng)抑制作用所致。

[1]張曙梅,徐向榮,徐浩. 細(xì)菌生物膜群體感應(yīng)系統(tǒng)研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通報(bào),2016,32(12):1-6.

[2]張翼,陳雅蘅,周幗萍,等. 克羅諾桿菌(原阪崎腸桿菌)的生物膜檢測(cè)和藥敏性分析[J].食品科學(xué),2015,36(21):129-134.

[3]You J L,Xue X L,Cao L X,et al. Inhibition of Vibrio biofilm formation by a marine actinomycete strain A66[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2007,76(5):1137-1144.

[4]Packiavathy I A S V,Agilandeswari P,Musthafa K S,et al. Inhibition of biofilm development of uropathogens by curcumin-An anti-quorum sensing agent from Curcuma longa[J]. Food Chemistry,2014,148:453-460.

[5]Abraham S V P I,Palani A,Ramaswamy B R,et al. Anti-quorum sensing and antibiofilm potential of Capparisspinosa[J]. Archives of Medical Research,2011,42:658-668.

[6]Packiavathy I A S V,Agilandeswari P,Musthafa k S,et al. Antibiofilm and quorum sensing inhibitory potential of Cuminumcyminum and its secondary metabolite methyl eugenol against Gram negative bacterial pathogens[J]. Food Research International,2012,45:85-92.

[7]Rasmussen T B,Bjarnsholt T,Skindersoe M E,et al. Screening for Quorum-Sensing Inhibitors(QSI)by Use of a Novel Genetic System,the QSI Selector[J]. Journal of Bacteriology,2005,187(5):1799-1814.

[8]張赟彬,劉笑宇,姜萍萍,等. 肉桂醛對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌作用及抑菌機(jī)理研究[J]. 現(xiàn)代食品科技,2015,31(5):31-35.

[9]索標(biāo),盧楊柳,王娜,等.肉桂醛對(duì)豬肉糜中單核細(xì)胞增生李斯特菌的抑制作用及其機(jī)制[J].食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào),2016,7(6):2211-2214.

[10]鄔麗紅,陳一強(qiáng),孔晉亮,等.肉桂醛對(duì)煙曲霉菌體外生物膜的影響[J].重慶醫(yī)學(xué),2016,45(3):326-328.

[11]Truchado P,Tomás-Barberán F A,Larrosa M,et al. Food phytochemicals act as Quorum Sensing inhibitors reducing production and/or degrading autoinducers of Yersinia enterocolitica and Erwinia carotovora[J]. Food Control,2012,24:78-85.

[12]綦國(guó)紅,董明盛,陳曉紅,等.魚源假單胞菌群體感應(yīng)信號(hào)分子與腐敗特性相關(guān)關(guān)系研究[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2007,40(7):1486-1491.

[13]Myszka K,Schmidt M T,Majcher M,et al. Inhibition of quorum sensing-related biofilm ofPseudomonasfluorescensKM121 by Thymus vulgare essential oil and its major bioactive compounds[J]. International Biodeterioration & Biodegradation,2016,114:252-259.

[14]張惟杰.糖復(fù)合物生化研究技術(shù)[M].杭州:浙江大學(xué)出版社,1994:102.

InhibitionofbiofilmformationinPseudomonasfluorescensbycinnamaldhyde

QIGuo-hong,JINGJia-li,YANGZhi-ping,CHENGui-tang,WANGHai-xiang,CHENGShu-jie

(School of Engineering,China Pharmaceutical University,Nanjing 211198,China)

To study the inhibition of development of biofilm inPseudomonasfluorescensFML05-2 by cinnamaldhyde at the non inhibitory concentration. Firstly,it was studied that the effect of the cinnamaldhyde on the purple pigment production byChromobacteriumviolaceumCVO26 as model bacteria,then determined the biofilm formation and extracellular polysaccharide(EPS)production that was important factors correlated with the biofilm formation inP.fluorescensFML05-2. The results indicated that the cinnamaldhyde inhibited the purple pigment production ofC.violaceumCVO26,the inhibition rates were 31.53% and 17.90%,respectively. The inhibition rates of the biofilm development were 44.22%,21.77%,the inhibition rates of EPS production were 15.72%,5.34% inP.fluorescensFML05-2 at the non inhibitory concentration of 40 μg/mL and 20 μg/mL. The results suggest that the cinnamaldhyde can inhibit the development of biofilm inP.fluorescensFML05-2 at the non inhibitory concentration

cinnamaldhyde;quorumsensing inhibition;Pseudomonasfluorescens;biofilm;extracellular polysaccharide

2016-12-23

綦國(guó)紅(1972-)，女，博士，副教授，研究方向：食品微生物與生物技術(shù)，E-mail：qghcpu@163.com。

細(xì)菌群體感應(yīng)對(duì)魚蝦腐敗過程的調(diào)控作用及其分子機(jī)制(30700627)。

TS255.1

A

1002-0306(2017)21-0147-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.21.030