, ,,，,,*

(1.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,廣東廣州 510640; 2.浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院,浙江杭州 310058)

凝結(jié)芽孢桿菌13002高密度培養(yǎng)

孫麗娜1,金迅1,2,周全興1，周勁松1,劉冬梅1,*

(1.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,廣東廣州 510640; 2.浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院,浙江杭州 310058)

本實(shí)驗(yàn)旨在通過優(yōu)化培養(yǎng)條件提高凝結(jié)芽孢桿菌13002發(fā)酵培養(yǎng)液中的菌體濃度,為生產(chǎn)高光學(xué)純度L-乳酸奠定基礎(chǔ)。通過單因素實(shí)驗(yàn),最陡爬坡實(shí)驗(yàn),Box-Behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)確定凝結(jié)芽孢桿菌13002的最優(yōu)培養(yǎng)基配方和最佳培養(yǎng)條件,并于自動(dòng)發(fā)酵罐中進(jìn)行高密度分批補(bǔ)料培養(yǎng)。結(jié)果表明,最優(yōu)培養(yǎng)基配方為:葡萄糖20 g/L、細(xì)菌學(xué)蛋白胨10 g/L、酵母提取粉25 g/L、NaCl 10 g/L,初始pH6.5。在此優(yōu)化條件下,以6%的接種量,培養(yǎng)溫度45 ℃,培養(yǎng)至16 h,以0.5 g/(L·h)速率添加補(bǔ)料至結(jié)束,最大菌體濃度達(dá)5.399 g/L,活菌總數(shù)為3.095×109CFU/mL,最終凍干后達(dá)0.730×1011CFU/g。

凝結(jié)芽孢桿菌13002,高密度培養(yǎng),響應(yīng)面,分批補(bǔ)料培養(yǎng)

凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)[1]為革蘭氏陽性菌,兼性厭氧,菌體呈桿狀,芽孢端生,無鞭毛。最適生長溫度為40～50 ℃,最適生長pH為6.6～7.0,具備耐高溫、耐膽鹽、耐酸等抗逆性[2],發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸。L-乳酸可用于食品、輕化工行業(yè)、生物醫(yī)學(xué)材料[3-5],應(yīng)用前景廣闊。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)乳酸工藝簡單,產(chǎn)物低廉,毒副產(chǎn)物少,是L-乳酸生產(chǎn)的主要方法[6-9]。

近年來,國內(nèi)外對于凝結(jié)芽孢桿菌的研究重點(diǎn)在于如何用低廉易獲得的培養(yǎng)基獲得高密度培養(yǎng)的凝結(jié)芽孢桿菌菌體。高密度培養(yǎng)技術(shù)(HCDC,high cell density culture)[10-11]指的是模擬人體生長環(huán)境,使細(xì)胞在特定細(xì)胞生物反應(yīng)器中快速增長,從而充分提高菌體的發(fā)酵密度和生物量,或增加特定代謝產(chǎn)物的比生長率的一種培養(yǎng)技術(shù)。其中,分批補(bǔ)料培養(yǎng)(fed-batch culture)指在培養(yǎng)的某些階段中,不定期地添加物料,使菌體及其代謝產(chǎn)物能夠持續(xù)增長的培養(yǎng)技術(shù);這是目前針對益生菌進(jìn)行高密度培養(yǎng)最完善、最常用的方式[12]。

課題組前期篩選分離得到的一株芽孢桿菌13002,經(jīng)鑒定為凝結(jié)芽孢桿菌;經(jīng)急性毒理實(shí)驗(yàn)證實(shí)安全無毒;經(jīng)手性柱分析其代謝的乳酸,其中L-乳酸的光學(xué)純度達(dá)99%[13]。在此基礎(chǔ)上,本研究對凝結(jié)芽孢桿菌13002進(jìn)行高密度培養(yǎng),有利于該菌的深入研究及L-乳酸的生產(chǎn),具有良好的工業(yè)化生產(chǎn)前景。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillussp.)13002 由華南理工大學(xué)食品質(zhì)量與安全實(shí)驗(yàn)室從豆瓣醬中分離篩選得到,并于2013年4月12日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心,保藏編號(hào)為CGMCC NO.7431。

種子培養(yǎng)基:細(xì)菌學(xué)蛋白胨10.0 g,酵母提取粉5.0 g,葡萄糖20.0 g,NaCl 10.0 g,蒸餾水1000 mL,混合均勻后,調(diào)節(jié)pH至6.5,再于121 ℃下滅菌15 min。

計(jì)數(shù)培養(yǎng)基:種子培養(yǎng)基添加2%的瓊脂,121 ℃高溫滅菌15 min后冷卻備用。

JJ200Y型電子天平 美國雙杰兄弟有限公司;KDC-40型生化培養(yǎng)箱 安徽科大有限公司;MK3型超凈工作臺(tái) 上海日島有限公司;JW-3021HR型高速冷凍離心機(jī) 安徽嘉文有限公司;pHS-3C型精密pH計(jì) 上海儀電有限公司;752S型紫外可見分光光度計(jì) 上海棱光技術(shù)有限公司;Biostat Aplus 5L自動(dòng)發(fā)酵罐系統(tǒng) 德國布朗有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化 將在斜面培養(yǎng)基上低溫保存的菌種接種到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,45 ℃、180 r/min下?lián)u瓶培養(yǎng)24 h;再進(jìn)行二級活化,接種濃度為6%(v/v);活化后得到種子液,于45 ℃靜置備用。

1.2.2 分析方法

1.2.2.1 菌體濃度的測定 參考文獻(xiàn)[14]中的方法,建立標(biāo)準(zhǔn)曲線:取2.5 mL菌液于離心管中,6000 r/min離心10 min,用生理鹽水將菌體沉淀洗滌2次;將菌體稀釋適當(dāng)倍數(shù)后,以生理鹽水為空白對照,測定OD600 nm,使所測吸光值在0.2～0.8之間,將OD600 nm,作為橫坐標(biāo),菌體濃度(g/L)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

菌體濃度測定:取5 mL發(fā)酵培養(yǎng)液,其它處理同標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算得到樣品菌體濃度。

1.2.2.2 活菌總數(shù)(CFU/mL)測定 參考文獻(xiàn)[14]中的方法,建立標(biāo)準(zhǔn)曲線:取活化好的種子液,使用無菌生理鹽水梯度稀釋后取100 μL于計(jì)數(shù)培養(yǎng)基上涂布;45 ℃培養(yǎng)48 h,進(jìn)行菌落計(jì)數(shù);取活化好的種子液,使用無菌生理鹽水梯度稀釋,取不同稀釋倍數(shù)的的菌液,以生理鹽水為空白對照,測OD600 nm。以O(shè)D600 nm為橫坐標(biāo),與之對應(yīng)的菌落總數(shù)(CFU/mL)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

活菌總數(shù)測定:取5 mL發(fā)酵培養(yǎng)液,其它處理同標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算得樣品活菌總數(shù)(CFU/mL)。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.3.1 生長曲線建立 取活化好的種子液,6%(v/v)接種后于45 ℃、180 r/min搖瓶培養(yǎng);測定初始菌體濃度所對應(yīng)的吸光值,每間隔2 h測定一次,至24 h培養(yǎng)結(jié)束,以時(shí)間(h)為橫坐標(biāo),菌體濃度(g/L)為縱坐標(biāo),繪制生長曲線。

1.2.3.2 培養(yǎng)基優(yōu)化 碳源、氮源、無機(jī)鹽優(yōu)化:選取葡萄糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉作為實(shí)驗(yàn)碳源,設(shè)定濃度值均為20 g/L;細(xì)菌學(xué)蛋白胨、酵母提取粉、牛肉浸膏、NH4Cl、(NH4)2SO4作為實(shí)驗(yàn)氮源,設(shè)定濃度值均為10 g/L;將活化好的種子液分別接種到不同種類的碳源、氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基中;按照1.2.3.1中條件培養(yǎng)24 h,測OD600 nm,計(jì)算菌體濃度。選取NaCl作為實(shí)驗(yàn)無機(jī)鹽,在無機(jī)鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,分別使NaCl濃度達(dá) 5、10、15 g/L;按照1.2.3.1中條件培養(yǎng)24 h,測OD600 nm,計(jì)算菌體濃度。

碳氮比優(yōu)化:根據(jù)不同種類碳源、氮源的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,確定最陡爬坡實(shí)驗(yàn)的方向和步長,設(shè)計(jì)最陡爬坡實(shí)驗(yàn)[15],如表2～表5所示;根據(jù)確定的實(shí)驗(yàn)顯著因素和中心點(diǎn),采用Design-Expert 8.0.5軟件設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn),如表1所示,將得到的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合,得到響應(yīng)變量與自變量之間的關(guān)系模型,找出利于菌種生長最優(yōu)碳氮比例。

表1 Box-Behnken Design因素水平表Table 1 The factors and levels table of Box-Behnken Design

1.2.3.3 培養(yǎng)條件優(yōu)化 pH優(yōu)化：選用Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液,設(shè)置pH為6.2、6.5、6.7、6.9、7.2;將活化好的種子液分別接種到不同pH的培養(yǎng)基中;按照1.2.3.1中條件培養(yǎng)24 h,測OD600 nm,選擇利于菌種增長的最優(yōu)pH。

培養(yǎng)溫度優(yōu)化：選取30、35、40、45、50 ℃作為實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)溫度;按照1.2.3.1中條件培養(yǎng)24 h,測OD600 nm,選用利于菌種增長的最優(yōu)培養(yǎng)溫度。

1.2.3.4 培養(yǎng)優(yōu)化驗(yàn)證 對優(yōu)化后菌種建立生長曲線,并與優(yōu)化前的進(jìn)行比較。

1.2.3.5 分批補(bǔ)料培養(yǎng) 搖瓶分批補(bǔ)料培養(yǎng)：根據(jù)菌種生長曲線確定其對數(shù)生長期及穩(wěn)定期;用優(yōu)化后的培養(yǎng)基培養(yǎng)菌種到其對數(shù)生長末期,采用最優(yōu)碳氮比進(jìn)行恒速流加[16]補(bǔ)料;分別以0.5、1.0、1.5 g/(L·h)(以葡萄糖計(jì))3種補(bǔ)料速率向培養(yǎng)液中添加補(bǔ)料液,自16 h開始,每4 h添加補(bǔ)料一次,培養(yǎng)至28 h結(jié)束,于每次補(bǔ)料前和發(fā)酵結(jié)束時(shí)測定OD值,計(jì)算菌體濃度,比較不同補(bǔ)料速率對菌種生長的影響,選用利于菌種增長的最優(yōu)補(bǔ)料速率。

自動(dòng)發(fā)酵罐分批補(bǔ)料培養(yǎng)：在4 L自動(dòng)發(fā)酵罐中,以最優(yōu)條件進(jìn)行培養(yǎng)至菌種對數(shù)生長末期,以最優(yōu)補(bǔ)料速率向培養(yǎng)液中添加補(bǔ)料液,計(jì)算菌體濃度;比較搖瓶和自動(dòng)發(fā)酵罐分批補(bǔ)料培養(yǎng)對菌種增長影響和區(qū)別。

1.2.3.6 凝結(jié)芽孢桿菌13002菌粉制備 取上述發(fā)酵罐培養(yǎng)所得的培養(yǎng)液;再經(jīng)離心、添加保護(hù)劑、真空冷凍干燥等步驟得凍干菌粉,最后進(jìn)行活菌數(shù)測定[17]。

凍干菌粉活菌數(shù)測定步驟為:取待測樣品凍干菌粉0.1 g,放置于超凈工作臺(tái)上進(jìn)行操作,添加10 mL無菌生理鹽水,靜置20 min使其復(fù)水,然后再采用稀釋涂布平板法測定菌粉中活菌總數(shù),單位質(zhì)量活菌數(shù)(CFU/g)=干燥后的活菌數(shù)/添加菌粉質(zhì)量。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 采用Design-Expert 8.0.5軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析;采用Microsoft Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算及繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1凝結(jié)芽孢桿菌13002的生長曲線

凝結(jié)芽孢桿菌13002的生長曲線如圖1所示。

圖1 凝結(jié)芽孢桿菌13002生長曲線Fig.1 The growth curve of Bacillus 13002

由圖1可以看出,從0～4 h,菌體濃度上升緩慢,處于調(diào)整期,是培養(yǎng)基接種之后的一個(gè)適應(yīng)期,生長遲緩;從4～16 h,菌體濃度迅速上升,從0.202 g/L驟增到2.333 g/L,該階段菌種處于對數(shù)期,細(xì)胞高速生長繁殖;從16 h開始,菌體濃度波動(dòng)減緩至趨于平穩(wěn),至24 h實(shí)驗(yàn)結(jié)束,該階段菌種處于穩(wěn)定期,細(xì)胞分裂速率明顯降低,持續(xù)了較長一段時(shí)間,可能原因是營養(yǎng)物質(zhì)的消耗造成菌體活力下降。

2.2培養(yǎng)基優(yōu)化

2.2.1 不同碳源、氮源、無機(jī)鹽濃度的影響 選取葡萄糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉四種典型的碳源進(jìn)行研究,結(jié)果如圖2所示。由圖2可知,當(dāng)葡萄糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉作為單一碳源時(shí),活菌總數(shù)從高到低排序依次為:葡萄糖、可溶性淀粉、蔗糖、乳糖?？梢?蔗糖和乳糖對菌種的促生長效果相對較差,葡萄糖和可溶性淀粉對菌種的促生長效果較為顯著,其中葡萄糖最優(yōu)。選擇葡萄糖作為單一碳源,用于凝結(jié)芽孢桿菌13002培養(yǎng)增殖。

圖2 不同碳源對凝結(jié)芽孢桿菌13002生長的影響Fig.2 Effect of different carbon sources on the growth of Bacillus 13002

選取細(xì)菌學(xué)蛋白胨、酵母提取粉、牛肉浸膏三種有機(jī)氮,氯化銨、硫酸銨兩種無機(jī)氮進(jìn)行研究,結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同氮源對凝結(jié)芽孢桿菌13002生長的影響Fig.3 Effect of different nitrogen sources on the growth of Bacillus 13002

圖4 不同NaCl濃度對凝結(jié)芽孢桿菌13002生長的影響Fig.4 Effect of different NaCl concentration on the growth of Bacillus 13002

由圖3可知,對凝結(jié)芽孢桿菌生長有明顯促進(jìn)作用的氮源為酵母提取粉。相比無機(jī)氮源,有機(jī)氮源使菌種生長更好。其原因可能是:無機(jī)氮源雖能迅速被菌體利用,但其利用會(huì)造成體系pH的變化,對菌體生長產(chǎn)生影響;而有機(jī)氮源不僅能給菌體生長提供氮源,還能提供大量的無機(jī)鹽和生長因子。有機(jī)氮源中,酵母提取粉的促生長效果最佳,可能是因?yàn)榻湍柑崛》蹃碓从谑秤媒湍?富含氨基酸、維生素等多種生長因子,但總氮含量較低;細(xì)菌學(xué)蛋白胨效果雖然不如酵母提取粉,但總氮含量較高,同樣具備使用價(jià)值。綜合考慮經(jīng)濟(jì)效益和實(shí)際作用,選取細(xì)菌學(xué)蛋白胨、酵母提取粉作為復(fù)合氮源,用于凝結(jié)芽孢桿菌13002的培養(yǎng)增殖。

選取NaCl的4個(gè)濃度進(jìn)行研究,結(jié)果如圖4所示。由圖4可知,隨NaCl濃度的上升,菌體濃度及活菌總數(shù)先增后減。NaCl的添加對凝結(jié)芽孢桿菌13002有促生長效果;其中,濃度為10 g/L時(shí)達(dá)到最大值,濃度繼續(xù)增加反而效果相反,這可能因?yàn)镹aCl濃度過高導(dǎo)致菌懸液滲透壓過高,不利于細(xì)胞增長。選取濃度為10 g/L的NaCl作為無機(jī)鹽,用于凝結(jié)芽孢桿菌13002的培養(yǎng)增殖。

2.2.2 不同碳氮比的影響 篩選出最優(yōu)的碳源和氮源后,對碳氮比做進(jìn)一步的確定。由于實(shí)驗(yàn)因素只有3個(gè),選用單因素分析法確定顯著性因素的效應(yīng)大小,分別就每個(gè)因素設(shè)置3個(gè)水平進(jìn)行研究,結(jié)果如表2～表4所示。

表2 不同濃度葡萄糖實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 The design and results of glucose concentration

表3 不同濃度細(xì)菌學(xué)蛋白胨實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 The design and results of bacterial peptone concentration

表4 不同濃度酵母提取粉實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 The design and results of yeast extract powder concentration

由表2～表4可知,隨葡萄糖濃度升高,菌體濃度及活菌總數(shù)呈下降趨勢,則該因素為負(fù)效應(yīng),最優(yōu)濃度為20 g/L;隨酵母提取粉濃度升高,菌體濃度及活菌總數(shù)呈上升趨勢,則該因素為正效應(yīng),最優(yōu)濃度為20 g/L;隨著細(xì)菌學(xué)蛋白胨濃度變化,菌體濃度及活菌總數(shù)先上升再下降,最優(yōu)濃度是10 g/L。

依據(jù)單因素分析結(jié)果,按照顯著性因素產(chǎn)生的效應(yīng)大小確定最陡爬坡實(shí)驗(yàn)的方向和梯度,濃度設(shè)計(jì)及結(jié)果如表5所示。

表5 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 The design and results of steepest ascent experiment

由表5可知,隨葡萄糖濃度升高,細(xì)菌學(xué)蛋白胨和酵母提取粉濃度下降,菌體濃度及活菌總數(shù)呈先上升后下降趨勢。菌體濃度及活菌總數(shù)最大的響應(yīng)值為第4組實(shí)驗(yàn),對應(yīng)的濃度為葡萄糖17.5 g/L,細(xì)菌學(xué)蛋白胨12.5 g/L,酵母提取粉22.5 g/L,所以確定該點(diǎn)作為后續(xù)響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素的中心點(diǎn)。

根據(jù)最陡爬坡實(shí)驗(yàn)確定的響應(yīng)面設(shè)計(jì)中心點(diǎn),采用Design-Expert軟件進(jìn)行3因素3水平響應(yīng)面設(shè)計(jì),濃度設(shè)計(jì)及結(jié)果如表6～表8,圖5所示。

表6 Box-Behnken Design實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 6 The design and results of Box-Behnken Design

由表6可知,經(jīng)Design-Expert軟件處理[8],確定該響應(yīng)面回歸方程為:

Y=2.60+0.05A+0.021B+0.059C-0.12AB+0.01AC-0.049BC-0.0002A2-0.042B2-0.0012C2

由圖5及響應(yīng)面模型分析可知,存在最大值。根據(jù)Design-Expert 8.0.5軟件得到的回歸方程可計(jì)算得到Y(jié)的最大值為2.828 g/L,對應(yīng)的濃度值為葡萄糖20 g/L,細(xì)菌學(xué)蛋白胨10 g/L,酵母提取粉25 g/L。

表7 響應(yīng)面模型分析Table 7 The response surface model analysis

圖5 響應(yīng)面立體圖Fig.5 Response surface stereogram

注：*:差異性顯著;**:差異性極顯著。

最優(yōu)培養(yǎng)基配方為:葡萄糖20 g/L;細(xì)菌學(xué)蛋白胨10 g/L,酵母提取粉25 g/L作為復(fù)合氮源;NaCl濃度10 g/L;對凝結(jié)芽孢桿菌13002的培養(yǎng)優(yōu)化進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),最大菌體濃度可達(dá)2.623 g/L。

2.3培養(yǎng)條件優(yōu)化結(jié)果

2.3.1 不同pH的影響 不同菌種由于性質(zhì)差異,其最適增長pH不同。同時(shí),微生物代謝活動(dòng)會(huì)改變所處環(huán)境初始pH,需要在培養(yǎng)基中添加中和劑或緩沖劑,以維持pH相對穩(wěn)定。在Na2HPO4-NaH2PO4緩沖體系下,選取不同pH進(jìn)行研究,結(jié)果如圖6所示。24 h內(nèi),隨時(shí)間延長,5組pH培養(yǎng)下菌體濃度均有增加。隨著pH上升,菌體濃度及活菌總數(shù)先上升后下降;較其它4組pH,pH為6.5對凝結(jié)芽孢桿菌13002的促生長效果最明顯。最大菌體濃度、活菌總數(shù)、最大比生長率各自達(dá)到3.775 g/L、2.138×109CFU/mL、0.371。其它4組pH對凝結(jié)芽孢桿菌13002生長促進(jìn)作用相對較小,菌體濃度均未超過3 g/L。選取pH6.5,用于凝結(jié)芽孢桿菌13002的培養(yǎng)增殖。

圖6 不同pH對凝結(jié)芽孢桿菌13002生長的影響Fig.6 Effect of different pH on the growth of Bacillus 13002

2.3.2 不同培養(yǎng)溫度的影響 在一定溫度范圍內(nèi),菌種代謝會(huì)隨溫度升高而加快,超過該限度則會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞功能下降,蛋白質(zhì)變性,甚至死亡等。選取30、35、40、45、50 ℃共5組培養(yǎng)溫度進(jìn)行研究,結(jié)果如圖7所示。24 h內(nèi),隨時(shí)間延長,5組溫度培養(yǎng)下菌體濃度均有增加。隨著培養(yǎng)溫度的上升,菌體濃度及活菌總數(shù)呈先上升后下降的趨勢。培養(yǎng)溫度為30、35 ℃時(shí),對菌種的促生長效果相對較差,最大菌體濃度均未超過2.5 g/L;45 ℃條件下菌種生長情況最佳,最大菌體濃度、活菌總數(shù)、最大比生長率分別達(dá)到2.643 g/L、1.342×109CFU/mL、0.425。50 ℃條件對菌種也有較好的促生長作用,說明該菌種能在較高溫度下進(jìn)行培養(yǎng),大大降低了培養(yǎng)過程污染雜菌可能性,具備較好的生產(chǎn)和工業(yè)化前景。綜合考慮,選取培養(yǎng)溫度45 ℃,用于凝結(jié)芽孢桿菌13002培養(yǎng)增殖。

圖7 不同培養(yǎng)溫度對凝結(jié)芽孢桿菌13002生長的影響Fig.7 Effect of different culture temperatures on the growth of Bacillus 13002

2.3.3 培養(yǎng)優(yōu)化前后生長曲線對比 經(jīng)過優(yōu)化后,建立凝結(jié)芽孢桿菌13002優(yōu)化后生長曲線,并與原始曲線進(jìn)行比較,結(jié)果如圖8所示。

圖8 凝結(jié)芽孢桿菌13002生長曲線Fig.8 The growth curve of Bacillus 13002

由圖8可知,經(jīng)優(yōu)化后,凝結(jié)芽孢桿菌13002的菌體濃度增加。其中,經(jīng)培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件優(yōu)化得到的最大菌體濃度由原來的2.250 g/L提高到3.890 g/L,為原來的1.7倍。實(shí)際值與優(yōu)化的理論值2.828 g/L非常相近,這說明通過響應(yīng)面優(yōu)化的最佳實(shí)驗(yàn)條件是可靠的。

2.3.4 分批補(bǔ)料培養(yǎng)研究 經(jīng)確定凝結(jié)芽孢桿菌13002生長周期,培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件優(yōu)化后,采用分批補(bǔ)料培養(yǎng)法對菌種進(jìn)行高密度培養(yǎng),即在對數(shù)末期通過添加補(bǔ)料液來促進(jìn)菌種的持續(xù)增長,分別在搖瓶和自動(dòng)發(fā)酵罐兩種容器中進(jìn)行高密度培養(yǎng),并相互比較。

2.3.4.1 搖瓶分批補(bǔ)料培養(yǎng)影響 以最優(yōu)培養(yǎng)基作為補(bǔ)料液,并選取恒速流加作為補(bǔ)料流加方式,控制補(bǔ)料速率分別為0.5、1.0、1.5 g/(L·h)(以葡萄糖計(jì)),研究其對菌種生長的影響。

結(jié)果如圖9所示,以不添加補(bǔ)料搖瓶培養(yǎng)作為對照,16～28 h內(nèi),隨時(shí)間延長,補(bǔ)料速率0.5 g/(L·h)條件培養(yǎng)下菌體濃度會(huì)隨之增加;補(bǔ)料速率1.0 g/(L·h)、1.5 g/(L·h)條件培養(yǎng)下菌體濃度均先上升后下降。其中,補(bǔ)料速率0.5 g/(L·h)條件對凝結(jié)芽孢桿菌13002有明顯的促生長效果,最大菌體濃度由原來的3.255 g/L提高到4.003 g/L,為原來的1.2倍。補(bǔ)料速率1.0 g/(L·h)條件下,前期生長較快,后期菌體濃度反而下降,可能是因?yàn)榇x產(chǎn)物迅速積累,抑制菌種生長;補(bǔ)料速率1.5 g/(L·h)條件下,高濃度底物和代謝物對菌種增長出現(xiàn)更明顯抑制。因而選取補(bǔ)料速率0.5 g/(L·h),用于培養(yǎng)凝結(jié)芽孢桿菌13002。

圖9 不同補(bǔ)料速率對凝結(jié)芽孢桿菌13002生長的影響Fig.9 Effect of different feed rate on the growth of Bacillus 13002

2.3.4.2 搖瓶發(fā)酵與自動(dòng)發(fā)酵罐分批補(bǔ)料培養(yǎng)結(jié)果比較 在自動(dòng)發(fā)酵罐中進(jìn)行高密度培養(yǎng),采用分批補(bǔ)料培養(yǎng)法并在對數(shù)末期選用0.5 g/(L·h)的補(bǔ)料速率添加補(bǔ)料液,研究其對菌種生長的影響。

結(jié)果如圖10所示,16～28 h內(nèi),隨時(shí)間延長,搖瓶培養(yǎng)條件菌體濃度會(huì)隨之增加,而發(fā)酵罐培養(yǎng)條件下,菌體濃度先上升后下降,但在同一時(shí)間點(diǎn),菌體濃度均明顯高于搖瓶培養(yǎng)。其中發(fā)酵罐培養(yǎng)最大菌體濃度達(dá)5.399 g/L,是搖瓶培養(yǎng)條件的1.4倍。發(fā)酵罐培養(yǎng)培養(yǎng)至24 h后,出現(xiàn)了菌體濃度的下降,可能是因?yàn)榫N生長代謝活性已到達(dá)瓶頸階段,繼續(xù)添加補(bǔ)料液并無法促使菌種持續(xù)生長,相反卻起到了稀釋和抑制作用。

圖10 搖瓶和自動(dòng)發(fā)酵罐培養(yǎng) 對凝結(jié)芽孢桿菌13002生長的影響Fig.10 Effect of shake flask and fermentation tank culture on the growth of Bacillus 13002

綜合考慮,選用最優(yōu)培養(yǎng)基及最優(yōu)培養(yǎng)條件,采用分批補(bǔ)料培養(yǎng)法并以0.5 g/(L·h)的補(bǔ)料速率在發(fā)酵罐中進(jìn)行凝結(jié)芽孢桿菌13002的高密度培養(yǎng),培養(yǎng)時(shí)間最好不超過24 h。

2.3.5 凝結(jié)芽孢桿菌13002菌粉測定結(jié)果 選取2.3.4中自動(dòng)發(fā)酵罐培養(yǎng)所得培養(yǎng)液,采用真空冷凍干燥法制備凝結(jié)芽孢桿菌13002菌粉,通過保護(hù)劑使菌體盡量保持較高存活率,再測定計(jì)算凍干后活菌數(shù)量,結(jié)果如表8所示。

表8 發(fā)酵罐培養(yǎng)及菌粉測定結(jié)果Table 8 Results of fermentation tank culture and bacterial powder determination

由表8可知,凝結(jié)芽孢桿菌13002高密度培養(yǎng)后最大菌體濃度為5.399 g/L,較未經(jīng)優(yōu)化的原始菌體濃度2.333 g/L,提高到了原來的2.3倍。測得活菌總數(shù)是3.095×109CFU/mL,凍干后為7.300×1010CFU/g,達(dá)到高密度培養(yǎng)目標(biāo)。

3 結(jié)論

3.1通過對凝結(jié)芽孢桿菌13002的培養(yǎng)優(yōu)化,確定最優(yōu)培養(yǎng)基配方為:葡萄糖20 g/L;細(xì)菌學(xué)蛋白胨10 g/L,酵母提取粉25 g/L作為復(fù)合氮源;NaCl濃度10 g/L;此時(shí)最大菌體濃度可達(dá)2.623 g/L。

3.2在Na2HPO4-NaH2PO4緩沖體系下,調(diào)節(jié)pH至6.5,活菌數(shù)達(dá)2.138×109CFU/mL;培養(yǎng)溫度45 ℃條件時(shí)活菌數(shù)達(dá)1.342×109CFU/mL;搖瓶培養(yǎng)條件時(shí)為1.331×109CFU/mL。經(jīng)分批補(bǔ)料培養(yǎng),于16～28 h,在搖瓶中以0.5 g/(L·h)的速率添加補(bǔ)料時(shí)菌體濃度達(dá)4.003 g/L;最后經(jīng)發(fā)酵罐培養(yǎng)優(yōu)化,菌種最大菌體濃度達(dá)5.399 g/L,為搖瓶時(shí)的1.4倍,測得其活菌總數(shù)為3.095×109CFU/mL,經(jīng)真空冷凍干燥后達(dá)7.300×1010CFU/g。結(jié)果表明,上述最優(yōu)條件下,可通過低廉易獲得的培養(yǎng)基獲得高密度培養(yǎng)的凝結(jié)凝結(jié)芽孢桿菌菌體。

3.3通過對凝結(jié)芽孢桿菌13002培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化,為工業(yè)化生產(chǎn)高活菌數(shù)凝結(jié)芽孢桿菌13002及L-乳酸提供理論支持。

[1]董惠鈞,姜俊云,鄭立軍,等. 新型微生態(tài)益生菌凝結(jié)凝結(jié)芽孢桿菌研究進(jìn)展[J].食品科學(xué),2010(1):292-294.

[2]王金果,莫云,張玳華,等. 產(chǎn)乳酸凝結(jié)芽胞桿菌N001的抗逆性研究[J].中國微生態(tài)學(xué)雜志,2007(6):489-491.

[3]錢志良,胡軍,雷肇祖. 乳酸的工業(yè)化生產(chǎn)、應(yīng)用和市場[J]. 工業(yè)微生物,2001(2):49-53.

[4]Ranjbar-Mohammadi M,Prabhakaran M P,Hajir B S,et al. Corrigendum to “Gum tragacanth/poly(l-lactic acid)nanofibrous scaffolds for application in regeneration of peripheral nerve damage”[Carbohydr. Polym. J. 140(2016)104-112][J]. Carbohydrate Polymers,2017,160:212.

[5]Nafary A,Seyedjafari E,Salimi A. Electrospun Poly-L-Lactic Acid Coated with Silicate Bioceramic Nanoparticles Enhance Osteogenic Differentiation of Adipose Tissue Derived Mesenchymal Stem Cells[J]. Journal of Biomaterials & Tissue Engineering,2017.

[6]田康明,周麗,陳獻(xiàn)忠,等. L-乳酸的發(fā)酵生產(chǎn)和聚L-乳酸的化學(xué)加工[J]. 中國生物工程雜志,2011(2):102-115.

[7]Mussatto S I,Fernandes M,Mancilha I M,et al. Effects of medium supplementation and pH control on lactic acid production from brewer’s spent grain[J]. Biochemical Engineering Journal,2008,40(3):437-444.

[8]Wang Q,Narita J Y,Xie W,et al. Effects of anaerobic/aerobic incubation and storage temperature on preservation and deodorization of kitchen garbage.[J]. Bioresource Technology,2002,84(3):213-220.

[9]Glaser R,Venus J. Model-based characterisation of growth performance and L-lactic acid production with high optical purity by thermophilic Bacillus coagulans in a lignin-supplemented mixed substrate medium.[J]. New Biotechnology,2017,37:180-193.

[10]齊士朋,徐爾尼,羅玉芬,等. 細(xì)胞高密度培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2011,37(2):139-143.

[11]Riesenberg D,Guthke R. High-cell-density cultivation of microorganisms[J]. Applied Microbiology and Biotechnology,1999,51:422-430.

[12]羅艷霞. 益生菌補(bǔ)料分批培養(yǎng)工藝優(yōu)化和活細(xì)胞量在線測定方法研究[D].上海:華東理工大學(xué),2012.

[13]周全興. BCS 13002的鑒定、同步糖化發(fā)酵高光學(xué)純度L-乳酸及相關(guān)蛋白質(zhì)組學(xué)的研究[D].上海：華南理工大學(xué),2017.

[14]劉馨磊. 凝結(jié)凝結(jié)芽孢桿菌TQ33的高密度培養(yǎng)[D].天津:天津科技大學(xué),2002.

[15]閆天文,滿朝新,劉泳麟,等. 一株植物乳桿菌高密度培養(yǎng)的研究[J].中國乳品工業(yè),2014,42(4):33-37.

[16]靳志強(qiáng),李平蘭. 補(bǔ)料分批法高密度培養(yǎng)德氏乳桿菌保加利亞亞種S-1[J].中國乳品工業(yè),2007,35(1):4-9.

[17]邢蕾,吳暉,劉冬梅,等.干酪乳桿菌鼠李糖亞種凍干保護(hù)劑的研究[J].中國乳品工業(yè),2009,27(11):15-17.

HighcelldensitycultureofBacillus13002

SUNLi-na1,JINXun1,2,ZHOUQuan-xing1,ZHOUJin-song1,LIUDong-mei1,*

(1.Institute of Food Science and Engineering,South China University of Technology,Guangzhou 510640,China; 2.College of Biosystems Engineering and Food Science,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China)

This experiment aimed to improve the concentration of bacteria inBacillus13002 fermentation medium by improving the culture conditions,and to lay the foundation for the production of high optical purity L-lactic acid. The single factor test,steep climbing test and Box-Behnken response surface test were used to confirm the optimum culture medium and optimum culture conditions ofBacillus13002 and high density batch feeding was carried out in automatic fermentation tank. Results showed that the optimal medium was glucose 20 g/L,bacterial peptone 10 g/L,yeast extract powder 25 g/L,NaCl 10 g/L,initial pH6.5. Under the optimum condition,when 6%Bacillus13002 and nutrients were added at the rate of 0.5 g/(L·h)from the 16th hour to the terminal at 45 ℃,the maximal cell concentration was 5.399 g/L.The total number of bacteria was 3.095×109CFU/mL,and reached the level of 0.730×1011CFU/g after lyophilization.

Bacillus13002;high cell density culture;response surface design;fed-batch culture

2017-04-14

孫麗娜(1995-)，女，碩士研究生，主要從事食品微生物的利用和控制方面的研究，E-mail:sunlina199541@163.com。

*

劉冬梅(1972-)，女，博士，教授，主要從事食品微生物利用與控制方面的研究，E-mail:liudm@scut.edu.cn。

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31101254)；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013B020312002，2014A020208019)。

TS201.3

A

1002-0306(2017)21-0114-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.21.024