張 斌，李明陽(yáng)

(惠州學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，廣東惠州516007)

荔枝酒低溫高糖發(fā)酵技術(shù)研究

張 斌，李明陽(yáng)

(惠州學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，廣東惠州516007)

為了解決高糖發(fā)酵遲緩和不徹底的問(wèn)題，通過(guò)添加氮源強(qiáng)化發(fā)酵能力，考察了添加氮源對(duì)果酒中總糖、酒精度、總酯和雜醇油等的影響。結(jié)果顯示，添加氮源可以明顯促進(jìn)發(fā)酵時(shí)對(duì)糖的消耗，提升乙醇和酯類(lèi)物質(zhì)得率，降低雜醇油生成量。與對(duì)照樣相比，添加尿素、硫酸銨及復(fù)合氮源發(fā)酵的酒樣總糖濃度分別降低了22.63%、27.24%和35.21%；酒精含量分別提高了14.63%、20.42%和23.16%；雜醇油含量分別降低了4.70%、8.33%和14.41%。研究表明，添加氮源可以促進(jìn)荔枝酒的低溫高糖發(fā)酵，有利于提升荔枝酒的品質(zhì)。

荔枝酒； 高糖發(fā)酵； 氮源

高糖發(fā)酵（含糖量≥25%）因具有設(shè)備利用率高、效率高和節(jié)約能源等優(yōu)點(diǎn)而被廣為應(yīng)用。在酒精發(fā)酵初期，高糖度會(huì)引起高滲透壓，高滲透壓會(huì)影響酵母的生長(zhǎng)代謝，同時(shí)隨著酒精含量的增大，會(huì)削弱酵母細(xì)胞膜對(duì)極性分子的屏蔽能力，對(duì)細(xì)胞膜成分和細(xì)胞代謝產(chǎn)生影響，不同的酵母菌株對(duì)酒精的耐受性不同，酵母的生長(zhǎng)代謝和發(fā)酵能力也取決于酒精耐受力的大小[1-2]。菌種生長(zhǎng)和發(fā)酵產(chǎn)物合成需要氮源，氮源主要用于菌體細(xì)胞物質(zhì)(氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸等)和含氮代謝物的合成。發(fā)酵中使用的氮源可分為兩大類(lèi)：有機(jī)氮源和無(wú)機(jī)氮源。常用的無(wú)機(jī)氮源包括各種銨鹽、硝酸鹽、氨水等。本實(shí)驗(yàn)研究了添加蛋白胨、尿素、硫酸銨和硝酸銨等氮源強(qiáng)化果酒發(fā)酵能力，找到了最佳添加量，為荔枝酒的高糖發(fā)酵提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

荔枝汁：由廣東禎州集團(tuán)有限公司提供；食品級(jí)蛋白胨、食品級(jí)尿素、食品級(jí)硫酸銨、食品級(jí)硝酸銨，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲醇、正丙醇、正丁醇、異丁醇、異戊醇均為色譜純，上海阿拉丁試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

6890N氣相色譜儀-5975質(zhì)譜儀：美國(guó)Agilent公司；頂空固相微萃取裝置(聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane,PDMS)萃取頭100 μm)：美國(guó)Supelco公司；UV-7504紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 高糖發(fā)酵工藝

荔枝汁→冷凍濃縮（總糖340 g/L)→成分調(diào)整（調(diào)酸）→接種酵母菌（250 mg/L）→添加氮源→酒精發(fā)酵（12℃）→過(guò)濾→陳釀→成品

1.3.2 氣質(zhì)聯(lián)用分析果酒中雜醇油[3-4]

（1）頂空固相微萃取(headspace solid-phase microextraction,HS-SPME)

在15 mL頂空樣品瓶中添加10 mL酒樣，在磁力攪拌器作用下以50℃平衡10 min，將微萃取纖維100 μm 的PDMS在250℃老化處理2 h，再以50℃頂空萃取40 min，再以230℃脫附3 min，待檢。

（2）GC/MS操作條件

氣相色譜條件：DB-1色譜柱(30.0 m×0.25 mm×0.25μm)，柱溫為程序升溫：先以45℃保持1 min，再以3℃/min升溫至55℃，保持1 min，再以10℃/min升溫至120℃，保持10 min后再升溫到200℃。進(jìn)樣口溫度為230℃，載氣為氦氣(He)，流速1 mL/min，不分流。

質(zhì)譜條件：電離方式電子電離(electronic ionization，EI)源，電子能量70 eV，檢測(cè)器電壓為350 V，離子源溫度230℃，接口溫度280℃，以35～335 amu為掃描質(zhì)量范圍。

（3）數(shù)據(jù)處理

以保留時(shí)間進(jìn)行定性，外標(biāo)峰面積法進(jìn)行定量。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱(chēng)取甲醇20.0 mg、丙醇30.0 mg、正丁醇40.0 mg、異丁醇40.0 mg、異戊醇40.0 mg，用體積分?jǐn)?shù)40%乙醇水溶液溶解并定容至10 mL，混勻，密封后置于冰箱中保存，使用時(shí)用體積分?jǐn)?shù)40%乙醇水溶液稀釋10倍。

1.3.4 理化指標(biāo)測(cè)定方法

總糖和酒精度等常規(guī)理化指標(biāo)測(cè)定采用國(guó)標(biāo)GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》，總酯測(cè)定方法參照國(guó)標(biāo)GB/T 10345—2007《白酒分析方法》。

2 結(jié)果與分析

2.1 響應(yīng)面優(yōu)化分析

2.1.1 單一氮源

分別添加蛋白胨、尿素、硫酸銨和硝酸銨等單一氮源，發(fā)酵結(jié)束后總糖與氮源添加濃度的關(guān)系見(jiàn)圖1。

圖1 氮源對(duì)總糖的影響

由圖1可看出，添加不同氮源的酒樣，發(fā)酵過(guò)程中總糖變化趨勢(shì)不同。氮源添加濃度在300～800 mg/L時(shí)，單一添加蛋白胨、尿素和硫酸銨的酒樣，總糖濃度均呈現(xiàn)先降低后上升的趨勢(shì)，且分別在400 mg/L、500 mg/L和700 mg/L添加量時(shí)，總糖濃度最低；單一添加硝酸銨的酒樣，總糖濃度隨著添加量的增加而呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)。蛋白胨、尿素、硫酸銨、硝酸銨的最優(yōu)添加量分別為400 mg/L、500 mg/L、700 mg/L、300 mg/L，其相對(duì)空白樣的變化見(jiàn)圖2。

圖2 發(fā)酵過(guò)程中總糖的變化

由圖2可知，所有酒樣的總糖含量均隨發(fā)酵時(shí)間呈現(xiàn)明顯降低的趨勢(shì)。添加了氮源酒樣的發(fā)酵速率均比對(duì)照樣高，說(shuō)明外氮源促進(jìn)了高糖發(fā)酵的進(jìn)行。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，總糖含量下降的速率逐漸降低，這是由于伴隨著高糖發(fā)酵的進(jìn)行，酒樣中酒精含量不斷增加，較高的酒精含量削弱了酵母細(xì)胞膜對(duì)極性分子的屏蔽能力，對(duì)細(xì)胞膜成分和細(xì)胞代謝過(guò)程產(chǎn)生影響，從而使發(fā)酵效率逐漸降低。4種氮源對(duì)高糖發(fā)酵的促進(jìn)效果由強(qiáng)到弱的順序分別為硫酸銨＞尿素＞硝酸銨＞蛋白胨。

2.1.2 響應(yīng)面法優(yōu)化復(fù)合氮源

以酒精度作為參考指標(biāo)，選擇硫酸銨和尿素進(jìn)行最陡爬坡實(shí)驗(yàn)。最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

由表1可知，在第3組氮源添加組合條件下，發(fā)酵結(jié)束后的酒精度最高。因此，以第3組實(shí)驗(yàn)的氮源添加條件作為響應(yīng)面設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)，以發(fā)酵結(jié)束后的酒精度為響應(yīng)值，進(jìn)行2因素5水平的Central-Composite設(shè)計(jì)，各因素水平見(jiàn)表2。Central-Composite設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 Central-Composite設(shè)計(jì)各因素水平

表3 Central-Composite設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

用Design Expert軟件對(duì)表3中酒精度數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到以發(fā)酵結(jié)束后酒精度為響應(yīng)值的線性回歸方程為：

其中響應(yīng)值Y為發(fā)酵結(jié)束后的酒精度，X1為尿素添加量，X2為硫酸銨添加量，根據(jù)回歸分析結(jié)果與回歸方程進(jìn)行回歸模型及系數(shù)顯著性檢驗(yàn)和回歸模型方差分析，結(jié)果見(jiàn)表4和表5。

由表4、表5可知，回歸模型的F值為30.80，Prob(P)＞F的概率僅為0.0009，并且，模型的相關(guān)性系數(shù)R2=0.9686，這說(shuō)明該模型的擬合性較好且該模型顯著性較高。因此，可以用該模型進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)添加氮源強(qiáng)化高糖發(fā)酵后的酒精度。用Design Expert軟件繪制出兩種氮源之間交互影響的響應(yīng)面分析三維曲面圖和等高線圖，見(jiàn)圖3和圖4。

由響應(yīng)面分析可知，兩因素間的相互作用比較明顯。軟件推薦的通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化得出的最優(yōu)氮源添加組合及添加量為：尿素445 mg/L、硫酸銨650 mg/L，發(fā)酵結(jié)束后酒精度理論值為14.36%vol。

2.2 優(yōu)化后的高糖發(fā)酵

以響應(yīng)面優(yōu)化得到的最優(yōu)氮源添加條件進(jìn)行高糖發(fā)酵，將優(yōu)化后的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與空白樣及單一氮源添加進(jìn)行對(duì)比分析。

表4 回歸模型及系數(shù)顯著性檢驗(yàn)

表5 回歸模型方差分析

2.2.1 對(duì)總糖和酒精度的影響

圖3 響應(yīng)面分析三維曲面圖

圖4 響應(yīng)面分析等高線圖

發(fā)酵過(guò)程中總糖含量和酒精度變化分別見(jiàn)圖5和圖6。

圖5 總糖隨發(fā)酵時(shí)間的變化

圖6 氮源對(duì)酒精度的影響

由圖5和圖6可知，所有發(fā)酵果汁的總糖濃度均呈現(xiàn)快速降低的趨勢(shì)，發(fā)酵液的酒精含量均呈現(xiàn)快速升高的趨勢(shì)。添加了氮源的發(fā)酵效率明顯高于未添加氮源的對(duì)照樣，復(fù)合氮源的發(fā)酵效率明顯高于單一氮源。相對(duì)于空白樣，單一氮源的酒樣，發(fā)酵結(jié)束后總糖濃度分別降低了22.63%和27.24%，酒精含量分別增加了14.63%和20.42%；復(fù)合氮源的酒樣，總糖濃度降低了35.21%，酒精含量增加了23.16%。復(fù)合氮源比單一氮源的酒樣發(fā)酵結(jié)束后總糖分別降低了16.35%和10.93%，酒精度分別增加了7.82%和2.65%。

經(jīng)響應(yīng)面分析后酒精度的實(shí)際含量是預(yù)測(cè)含量的97.38%，這說(shuō)明經(jīng)響應(yīng)面分析所得到的模型可以較好的預(yù)測(cè)實(shí)際發(fā)酵情況。

2.2.2 對(duì)總酯的影響

發(fā)酵過(guò)程中的總酯含量變化見(jiàn)圖7。

由圖7可知，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，各酒樣總酯含量均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。添加氮源調(diào)控的高糖發(fā)酵的酒樣總酯含量均高于對(duì)照樣。與對(duì)照樣相比，添加尿素、硫酸銨及復(fù)合氮源發(fā)酵的酒樣總酯含量分別增加了15.85%、19.58%、24.94%。由此可見(jiàn)，經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化后所得的總酯含量高于單一氮源。

總酯是果酒中所有酯類(lèi)芳香物質(zhì)的總和，是果酒中主要香氣成分的重要組成之一?？傰ズ康母叩驮谝欢ǔ潭壬蠜Q定了果酒品質(zhì)的好壞。在高糖發(fā)酵過(guò)程中，酯類(lèi)物質(zhì)的產(chǎn)生與酵母細(xì)胞的代謝過(guò)程有關(guān)。酵母細(xì)胞經(jīng)分解代謝將糖類(lèi)分解成乙酰輔酶A，乙酰輔酶A的分解和來(lái)源于氨基酸的碳骨架構(gòu)成了酯類(lèi)物質(zhì)合成的主要原料。在高糖發(fā)酵時(shí)添加了氮源后，對(duì)谷氨酸和亮氨酸等氨基酸的合成具有積極的促進(jìn)作用，從而促進(jìn)了高糖發(fā)酵荔枝酒中總酯的生成。例如，在酵母細(xì)胞利用亮氨酸合成乙酸異戊酯的過(guò)程中，亮氨酸經(jīng)過(guò)脫氨和脫羧產(chǎn)生一種醛，然后生產(chǎn)的醛被還原成醇，最后生成的醇可以與乙酰輔酶A發(fā)生酯化反應(yīng)從而生成乙酸異戊酯[5-7]。

2.2.3 對(duì)雜醇油的影響

雜醇油是果酒中重要芳香物質(zhì)的組成成分之一，是正丙醇、異丙醇、正丁醇、異丁醇、異戊醇等高級(jí)醇類(lèi)的統(tǒng)稱(chēng)。適量的雜醇油可以使酒體更加醇厚飽滿(mǎn)，但過(guò)量就會(huì)影響酒的品質(zhì)。因?yàn)殡s醇油在人體中的代謝速度較慢，停留時(shí)間長(zhǎng)，對(duì)人體有一定的毒害作用，能使神經(jīng)系統(tǒng)充血，從而使人感到頭痛頭暈[8-10]。在高糖發(fā)酵過(guò)程中雜醇油含量變化見(jiàn)圖8。

圖8 氮源對(duì)雜醇油的影響

由圖8可知，在高糖發(fā)酵過(guò)程中，各酒樣的雜醇油含量均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。與對(duì)照樣相比，添加尿素、硫酸銨及復(fù)合氮源發(fā)酵酒樣的雜醇油含量分別降低了4.70%、8.33%和14.41%?？梢?jiàn)，添加氮源對(duì)雜醇油的產(chǎn)生具有一定的抑制作用，響應(yīng)面優(yōu)化組的抑制效果最好，其次是硫酸銨。

在果酒發(fā)酵的過(guò)程中，雜醇油的來(lái)源有兩條途徑：一是降解代謝途徑，在此途徑中雜醇油的形成是由氨基酸轉(zhuǎn)氨、脫羧、還原而產(chǎn)生；二是合成代謝途徑，在該途徑中雜醇油是由糖類(lèi)經(jīng)生物合成氨基酸的中間階段形成α-酮酸中間體后經(jīng)脫羧、還原從而形成高級(jí)醇。當(dāng)發(fā)酵過(guò)程中的氮源不足時(shí)，酵母細(xì)胞就會(huì)經(jīng)過(guò)代謝途徑，以氨基酸作為氮源，從而增加了雜醇油的含量[11-15]。當(dāng)添加了氮源補(bǔ)充發(fā)酵氮源后，就會(huì)減少這部分高級(jí)醇的產(chǎn)生機(jī)會(huì)，從而降低了果酒中雜醇油含量。

3 結(jié)論

荔枝酒在12℃左右低溫高糖發(fā)酵時(shí)，添加單一硫酸銨、尿素、硝酸銨和蛋白胨等氮源均能促進(jìn)發(fā)酵，硫酸銨和尿素復(fù)合添加的最優(yōu)添加量分別為650 mg/L和445 mg/L。外加氮源有利于提升乙醇和酯類(lèi)物質(zhì)得率，降低高級(jí)醇生成量，使酒體香氣濃郁，提升荔枝酒的品質(zhì)。

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High-Sugar Low-Temperature Fermentation of Litchi Wine

ZHANG Bin and LI Mingyang

(School of Life Science,Huizhou University,Huizhou,Guangdong 516007,China)

In order to settle the problem of sluggish and unthorough high-sugar fermentation,nitrogen source was added for strengthening the fermenting power.The effects of adding nitrogen source on total sugar content,alcohol content,total esters content and fusel oil content in litchi wine were investigated.The results revealed that the addition of nitrogen source could evidently advance sugar consumption in fermentation process,enhance the yield of ethanol and esters,and reduce the yield of fusel oil.Compared with the contrast samples,in wine samples with the addition of urea,ammonium sulfate,and complex nitrogen source respectively,total sugar content reduced by 22.63%,27.24%,and 35.21%respectively,alcohol content increased by 14.63%,20.42%,and 23.16%respectively,and fusel oil content decreased by 4.70%,8.33%,and 14.41%respectively.All the evidence proved that adding nitrogen source was helpful for high-sugar low-temperature fermentation and for the improvement of litchi wine quality.

litchi wine;high-sugar fermentation;nitrogen source

TS262.7；TS261.4

A

1001-9286（2017）11-0051-06

10.13746/j.njkj.2017203

廣東省教育廳項(xiàng)目基金(2015KTSCX133)；惠州市科技項(xiàng)目基金（2015B010002001）。

2017-07-21

張斌（1979-），男，講師，博士，主要從事果酒、葡萄酒釀造和食品綠色加工，E-mail：zhangbinwr@qq.com。

優(yōu)先數(shù)字出版時(shí)間：2017-09-20；地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20170920.1451.003.html。