王 芳，陳 松，劉仁普，楊茂發(fā)

(貴州大學(xué)昆蟲研究所/貴州山地農(nóng)業(yè)病蟲害重點(diǎn)試驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025)

紫斑谷螟豹皮樟蟲茶小鼠急性毒性和骨髓紅細(xì)胞微核試驗(yàn)研究

王 芳，陳 松，劉仁普，楊茂發(fā)*

(貴州大學(xué)昆蟲研究所/貴州山地農(nóng)業(yè)病蟲害重點(diǎn)試驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025)

用小鼠最大耐受量法、小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)和小鼠精子畸形試驗(yàn)等方法，究紫斑谷螟豹皮樟蟲茶對(duì)小鼠的急性毒性和致突變性作用。結(jié)果顯示，紫斑谷螟豹皮樟蟲茶的小鼠急性經(jīng)口LD50>30 g/kg·bw，小鼠骨髓紅細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果為陰性。結(jié)果表明，紫斑谷螟豹皮樟蟲茶屬無毒物，對(duì)小鼠體細(xì)胞無致突變性。

急性毒性；微核試驗(yàn)；致突變作用；小鼠

蟲茶被譽(yù)為“茶中奇珍”，是一種絕佳的醫(yī)藥保健飲品，由特定種類昆蟲取食相應(yīng)的特定寄主植物后所產(chǎn)排泄物精制而成[1-4]。據(jù)《本草綱目》記載，蟲茶具有清熱、解毒、健脾胃、祛暑、助消化等功效，對(duì)腹瀉、鼻衄、牙齦出血和痔出血均有較好療效，是熱帶和亞熱帶地區(qū)的一種重要的清涼飲料[4]。據(jù)報(bào)道[5～7]，我國民間用來生產(chǎn)蟲茶的昆蟲種類主要有7種：即米縞螟(Aglossadimidiata)、化香夜蛾(Hydrillodesmorosa)、白條谷螟(Fujimaciabicoloralis)、黃條谷螟(Herculiaglaucinalis)、弓須夜蛾(Hhdrillodesrepugnalis)、雪疽夜蛾(Nodarianiphona)、紫斑谷螟(Pyralisfarinalis)等。寄主植物包括三葉海棠(Malussieboldii)、化香樹(Platycaryastrebilacea)、苦藤茶(Sageretiathea)、苦丁茶(Rubushenryi)和豹皮樟(Litseacoreana)等。其中取食三葉海棠、苦藤茶和苦丁茶的多是米縞螟、白條谷螟和黃條谷螟(灰直紋螟)，取食化香樹葉的則是化香夜蛾、弓須夜蛾和雪疽夜蛾，取食豹皮樟的有米縞螟和紫斑谷螟。

不同昆蟲種類取食同種寄主植物，或者同種昆蟲取食不同的寄主植物所產(chǎn)的蟲茶，其顆粒的大小、色澤會(huì)有所不同，營養(yǎng)成分、功效以及利用角度也有較大的差異[8]。紫斑谷螟(PyralisfarinalisLinnaeus)，屬鱗翅目 (Lepidoptera)螟蛾科 (Pyralidae)螟蛾屬(PyralisLinnaeus)，是貴州地區(qū)用以生產(chǎn)蟲茶的主要昆蟲種類之一[7]。紫斑谷螟幼蟲取食豹皮樟(Litseacoreana)所產(chǎn)的排泄物經(jīng)系列加工后即為紫斑谷螟-豹皮樟蟲茶(下稱“紫樟蟲茶”，PLIT)。目前尚無針對(duì)紫斑谷螟豹皮樟蟲茶安全性毒理學(xué)方面的研究報(bào)道。本文將選用急性毒性試驗(yàn)和小鼠骨髓微核試驗(yàn)研究其急性毒性和體內(nèi)致突變性，以期為紫斑谷螟豹皮樟蟲茶的安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)提供參考依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料

1.1受試物

紫斑谷螟豹皮樟蟲茶溶液制備：紫斑谷螟豹皮樟蟲取自貴州大學(xué)昆蟲研究所蟲茶飼養(yǎng)室；將紫斑谷螟自初孵幼蟲起便以貴州赤水樟樟科植物豹皮樟(Listseacoreana)葉進(jìn)行飼養(yǎng)，收集到的蟲茶經(jīng)網(wǎng)篩去除雜質(zhì)粉塵，再依次進(jìn)行紫外線殺菌15 min，再經(jīng)50℃恒溫干燥箱烘至恒重備用。根據(jù)《受試物試驗(yàn)前處理方法(GB15193.21-2014)》[9]，獲得的紫斑谷螟豹皮樟蟲茶采用常壓、溫度80～90℃，十倍的蒸餾水的浸泡30 min提取，重復(fù)兩次，合并浸泡液150目網(wǎng)篩濾除茶渣，將提取液減壓濃縮、干燥至干粉狀，室溫儲(chǔ)藏備用，每1 g濃縮干粉狀樣品相當(dāng)于紫斑谷螟原來生藥樣品5 g的量。使用時(shí)，將濃縮后的受試物樣品以80～90℃蒸餾水沖泡溶解制得飽和溶液，然后稀釋至所需濃度。

1.2試劑

Giemsa染液：稱取Giemsa 染料3.8 g，加入375 mL甲醇研磨，待完全溶解后，再加入125 mL 甘油。置37℃恒溫箱保溫48 h，期間搖蕩數(shù)次，取出過濾，兩周后可用。Giemsa 應(yīng)用液：取一份Giemsa 染液與6份磷酸緩沖液混合而成，現(xiàn)用現(xiàn)配。環(huán)磷酰胺購于浙江天杭生物科技有限公司，含量97.0～103.0%(HPLC)，分子量279.10，規(guī)格1 g，批號(hào)302A037，CAS6055-19-2；新生胎牛血清購于浙江天杭生物科技有限公司，規(guī)格100 mL，批號(hào)20160328。

1.3儀器

解剖器械、生物顯微鏡、載玻片、注射器、計(jì)數(shù)器等。

1.4試驗(yàn)動(dòng)物

根據(jù)《試驗(yàn)動(dòng)物 環(huán)境及設(shè)施(GB 14925-2010)》[10]國家標(biāo)準(zhǔn)中相關(guān)規(guī)定，試驗(yàn)動(dòng)物選用SPF級(jí)KM小鼠和SPF級(jí)SD大鼠，購自解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物中心，試驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SCXK(渝)2012-2003。試驗(yàn)環(huán)境即飼養(yǎng)地點(diǎn)選擇貴州大學(xué)貴州省生化工程中心SPF級(jí)動(dòng)物試驗(yàn)室，動(dòng)物飼養(yǎng)許可證號(hào)SYXK(黔)2013-00001。動(dòng)物房為無菌隔離屏障環(huán)境，室內(nèi)溫度控制在23±2℃，濕度60±5%。

2 試驗(yàn)方法

2.1急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)

鑒于受試物特點(diǎn)，根據(jù)急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)國家標(biāo)準(zhǔn)(GB15193.3-2014)[11]本次試驗(yàn)采用限量法，測(cè)定皮樟蟲茶對(duì)小鼠的急性毒性作用。試驗(yàn)選用20只體重在18～22 g的KM小鼠，雌雄各10只，雌雄分開飼養(yǎng)，每籠5只，用品紅染色編號(hào)標(biāo)記，試驗(yàn)前在SPF級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)房觀察適應(yīng)5 d，試驗(yàn)期間自由飲水和食物。灌胃前禁食4 h，自由飲水，給予受試物后繼續(xù)禁食1～2 h；采用30 g/kg·bw劑量一次性經(jīng)口灌胃，灌胃后連續(xù)觀察兩周，參照標(biāo)準(zhǔn)記錄小鼠各系統(tǒng)中毒指標(biāo)，試驗(yàn)?zāi)┢谶M(jìn)行解剖檢查，若大體解剖有異常病理改變則應(yīng)做進(jìn)一步的病理組織學(xué)觀察。觀察期每周記錄體重一次。按照標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果。

2.2小鼠骨髓紅細(xì)胞微核試驗(yàn)

根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)(GB15193.3-2014)[12]取SPF級(jí)健康KM小鼠50只，每組10只(雌雄各半)，體重在25～35 g，雌雄隨機(jī)分籠飼養(yǎng)，每籠5只；小鼠隨機(jī)分為5組，即按10、5和2.5 g/kg·bw灌服紫斑谷螟豹皮樟蟲茶的高、中、低三個(gè)劑量組，腹腔注射環(huán)磷酰胺(40 mg/kg·bw)的陽性對(duì)照組，灌服等體積蒸餾水的陰性對(duì)照組。試驗(yàn)采用30 h灌胃法，即兩次給予受試物，期間間隔24 h，末次給予后6 h采集骨髓1次，試驗(yàn)?zāi)┢陬i椎脫臼處死動(dòng)物，取大腿股骨，參照國家標(biāo)準(zhǔn)制作小鼠骨髓涂片，經(jīng)甲醇中固定，Giemsa和吖啶橙染色油鏡鏡檢嗜多染紅細(xì)胞，計(jì)數(shù)嗜多染紅細(xì)胞(PCE)和正染紅細(xì)胞(NCE)在總細(xì)胞中的比例，觀察嗜多染紅細(xì)胞，計(jì)數(shù)有微核(MNPCE)的嗜多染紅細(xì)胞頻率，以千分率表示。

2.5數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPASS20.0軟件進(jìn)行處理，以Mean±S表示，急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)體重?cái)?shù)據(jù)采用均值分析；紅細(xì)胞骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)微核率和P/N比值采用雙側(cè)T檢驗(yàn)[13]。

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)

選用最大可使用劑量(30 g/kg·bw)給20只SPF級(jí)小鼠(雌雄各半)一次性經(jīng)口灌胃后，14 d內(nèi)未見小鼠死亡，說明紫斑谷螟豹皮樟蟲茶對(duì)小鼠LD50大于30 g/kg·bw。試驗(yàn)期內(nèi)小鼠瞳孔、皮膚、毛色、采食、飲水、糞便和行為等均未見異常；未觀察到震顫、驚厥、流涎、呆滯、嗜睡、昏迷等異常狀況；試驗(yàn)?zāi)┢陬i椎脫臼處死小鼠，大體解剖檢查所見小鼠心、肝、脾、肺、胃和腎等主要內(nèi)臟結(jié)構(gòu)以及生殖系統(tǒng)未發(fā)現(xiàn)顏色、形態(tài)異常，未見血點(diǎn)或其他異常病變，故尸檢未見異常。按照國標(biāo)判斷：紫斑谷螟豹皮樟蟲茶在最大可使用劑量(30 g/kg·bw)下對(duì)小鼠未觀察到有害作用。

3.2小鼠骨髓紅細(xì)胞微核試驗(yàn)

本試驗(yàn)結(jié)果表明(表1)：陽性試驗(yàn)組的微核數(shù)和與陰性對(duì)照組相比較微核數(shù)、微核率和PCE/NCE值均差異極顯著(P<0.01)，而紫斑谷螟豹皮樟蟲茶受試物各劑量組與陰性對(duì)照組相比較微核數(shù)、微核率和PCE/NCE值均差異不顯著(P>0.05)。

表1 PLIT對(duì)雄性小鼠骨髓紅細(xì)胞微核的影響(mean±s)Tab.1 Effect of PLIT on bone narrow cell micronucleus of male mice

注：CP：環(huán)磷酰胺；“*”表示與陰性對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)；“**”表示與陰性對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)。

根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)，在本試驗(yàn)條件下，紫斑谷螟豹皮樟蟲茶受試物不引起哺乳動(dòng)物嗜多染紅細(xì)胞含微核細(xì)胞率增加。

4 討 論

急性毒性是指機(jī)體次接觸或內(nèi)多次接觸化學(xué)物質(zhì)后在短期最長到內(nèi)所發(fā)生的毒性效應(yīng)，包括一般行為、外觀改變、大體形態(tài)變化以及死亡效應(yīng)。是檢測(cè)和評(píng)價(jià)受試物毒性作用最基本的一項(xiàng)試驗(yàn)，即經(jīng)口一次性或24 h內(nèi)多次給予受試物后，在短期內(nèi)觀察動(dòng)物所產(chǎn)生的毒性反應(yīng)，包括中毒體征和死亡體征，通常用LD50來表示。急性毒性試驗(yàn)是毒理研究的主要內(nèi)容之一，目的是測(cè)試和求出化學(xué)毒物對(duì)一種或幾種試驗(yàn)動(dòng)物的致死量以表示以及其他的急性毒性參數(shù)，了解急性毒作用的強(qiáng)度。并通過觀察動(dòng)物中毒表現(xiàn)和死亡的情況，了解急性毒作用性質(zhì)、可能的靶器官和致死原因，提供化學(xué)毒物的急性中毒資料。初步評(píng)價(jià)對(duì)人體產(chǎn)生損害的危險(xiǎn)性，探求化學(xué)毒物急性毒性的劑量一反應(yīng)關(guān)系，為進(jìn)一步毒理學(xué)試驗(yàn)的劑量設(shè)計(jì)和觀察指標(biāo)的選擇提供參考依據(jù)，還可作為化學(xué)毒物分級(jí)和標(biāo)簽管理的基礎(chǔ)。本次試驗(yàn)結(jié)果證明紫斑谷螟豹皮樟蟲茶LD50遠(yuǎn)大于30 g/kg·bw，試驗(yàn)過程中未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，即未觀察到有害作用劑量(NOVEL)為30 g/kg·bw，按照急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)屬于實(shí)際無毒級(jí)別。

微核(Micronucleus)，是在細(xì)胞的有絲分裂后期染色體有規(guī)律地進(jìn)入子細(xì)胞形成細(xì)胞核時(shí)，仍然滯留在細(xì)胞質(zhì)中的染色單體或染色體的無著絲點(diǎn)斷片，或因紡錘體受損而丟失的整條染色體，它在末期以后，單獨(dú)形成一個(gè)或幾個(gè)規(guī)則的次核，被包含在子細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)而形成，比主核小，大約為主核的1/5～1/20，故稱為微核。微核試驗(yàn)簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、快速，是國際公認(rèn)的致突變首選方法[13]。本次試驗(yàn)結(jié)果證明紫斑谷螟豹皮樟蟲茶受試物對(duì)小鼠沒有明顯致突變作用。這與之前所報(bào)道的貴州白茶[14]、三葉蟲茶[15-17]等研究結(jié)果相一致。但對(duì)于新食品資源的安全性確定還需要更多、更全面、多次重復(fù)反復(fù)的科學(xué)研究和更多的數(shù)據(jù)結(jié)果并且在充分考慮多種因素、生物學(xué)意義、不同人群群體差異等等多種情況下才能獲得較準(zhǔn)確的判斷和評(píng)價(jià)[18]。

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AcuteToxicityTestandMicronucleusTestofPyralisFarinalis-LitseaCoreanaInsectTeainMice

WANGFang，CHENSong，LIURen-pu，YANGMao-fa*

(InstituteofEntomology，GuizhouKeyLaboratoryforPlantPestsManagementofMountainousRegion，GuizhouUniversity，Guiyang，Guizhou550025，China)

The acute toxicity and mutagenicity ofPyralisfarinalis-LitseacoreanaInsect Tea in mice were investigated. Acute toxicity test， bone marrow polychromatic erythrocyte micronucleus test in mice were adopted. The results showed that the acute oral maximum LD50was higher than 30 g/kg·bw； the micronucleus test indicated that the difference between treating group and negative control group was not remarkable. The results proved that thePyralisfarinalis-LitseacoreanaInsect Tea is belongs to practical actox-ic and could not cause mutagenesis.

acute toxicity test； bone-marrow micronucleus test； mutation； mice

2017-05-09；

2017-09-16

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目“貴州主要蟲茶昆蟲生物學(xué)生態(tài)學(xué)及所產(chǎn)蟲茶評(píng)價(jià)研究”(31260526)。

*

楊茂發(fā)(1968-)，男，教授，博士生導(dǎo)師，主要研究方向：昆蟲及螨類系統(tǒng)學(xué)、害蟲綜合治理以及資源昆蟲學(xué)；E-mail： gdgdly@126.com。

Q291

A

1008-0457(2017)05-0058-04國際DOI編碼10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2017.05.010