閆碩，熊曉菲，褚艷娜，李貞，巫鵬翔，楊清坡，崔維娜，徐金濤，徐麗霞，張青文，劉小俠

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異色瓢蟲脅迫對棉鈴蟲生長發(fā)育及壓力蛋白基因表達的影響

閆碩1,2，熊曉菲3，褚艷娜1，李貞1，巫鵬翔1，楊清坡2，崔維娜4，徐金濤5，徐麗霞6，張青文1，劉小俠1

（1中國農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院，北京100193；2全國農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心，北京100125；3北京派得偉業(yè)科技發(fā)展有限公司，北京100097；4山東省鄒城市植物保護站，山東鄒城273500；5河北省農(nóng)林科學(xué)院昌黎果樹研究所，河北昌黎066600；6昌黎縣科學(xué)技術(shù)局，河北昌黎066600）

明確不同食源異色瓢蟲（）脅迫對棉鈴蟲（）生長發(fā)育和變態(tài)發(fā)育的影響，探討棉鈴蟲是否能感知并分級捕食風(fēng)險、能否在生長發(fā)育和變態(tài)發(fā)育上體現(xiàn)出權(quán)衡效應(yīng)；明確長時和短時脅迫對棉鈴蟲壓力蛋白基因表達的影響，探討異色瓢蟲脅迫能否引起棉鈴蟲分子水平上的生理反應(yīng)。通過設(shè)置7種不同食源的異色瓢蟲脅迫處理(饑餓處理、蝦卵處理、棉鈴蟲幼蟲處理、棉鈴蟲卵處理、蚜蟲處理、蚜蟲對照處理、對照處理)，觀察記錄棉鈴蟲在脅迫下的生長發(fā)育(幼蟲歷期、蛹歷期、雌雄蛾壽命、總壽命)和變態(tài)發(fā)育(蛹重、化蛹率、羽化失敗率、卷翅率)指標(biāo)；設(shè)置長時(1齡幼蟲至3日齡成蟲)和短時(15 min至6 h)異色瓢蟲脅迫處理，利用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測棉鈴蟲壓力蛋白基因(即熱激蛋白基因)和及熱激同源蛋白基因在脅迫后的表達水平變化。在捕食性天敵異色瓢蟲的脅迫下，棉鈴蟲幼蟲歷期、蛹期、雌雄蛾壽命、總壽命均顯著性縮短，蛹重和化蛹率顯著性下降，成蟲卷翅率顯著性升高，而羽化失敗率無顯著性變化。在不同食源的天敵脅迫下，棉鈴蟲幼蟲歷期在異色瓢蟲取食蚜蟲時最短，蛹歷期在瓢蟲取食棉鈴蟲卵時最短，總壽命在瓢蟲取食蝦卵時最短，而雌雄蛾壽命在不同食源天敵脅迫下未表現(xiàn)出顯著性差異；棉鈴蟲成蟲卷翅率在瓢蟲取食棉鈴蟲卵時最高，而蛹重、化蛹率、羽化失敗率在不同食源天敵脅迫下未表現(xiàn)出顯著性差異。壓力蛋白基因和在短時脅迫下(：30 min至3 h；：15 min、1.5 h、2 h、6 h)表達水平顯著性上調(diào)，熱激同源蛋白基因在長時脅迫下(5齡幼蟲、預(yù)蛹、雄蛹、雌蛾階段)表達水平顯著性上調(diào)。在面對捕食性天敵異色瓢蟲長時脅迫作用下，棉鈴蟲各生長發(fā)育階段均出現(xiàn)縮短的現(xiàn)象，即棉鈴蟲為躲避被捕食風(fēng)險表現(xiàn)出了發(fā)育加速的現(xiàn)象，而快速的生長發(fā)育在一定程度上干擾了變態(tài)發(fā)育，導(dǎo)致蛹重和化蛹率下降，成蟲卷翅率提高，符合權(quán)衡效應(yīng)。棉鈴蟲對不同食源的天敵脅迫具有不同程度的敏感性，即棉鈴蟲對潛在的捕食風(fēng)險可能存在一定的分級能力，但這種分級能力沒有得到規(guī)律性體現(xiàn)。異色瓢蟲脅迫能夠引起棉鈴蟲分子層面的生理反應(yīng)，導(dǎo)致壓力蛋白基因的表達上調(diào)，其中壓力蛋白基因和受到短時脅迫的反應(yīng)較為明顯，而熱激同源蛋白基因受到慢性脅迫刺激的反應(yīng)更為顯著。

棉鈴蟲；異色瓢蟲；生長發(fā)育；變態(tài)發(fā)育；壓力蛋白；非消耗性脅迫

0 引言

【研究意義】捕食性天敵-獵物關(guān)系是生態(tài)系統(tǒng)中最普遍的基本關(guān)系，對生態(tài)群落的發(fā)展具有重要意義[1-2]。自然界中捕食性天敵與獵物的作用關(guān)系除了直接的取食消耗（consumptive effect），還存在間接的脅迫效應(yīng)（non-consumptive effect）[3-4]。這種脅迫壓力帶來的影響在生物界中十分廣泛，對獵物具有深遠的意義[5-8]。了解天敵與獵物之間的直接與間接關(guān)系，是利用天敵防治害蟲，優(yōu)化生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的必要基礎(chǔ)?！厩叭搜芯窟M展】目前，關(guān)于捕食脅迫風(fēng)險對獵物的影響已涉及多種昆蟲，包括蜻蜓目[9-10]、蜉蝣目[11-12]、雙翅目[13-15]、直翅目[2,16]、同翅目[17]、鱗翅目[18-19]等昆蟲。現(xiàn)有的研究表明，捕食脅迫會造成獵物的發(fā)育加快或者減緩[11,15,20]、致死率升高[10]、變態(tài)成功率下降[21-22]，而獵物的應(yīng)激反應(yīng)往往在捕食者取食近源物種下最強烈[23-24]。捕食性天敵脅迫壓力能夠引起獵物分子水平上的生理反應(yīng)，如壓力蛋白（即熱激蛋白，一般在熱激反應(yīng)方面研究較多）表達量的上調(diào)[9,25-26]，糖皮質(zhì)激素水平升高[27-28]。棉鈴蟲（）食性雜，其寄主植物多達200多種，曾給中國棉花生產(chǎn)造成過巨大的經(jīng)濟損失[29]。Bt棉的種植雖然有效地控制了棉鈴蟲的暴發(fā)，但其抗藥性問題不容忽視[30-32]。生物防治作為一種有效的替代手段，符合綠色植保的發(fā)展理念，也是實現(xiàn)到2020年農(nóng)藥使用量零增長行動目標(biāo)的有力落腳點。目前，異色瓢蟲（）在生物防治領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，其適生性強，成蟲和高齡幼蟲均可大量捕食各類蚜蟲、多種介殼蟲、木虱、螨類、鱗翅目與鞘翅目昆蟲的卵、低齡幼蟲和蛹等[33-37]?！颈狙芯壳腥朦c】以異色瓢蟲和棉鈴蟲建立的脅迫體系研究卻寥寥無幾，棉鈴蟲受異色瓢蟲脅迫的影響有待闡明?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過設(shè)置不同食源的捕食性瓢蟲脅迫處理，探討：（1）棉鈴蟲是否能感知外界脅迫的存在，并對異色瓢蟲食源表現(xiàn)出敏感性；（2）脅迫下的棉鈴蟲是否會縮短發(fā)育歷期，以躲避被捕食風(fēng)險；（3）脅迫下的棉鈴蟲是否會表現(xiàn)出一定的權(quán)衡效應(yīng)，即發(fā)育歷期的縮短或延長是否會對變態(tài)發(fā)育造成一定的負面影響；（4）脅迫壓力能否引起棉鈴蟲分子層面的生理反應(yīng)。

1 材料與方法

試驗于2012年9月至2015年9月在中國農(nóng)業(yè)大學(xué)完成。

1.1 供試?yán)ハx

供試棉鈴蟲幼蟲采自河北邯鄲棉田，在無天敵環(huán)境下，飼養(yǎng)于中國農(nóng)業(yè)大學(xué)有害生物綜合治理實驗室。幼蟲用人工飼料單管飼養(yǎng)[38]，成蟲羽化后飼喂10%蜂蜜水。選取發(fā)育、繁殖情況穩(wěn)定良好的棉鈴蟲幼蟲進行脅迫試驗。捕食性天敵異色瓢蟲采自北京市農(nóng)林科學(xué)院植物保護環(huán)境保護研究所試驗田，室內(nèi)以豆蚜（）飼喂擴繁，僅取異色瓢蟲成蟲用于脅迫試驗。所有試蟲均在人工氣候箱中飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度（25±2）℃，相對濕度（75±5）%，光周期14L﹕10D。瓢蟲脅迫處理在全程安靜的環(huán)境中進行，盡量避免人為干擾。

1.2 試劑

RNAiso Plus（Trizol）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser、熒光定量染料SYBRPremix Ex TaqTM購自Takara公司；PCR MasterMix購自寶如億（北京）生物技術(shù)有限公司；IPTG、Amp購自Takara公司；X-gal購自北京拜爾迪生物有限公司；DNA膠回收試劑盒Gel Extraction Kit購自O(shè)mega公司；克隆載體pEASY-T1 Cloning Vector、感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；PCR引物由上海生工生物工程公司合成；其他試劑均為國產(chǎn)AR級或進口分裝AR級產(chǎn)品。

1.3 異色瓢蟲脅迫對棉鈴蟲生長發(fā)育的影響

取同日孵化、活性良好一致的棉鈴蟲初孵幼蟲為試驗材料，棉鈴蟲以人工飼料為食物源。試驗共設(shè)置以下7組處理用以分析異色瓢蟲取食不同食物對棉鈴蟲的脅迫效果，脅迫設(shè)置直至棉鈴蟲成蟲羽化。（1）饑餓處理：將棉鈴蟲和人工飼料放入經(jīng)滅菌的透明試管（直徑1.8 cm×長9.6 cm）中，以滅菌紗布封口，保持良好透氣性。將試管平鋪在滅菌的塑料養(yǎng)蟲盒（22 cm×15 cm× 8 cm）底部，每盒投放30頭不供給食物的饑餓瓢蟲，每日添加瓢蟲以維持瓢蟲數(shù)量；（2）蝦卵處理：同批次蝦卵購買于北京市官園花鳥蟲魚市場。將裝有棉鈴蟲的試管平鋪在塑料養(yǎng)蟲盒內(nèi)，每盒投放30頭異色瓢蟲，并投放充足的蝦卵，瓢蟲以蝦卵為食物來源；（3）棉鈴蟲幼蟲處理：將裝有棉鈴蟲的試管平鋪在塑料養(yǎng)蟲盒內(nèi)，每盒投放30頭異色瓢蟲，并投放充足的棉鈴蟲1齡幼蟲，瓢蟲以棉鈴蟲1齡幼蟲為食物來源；（4）棉鈴蟲卵處理：將裝有棉鈴蟲的試管平鋪在塑料養(yǎng)蟲盒內(nèi)，每盒投放30頭異色瓢蟲，并投放充足的棉鈴蟲卵，瓢蟲以棉鈴蟲卵為食物來源；（5）蚜蟲處理：將裝有棉鈴蟲的試管平鋪在塑料養(yǎng)蟲盒內(nèi)，每盒投放30頭異色瓢蟲，并投放充足的蚜蟲，瓢蟲以蚜蟲為食物來源；（6）蚜蟲對照處理：將裝有棉鈴蟲的試管平鋪在塑料養(yǎng)蟲盒內(nèi)，不投放瓢蟲，只投放蚜蟲作對照，排除蚜蟲釋放信號的干擾；（7）對照處理：將裝有棉鈴蟲的試管平鋪在塑料養(yǎng)蟲盒內(nèi)，不投放瓢蟲。羽化成蟲單獨飼養(yǎng)，繼續(xù)觀察壽命直至成蟲死亡。7個處理彼此隔離，設(shè)置3次重復(fù)，每個重復(fù)包含50頭棉鈴蟲，觀察統(tǒng)計棉鈴蟲各蟲態(tài)的發(fā)育歷期（刨除不能正?；肌⒂鸹膫€體），統(tǒng)計3日齡蛹重、化蛹率、羽化失敗率和成蟲卷翅率。

1.4 異色瓢蟲長時和短時脅迫對棉鈴蟲壓力蛋白基因表達的影響

長時脅迫取樣：取發(fā)育進度一致、活性良好的初孵棉鈴蟲幼蟲600頭單頭飼養(yǎng)，棉鈴蟲以人工飼料為食物源。將試蟲分為2個處理：（1）長時脅迫處理：置于有30頭異色瓢蟲存在的養(yǎng)蟲盒內(nèi)飼養(yǎng)，瓢蟲以蚜蟲為食物來源；（2）對照處理：置于無瓢蟲存在的養(yǎng)蟲盒內(nèi)飼養(yǎng)。分別在棉鈴蟲幼蟲5個齡期、預(yù)蛹期、第3日齡蛹期和第3日齡成蟲期取樣，對蛹和成蟲分雌、雄取樣。于棉鈴蟲發(fā)育過程中的每個取樣點取3個生物學(xué)重復(fù)。

短時脅迫取樣：取發(fā)育進度一致、活性良好的棉鈴蟲3齡幼蟲300頭單頭飼養(yǎng)，棉鈴蟲以人工飼料為食物源。將試蟲分為2個處理：（1）短時脅迫處理：置于有30頭異色瓢蟲存在的養(yǎng)蟲盒內(nèi)，瓢蟲以蚜蟲為食物來源；（2）對照處理：置于無瓢蟲存在的養(yǎng)蟲盒內(nèi)飼養(yǎng)。分別在脅迫進行15 min、30 min、1 h、1.5 h、2 h、3 h、6 h時間點取樣。每個取樣點取3個生物學(xué)重復(fù)。

借助Trizol法對棉鈴蟲樣本進行RNA提取，反轉(zhuǎn)錄生成cDNA。借助實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測壓力蛋白基因（熱激蛋白基因）和、熱激同源蛋白基因的表達量。根據(jù)Genbank已公布的基因序列和發(fā)表的文章[39]，設(shè)計qRT-PCR引物（表1）。在qRT-PCR之前，通過測序保證PCR產(chǎn)物是目的基因片段，PCR擴增程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃30 s，60℃30 s，72℃60 s，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將回收的目的條帶與克隆載體連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌內(nèi)，37℃培養(yǎng)過夜。菌落進行藍白斑篩選，隨機選取陽性克隆送至北京擎科生物技術(shù)有限公司測序。基因的相對表達量檢測在Bio-RAD CFX Connect Real-Time System儀器上進行。選取棉鈴蟲為內(nèi)參基因[40-44]。qRT-PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性10 min；95℃，15 s，60℃，30 s，72℃，35 s，40個循環(huán)，此外再加上qRT-PCR儀器自帶的熔解步驟。檢測所取樣本中目的基因和內(nèi)參基因的Ct值，每個樣本設(shè)置3次點樣重復(fù)，基因相對表達量的計算采用2-ΔΔCt方法[45]進行。

表1 實時熒光定量PCR所用引物

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析采用Tukey比較和獨立樣本檢驗方法進行，＜0.05視為差異顯著。所有統(tǒng)計分析借助SPASS 16.0軟件包完成。

2 結(jié)果

2.1 不同食源異色瓢蟲脅迫對棉鈴蟲發(fā)育歷期的影響

不同食源的瓢蟲脅迫顯著縮短了棉鈴蟲幼蟲歷期、蛹歷期和棉鈴蟲的總壽命，瓢蟲以蚜蟲為食源時，棉鈴蟲幼蟲歷期縮短最顯著；以棉鈴蟲卵為食源時，棉鈴蟲蛹歷期縮短最顯著；以蝦卵為食源時，棉鈴蟲總壽命縮短最顯著。在7個處理之間，瓢蟲脅迫后棉鈴蟲雌雄蛾壽命雖然有縮短的趨勢，但7個處理間無顯著性差異。在比較的5個指標(biāo)中，蚜蟲對照處理與對照處理均不存在顯著性差異，排除了瓢蟲取食蚜蟲脅迫處理中可能因蚜蟲存在而引起的干擾因素。將總脅迫處理與總對照處理進行比較，棉鈴蟲幼蟲歷期、蛹歷期、雌雄蛾壽命以及總壽命在脅迫因子存在下均顯著性縮短（表2）。

2.2 不同食源異色瓢蟲脅迫對棉鈴蟲變態(tài)發(fā)育的影響

不同食源的瓢蟲脅迫處理顯著提高了棉鈴蟲成蟲卷翅率，瓢蟲以棉鈴蟲卵為食源時，棉鈴蟲成蟲卷翅率提高最顯著；以棉鈴蟲幼蟲為食源時，成蟲卷翅率提高程度最小。在7個處理之間，瓢蟲脅迫后棉鈴蟲蛹重和化蛹率有下降趨勢、羽化失敗率有提高趨勢，但7個處理間無顯著性差異。在比較的5個指標(biāo)中，蚜蟲對照處理與對照處理均不存在顯著性差異，排除了瓢蟲取食蚜蟲脅迫處理中可能因蚜蟲存在而引起的干擾因素。將總脅迫處理與總對照處理進行比較，在脅迫因子存在下，棉鈴蟲蛹重和化蛹率均顯著下降，成蟲卷翅率顯著性上升（表3）。

表2 不同食源異色瓢蟲脅迫對棉鈴蟲發(fā)育歷期的影響

數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，不同字母表示處理間差異顯著（Tukey比較，＜0.05）。下同

Each value was the mean±SE of three collections. Different letters indicated significant differences among treatments according to Tukey comparison test (＜0.05). The same as below

表3 不同食源異色瓢蟲脅迫對棉鈴蟲變態(tài)發(fā)育的影響

2.3 異色瓢蟲長時脅迫對壓力蛋白基因表達的影響

對比脅迫與對照處理的棉鈴蟲各個蟲態(tài)壓力蛋白基因的表達量（圖1），結(jié)果表明脅迫與對照處理的相對表達量隨蟲齡變化趨勢較為一致，在1—2齡階段低水平表達，3—4齡階段出現(xiàn)表達峰值（脅迫處理：9,20=17.277，＜0.001；對照處理：9,20=15.212，＜0.001）。脅迫處理中3齡幼蟲的表達量顯著升高（=7.980，df=4，=0.001），而其他發(fā)育階段，脅迫與對照處理間不存在顯著性差異（1齡：=0.406，df=4，=0.705；2齡：=0.251，df=4，=0.814；4齡：=2.136，df=4，=0.100；5齡：=1.893， df=4，=0.131；預(yù)蛹：=0.008，df=4，=0.994；雌蛹：=1.951，df=4，=0.123；雄蛹：=1.393，df=4，=0.236；雌蛾：=1.258，df=4，=0.277；雄蛾：=2.356，df=4，=0.078）。對表達量檢測結(jié)果表明（圖1），在對照處理中，在蛹期和成蟲期表達水平較高（9,20=81.327，＜0.001），在棉鈴蟲各個生長發(fā)育階段，脅迫與對照處理之間均無顯著性差異（1齡：=1.782，df=4，=0.149；2齡：=4.098，df=2.014，=0.054；3齡：=2.737，df=4，=0.052；4齡：=1.185，df=4，=0.302；5齡：=0.650，df=2.182，=0.577；預(yù)蛹：=0.374，df=4，=0.728；雌蛹：=1.017，df=4，=0.367；雄蛹：=0.657，df=4，=0.547；雌蛾：=0.741，df=2.022，=0.535；雄蛾：=2.348，df=2.044，=0.141）。

在對照處理中，熱激同源蛋白基因在蛹期和成蟲期表達水平高（9,20=299.092，＜0.001）。棉鈴蟲在進入5齡后，脅迫處理中表達有上調(diào)趨勢，其中在棉鈴蟲5齡幼蟲期、預(yù)蛹期、雄蛹期、雌蛾期，脅迫處理中表達水平顯著高于對照處理（5齡：=11.48，df=4，＜0.001；預(yù)蛹期：=39.998，df=4，＜0.001；雄蛹期：=3.046，df=4，=0.038；雌蛾期：=3.976，df=4，=0.016）。而在棉鈴蟲其他發(fā)育階段，脅迫與對照處理間無顯著性差異（1齡：=0.538，df=4，=0.619；2齡：=2.392，df=4，=0.075；3齡：=1.583，df=2.261，=0.240；4齡：=0.048，df=4，=0.964；雌蛹：=2.638，df=2.239，=0.106；雄蛾：=3.184，df=2.013，=0.085）（圖1）。

1st：1齡幼蟲1st instar larvae；2nd：2齡幼蟲2nd instar larvae；3rd：3齡幼蟲3rd instar larvae；4th：4齡幼蟲4th instar larvae；5th：5齡幼蟲5th instar larvae；PP：預(yù)蛹prepupa；FP：雌蛹female pupae；MP：雄蛹male pupae；FM：雌蛾female moth；MM：雄蛾male moth

2.4 異色瓢蟲短時脅迫對壓力蛋白基因表達的影響

無脅迫因子存在下，棉鈴蟲3齡幼蟲3個壓力蛋白基因的表達水平比較穩(wěn)定（：6,14=1.650，=0.206；：6,14=5.590，=0.004；：6,14=2.412，=0.082）。短時脅迫后，棉鈴蟲3齡幼蟲和的表達有上調(diào)趨勢，在脅迫開始30 min至3 h內(nèi)表達量顯著提升（30 min：=5.269，df=4，=0.006；1 h：=3.538，df=4，=0.024；1.5 h：=4.559，df=2.02，=0.044；2 h：=4.478，df=4，=0.011；3 h：=3.183，df=4，=0.033）；在脅迫開始15 min、1.5 h、2 h和6 h時間點表達量顯著提升（15 min：=3.057，df=4，=0.038；1.5 h：=4.391，df=4，=0.012；2 h：=13.06，df=4，＜0.001；6 h：=10.895，df=4，＜0.001）。而短時脅迫處理后，棉鈴蟲的表達水平?jīng)]有出現(xiàn)顯著性變化（15 min：=0.777，df=2.008，=0.518；30 min：=0.660，df=2.180，=0.572；1 h：=1.462，df=4，=0.217；1.5 h：=0.310，df=4，=0.772；2 h：=1.042，df=2.029，=0.406；3 h：=2.094，df=4，=0.104；6 h：=3.035，df=2.132，=0.086）。綜合短時脅迫各時間點數(shù)據(jù)，結(jié)果表明棉鈴蟲3齡幼蟲受到短時脅迫后，和表達增強，表達無顯著性變化（：=6.520，df=40，＜0.001；：=3.884，df=40，＜0.001；：=0.383，df=32.867，=0.704）（圖2）。

圖2 異色瓢蟲短時脅迫對棉鈴蟲Hsp70、Hsp90、Hsc70基因表達的影響

3 討論

捕食脅迫作用可能引起獵物發(fā)育加快或者減慢，獵物選擇哪種策略與其生態(tài)特點相關(guān)，同時取決于哪種策略有利于其增加存活率[14-15,20]。本試驗表明捕食性天敵異色瓢蟲的脅迫導(dǎo)致棉鈴蟲各蟲態(tài)發(fā)育歷期及成蟲壽命的縮短，此現(xiàn)象在筆者實驗室之前的研究中也有類似發(fā)現(xiàn)[19]。異色瓢蟲傾向于取食棉鈴蟲低齡幼蟲，對高齡幼蟲的捕食現(xiàn)象偶然才會發(fā)生，棉鈴蟲蛹多位于土中被隔離，且蛹殼質(zhì)地硬，不利于瓢蟲捕食，成蟲由于生活棲境的改變而免于被瓢蟲捕食的風(fēng)險[35-36]。因此，加快幼蟲期的生長發(fā)育對于棉鈴蟲來說，有助于快速脫離被捕食的高風(fēng)險蟲態(tài)，逃避捕食風(fēng)險，增加存活率，這一變化對種群發(fā)展具有積極意義。而棉鈴蟲蛹和成蟲發(fā)育歷期縮短的現(xiàn)象，有可能與加快發(fā)育進度的策略有關(guān)，也有可能是其他表型變化的副產(chǎn)物。獵物在脅迫下發(fā)育變緩或加快，紅眼樹蛙（）幼蟲階段受到捕食性蝽（spp.）脅迫時會加快發(fā)育，而受到覓食水生蜘蛛（spp.）脅迫時，則會減緩發(fā)育[20]；黑腹果蠅（）在面對龜紋瓢蟲（）捕食性脅迫的體系中，也表現(xiàn)了不同程度的發(fā)育加快現(xiàn)象[15]。

獵物對捕食脅迫的適應(yīng)性反應(yīng)建立在獵物對脅迫風(fēng)險的感知和識別的基礎(chǔ)之上，獵物是否能夠識別環(huán)境中的捕食風(fēng)險，是否有對風(fēng)險進行分級的能力，將決定獵物采取何種策略[46-49]。天敵取食食源的不同往往為天敵貼上了某種化學(xué)信號標(biāo)簽，不同食源的天敵對某一種特定獵物來說所暗示的捕食風(fēng)險不同。本試驗設(shè)置7種食源的捕食性瓢蟲，棉鈴蟲幼蟲歷期、蛹歷期和壽命在不同食源的捕食性瓢蟲脅迫下具有顯著性差異，暗示棉鈴蟲對不同食源的瓢蟲脅迫具有一定的敏感性，但在發(fā)育歷期的指標(biāo)上，這種敏感性沒有得到規(guī)律性體現(xiàn)，這可能與棉鈴蟲對風(fēng)險評估的敏感性、選取指標(biāo)的靈敏性等因素有關(guān)。Brodin等[24]設(shè)置不同食源的捕食者泉蜓（）脅迫一種豆娘（）幼蟲，食物充足條件下，的行為防御反應(yīng)在捕食者取食同源物種的處理下最強烈，這種影響在蜻蜓幼蟲發(fā)育早期顯著，而后期不顯著；Chivers等[23]通過對豆娘混合種群（spp.）幼蟲設(shè)置不同食源捕食者梭子魚（）證實，豆娘對豆娘食源環(huán)境刺激反應(yīng)顯著比對照強烈，而對黃粉蟲（）食源環(huán)境反應(yīng)不明顯。這反應(yīng)了蜻蜓和豆娘幼蟲對脅迫程度具有一定的識別能力，將天敵取食食源的不同定為不同的風(fēng)險等級，進而采取不同強烈程度的適應(yīng)性反應(yīng)。因為獵物與其近源獵物擁有共同天敵的概率較大，當(dāng)近源獵物遭遇捕食時，釋放出的危險信號對獵物的警示作用更強，進而更容易采取防御措施抵御或逃避被捕食的風(fēng)險。

天敵脅迫作用引入的表型變化，有可能在防御反應(yīng)與發(fā)育表現(xiàn)上反應(yīng)出權(quán)衡效應(yīng)。本試驗結(jié)果表明加快的發(fā)育進度引起了變態(tài)成功率不同程度的降低，蛹重和羽化率顯著下降，卷翅率顯著上升，表明了過快的生長發(fā)育對變態(tài)過程產(chǎn)生了負面的影響，與權(quán)衡理論相符。但5種食源的捕食性瓢蟲處理之間，只有卷翅率存在顯著性差異，而其他變態(tài)指標(biāo)沒有顯著性變化，沒有體現(xiàn)出不同食源天敵捕食脅迫的敏感性。權(quán)衡效應(yīng)也在其他昆蟲中被證實，一種蜉蝣（）在有捕食性魚類存在的溪流中表現(xiàn)出變態(tài)后個體變小，繁殖力下降的現(xiàn)象[11]；一種蚊子（）暴露于捕食性魚信號的環(huán)境下，存活率提高但發(fā)育減緩，變態(tài)時體型變小，并且成蟲對饑餓的耐受力減弱[50]。翅的對稱性是壓力反應(yīng)的可靠指示指標(biāo)，在捕食性天敵脅迫下，艷麗絲蟌（）會降低發(fā)育的穩(wěn)定性，提高后翅的不對稱性[22]。Mangel等[51]認為生物體最大化的生長率能夠在之后的生活史中表現(xiàn)出一定代價，因為過快的生長速率降低了細胞與免疫功能的功效，使其對生理壓力的抵抗力降低。綜上所述，在面對捕食性瓢蟲長時脅迫作用下，棉鈴蟲為了躲避捕食風(fēng)險和適應(yīng)環(huán)境，表現(xiàn)出了發(fā)育加速的現(xiàn)象，而快速的生長發(fā)育在一定程度上干擾了變態(tài)發(fā)育。

自然界中多變的脅迫因子能給生物的生長發(fā)育、種群發(fā)展與進化造成重要影響，天敵脅迫作用對獵物生理生化方面的影響涉及諸多方面[52-56]。本試驗設(shè)計長時脅迫和短時脅迫兩種水平的脅迫處理，檢測2種重要的壓力蛋白基因和，以及熱激同源蛋白基因的表達量水平，以探討天敵脅迫是否能夠誘導(dǎo)棉鈴蟲體內(nèi)壓力蛋白基因的表達變化。在長時脅迫下，棉鈴蟲自5齡幼蟲起，的表達有上調(diào)趨勢；在短時脅迫下，和的表達有上調(diào)趨勢?？梢姴妒趁{迫，無論是慢性作用還是急性作用，都不同程度地影響了棉鈴蟲體內(nèi)壓力蛋白基因的表達水平，使其產(chǎn)生了一定的應(yīng)激反應(yīng)。棉鈴蟲壓力蛋白基因與受到短時脅迫的反應(yīng)較為明顯，而熱激同源蛋白基因受到慢性脅迫刺激的反應(yīng)更為顯著，這可能與三者執(zhí)行的功能不同有關(guān)。盡管捕食壓力對生物來說是非常普遍的選擇壓力，但是目前有關(guān)脅迫壓力響應(yīng)的分子機制尚不清楚。在蛋白水平上，心斑綠蟌（）在捕食性魚5 d的脅迫處理下，表達水平未受影響，而表達水平顯著上調(diào)[9]；以魚激素作為捕食者存在的化學(xué)信號，大型水蚤（）在捕食性天敵的脅迫處理下，在脅迫6 h表達顯著上調(diào)，24 h后回落[26]；鯽魚（）在藍鰓太陽魚（）脅迫下，視葉中在脅迫6 h高水平表達，在12 h表達水平回落，暗示視覺在脅迫中起到重要的作用[25]。綜上所述，面對捕食性天敵脅迫，不同種類壓力蛋白的表達水平與脅迫處理時間、獵物物種有關(guān)，但總體來說，脅迫下的壓力蛋白含量呈現(xiàn)出上調(diào)或不變的趨勢。本試驗結(jié)果與這一趨勢相符，進一步證明捕食性瓢蟲脅迫壓力能夠引起棉鈴蟲分子層面的生理反應(yīng)，這種生理反應(yīng)與應(yīng)對脅迫壓力可能有著密切關(guān)系。而且，棉鈴蟲在脅迫壓力作用下的分子生理反應(yīng)機制，很可能與其在脅迫壓力下的生長發(fā)育、變態(tài)發(fā)育等表型變化相關(guān)。

4 結(jié)論

在面對捕食性瓢蟲長時脅迫作用下，棉鈴蟲為了躲避被捕食風(fēng)險表現(xiàn)出了發(fā)育加速的現(xiàn)象，而快速的生長發(fā)育在一定程度上干擾了變態(tài)發(fā)育，導(dǎo)致蛹重和羽化率顯著下降，卷翅率顯著上升。棉鈴蟲對不同食源的天敵捕食脅迫具有不同程度的敏感性，即棉鈴蟲對潛在的捕食風(fēng)險可能存在一定的分級能力，但這種分級能力沒有得到規(guī)律性體現(xiàn)。捕食性瓢蟲脅迫壓力能夠引起棉鈴蟲分子層面的生理反應(yīng)，其壓力蛋白基因與受到短時脅迫的反應(yīng)較為明顯，表現(xiàn)為基因表達的上調(diào)，而熱激同源蛋白基因受到慢性脅迫刺激的反應(yīng)更為顯著，同樣表現(xiàn)出表達上調(diào)的現(xiàn)象，暗示三者在棉鈴蟲體內(nèi)執(zhí)行的功能存在差異，這種生理反應(yīng)（基因表達水平的變化）可能與應(yīng)對脅迫壓力有著密切的關(guān)系。

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（責(zé)任編輯 岳梅）

Effects of Predator-Induced Stress fromon the Development and Stress Protein Gene Expression of

YAN Shuo1,2, XIONG XiaoFei3, CHU YanNa1, LI Zhen1, WU PengXiang1, YANG QingPo2, CUI WeiNa4, XU JinTao5, XU LiXia6, ZHANG QingWen1, LIU XiaoXia1

(1College of Plant Protection, China Agricultural University, Beijing 100193;2National Agricultural Technology Extension and Service Center, Beijing 100125;3Beijing PAIDE Science and Technology Development Co., Ltd., Beijing 100097;4Zoucheng Plant Protection Station, Zoucheng 273500, Shandong;5Changli Institute of Pomology, Hebei Academy of Agricultural and Forestry Sciences, Changli 066600, Hebei;6Changli County Bureau of Science and Technology, Changli 066600, Hebei)

The objective of this study is to determine the effects of predator-induced stress fromwith various feeding resources on the development and metamorphose of, illustrating that whethercan perceive and classify the predation risk, and show the trade-off characteristic between the development and metamorphose, and to determine the effects of long-term and short-term stress on the stress protein gene expression of, illustrating that whether the predator-induced stress fromcan induce the physiological reactions ofat molecular level.The development (larval and pupal duration, female and male longevity, and total longevity) and metamorphose (pupae weight, pupation rate, fail eclosion rate, and wrinkled-wing rate) indicators ofwere observed and recorded under the predator-induced stress fromwith 7 kinds of feeding resources (hungry treatment, shrimp egg treatment, cotton bollworm larva treatment, cotton bollworm egg treatment, aphid treatment, CK treatment with aphid, and CK treatment). Long-term (first instar larvae to 3-day-old moth) and short-term (15 min to 6 h) stress treatments were set up, and the changes of stress protein genes (heat shock protein genes)and, heat shock cognate protein geneexpression were determined under the predator-induced stress by quantitative real-time PCR (qRT-PCR).Under the predator-induced stress from, larval and pupal duration, female and male longevity, and total longevity ofshortened, pupal weight and pupation rate decreased, and wrinkled-wing rate increased significantly, whereas the fail eclosion rate was not influenced by the predator-induced stress. Under the predator-induced stress fromwith various food sources, the larval duration ofwas the shortest when predators consumed aphids, the pupal duration was the shortest when predators consumed cotton bollworm eggs, and the total longevity was the shortest when predators consumed shrimp eggs, whereas the female and male longevity were not influenced by the diets of. The wrinkled-wing rate ofwas the highest when predators consumed cotton bollworm eggs, whereas the pupal weight, pupation rate, and fail eclosion rate were not influenced by the diets of. Stress protein genesandwere up-regulated after short-term stress (: 30 min to 3 h;: 15 min, 1.5 h, 2 h and 6 h), whereas heat shock cognate protein genewas up-regulated after long-term stress (the stages of 5th instar larvae, prepupa, male pupae and male moth).Under the long-term stress from, all developmental stages ofshortened, and the development ofbecame faster to avoid the predation risk. The developmental acceleration might disturb the metamorphose ofto some degree, leading the smaller pupal weight, lower pupation rate, and higher wrinkled-wing rate, which was according with the trade-off hypothesis. The sensitiveness ofto predator-induced stress were different among various diets of, andmight be able to classify the potential predation risk, however this ability showed a degree of uncertainty. The predator-induced stress fromcould induce the physiological reactions ofat molecular level, leading the higher expression levels of stress protein genes.andexpressions were more affected by the short-term stress, whereasexpression was more affected by long-term stress.

;; development; metamorphose; stress protein; non-consumptive effect

2017-05-25；接受日期：2017-07-14

國家自然科學(xué)基金（31572018）

閆碩，E-mail：yanshuo2011@foxmail.com。通信作者劉小俠，E-mail：liuxiaoxia611@cau.edu.cn