毛鑫　王鋒　楊傳桃

摘要：以名貴藥材白芨[Bletilla striata （Thunb.） Reichb. f.]種子萌發(fā)的無菌苗作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，建立了白芨快速繁殖技術(shù)體系。結(jié)果表明，白芨種子萌發(fā)率最高的培養(yǎng)基為MS+1.6 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA；誘導(dǎo)愈傷組織的最佳培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+1.5 mg/L 2，4-D；叢生芽增殖效果最明顯的培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.15 mg/L NAA；0.5 mg/L GA3對(duì)白芨幼苗的生根作用最為明顯，組培苗移栽以泥炭為基質(zhì)時(shí)存活率和生長(zhǎng)狀況最佳。

關(guān)鍵詞：白芨[Bletilla striata （Thunb.） Reichb.f.]；種子；無菌苗；增殖；快速繁殖

中圖分類號(hào)：S567.23+9.1+2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）20-3898-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.20.026

Abstract： The sterile seedlings from seeds of Bletilla striata （Thunb.） Reichb. f. were used as explants for tissue culture and establish a rapid propagation technology system. As the study shows，the best culture medium for the sprouting of the B. striata is as follows：MS+1.6 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA；the best culture medium for the callus induction is as follows：MS+1.0 mg/L 6-BA+1.5 mg/L 2，4-D；the culture medium of the multiple shoots which has the most obvious propagation effect is as follows：MS+1.0 mg/L 6-BA+0.15 mg/L NAA；0.5 mg/L GA3 has the most distinct rooting effects on the B. striata seeding，the peat soil transplating substrate of blettila organizational seedings is the best.

Key words： Bletilla striata （Thunb.） Reichb. f.； seed； sterile seedlings； proliferation； grapid production

白芨[Bletilla striata（Thunb.）Reichb.f.]又叫明白芨、紫蘭根、甘根、白給，為蘭科（Orchidaceae）白芨屬（Bletilla Reichb.f.）多年生草本植物[1，2]。白芨塊根為名貴藥材，具有收斂止血、消腫生肌的功效，民間用于治療外傷出血、燒傷燙傷、手足皸裂等[3]。白芨種子細(xì)小、種皮為單層細(xì)胞組成，胚不分化，無胚乳，在野生條件下很難萌發(fā)[4]。加上多年的過度采挖及環(huán)境的日益惡化，野生白芨的數(shù)量急劇減少。白芨目前已被列為國(guó)家珍稀瀕危保護(hù)植物[5]。目前市場(chǎng)上白芨人工栽培主要依靠分株繁殖[6]，這種繁殖方式不僅周期長(zhǎng)，技術(shù)不成熟，而且由于缺乏優(yōu)良品種，很難滿足白芨的市場(chǎng)需求[7-10]。因此，保護(hù)白芨資源、解決白芨繁殖困難的問題迫在眉睫。有關(guān)白芨的快速繁殖已有許多報(bào)道，袁寧等[11]發(fā)現(xiàn)，白芨組織培養(yǎng)受培養(yǎng)基影響較大，最適合萌發(fā)的培養(yǎng)基是MS基本培養(yǎng)基；張燕等[12]發(fā)現(xiàn)低濃度的6-BA、KT抑制白芨種子的萌發(fā)和生長(zhǎng)；喻蘇琴等[13]利用白芨種子進(jìn)行無菌播種，比較了培養(yǎng)條件對(duì)白芨種子萌發(fā)的效應(yīng)。本試驗(yàn)通過改變植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合及其濃度配比，比較了植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)白芨種子萌發(fā)的影響，篩選叢生芽增殖培養(yǎng)和生根培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基，旨在為建立無性繁殖體系、實(shí)現(xiàn)白芨快速繁殖和工廠化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及處理

白芨種子及其無菌苗以及植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑NAA、6-BA、2，4-D、GA3由生物資源保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；選取白芨種子作為外植體，流水沖洗2 h后用濾紙吸干水分，在超凈工作臺(tái)上用75%乙醇浸泡30 s左右，然后用0.1%的升汞振蕩消毒3 min，去離子水清洗5次，再接種到培養(yǎng)基中。

1.2 基本培養(yǎng)條件

試驗(yàn)里基本培養(yǎng)基均為MS培養(yǎng)基，加蔗糖25 mg/L、瓊脂6.5 mg/L、活性炭1 mg/L；培養(yǎng)室內(nèi)的環(huán)境條件均為溫度25～28 ℃，光照度1 800 lx，光照時(shí)間10 h/d。

1.3 培養(yǎng)方法

1.3.1 種子萌發(fā)培養(yǎng)基篩選 在MS基本培養(yǎng)基里添加不同濃度的NAA（0.1、0.2、0.3、0.4 mg/L）和6-BA（1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mg/L）兩兩組合，有24個(gè)處理，另設(shè)一空白對(duì)照（CK1），共25個(gè)處理，處理編號(hào)1～25，每個(gè)處理接種10瓶，將準(zhǔn)備好的白芨種子隨機(jī)選取10粒，用移液槍均勻地接種在含有不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)條件為前述的基本培養(yǎng)條件。20 d后觀察培養(yǎng)結(jié)果，以篩選出白芨種子萌發(fā)的最佳培養(yǎng)基。

1.3.2 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基篩選 切取白芨種子萌發(fā)的無菌苗莖段（約0.5 cm）作為外植體，接種至MS培養(yǎng)基中，添加不同濃度的6-BA（0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L）和2，4-D（0.5、1.0、1.5、20 mg/L）兩兩組合，有16個(gè)處理，另設(shè)一空白對(duì)照（CK2），共17個(gè)處理，處理編號(hào)26～42，每個(gè)處理接種10個(gè)外植體，10次重復(fù)，置于培養(yǎng)室中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同上，30 d后計(jì)算其誘導(dǎo)率。endprint

1.3.3 叢生芽增殖培養(yǎng)基篩選 將白芨的愈傷組織接種至MS培養(yǎng)基中，添加不同濃度的6-BA（0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L）和NAA（0.10、0.15、0.20 mg/L）兩兩組合，有12個(gè)處理，另設(shè)一空白對(duì)照（CK3），共13個(gè)處理，處理編號(hào)43～55，每個(gè)處理接種3個(gè)外植體，10次重復(fù)，置于培養(yǎng)室中培養(yǎng)，記錄叢生芽的增殖情況，到60 d計(jì)算誘導(dǎo)率。

1.3.4 生根培養(yǎng)基篩選 剪取上述培養(yǎng)得到的單根芽，接種到MS培養(yǎng)基中，附加不同濃度的GA3（0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/L），共6個(gè)處理，處理編號(hào)56～61，置于培養(yǎng)室中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同上，培養(yǎng)25 d后觀察白芨叢生單根芽的生根狀況，篩選適合白芨叢生單根芽生根的最佳培養(yǎng)基。

1.4 煉苗移栽

選取生長(zhǎng)旺盛、葉片多且根系發(fā)達(dá)的白芨組培生根苗，打開瓶蓋，放置在培養(yǎng)室中馴化3～5 d；然后小心取出生根苗，用流水洗凈根部的培養(yǎng)基，移栽至分別由蛭石、珍珠巖、泥炭組成的栽培基質(zhì)中，在植物培養(yǎng)室中培養(yǎng)30 d，培養(yǎng)溫度25 ℃，光照度2 200 lx，光照時(shí)間15 h/d，觀察并記錄白芨組培生根苗在各栽培基質(zhì)中的生長(zhǎng)情況和存活率。

2 結(jié)果與分析

2.1 NAA和6-BA對(duì)白芨種子萌發(fā)的影響

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑NAA和6-BA對(duì)白芨種子萌發(fā)的影響情況見表1。從表1可知，不添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的處理其白芨種子萌發(fā)率很低，僅為7%；NAA與6-BA以一定濃度配比后，白芨種子才能取得較好的萌發(fā)效果；其中以NAA 0.3 mg/L+6-BA 1.6 mg/L組合的白芨種子萌發(fā)率最高，可達(dá)98%。

2.2 6-BA和2，4-D對(duì)白芨愈傷組織誘導(dǎo)的影響

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑6-BA和2，4-D對(duì)白芨種子萌發(fā)的無菌苗莖段愈傷組織誘導(dǎo)的影響情況見表2。從表2可知，添加不同濃度配比的6-BA和2，4-D培養(yǎng)基對(duì)白芨無菌苗莖段愈傷組織的誘導(dǎo)有不同的影響作用，其中6-BA濃度為1.0 mg/L、2，4-D濃度為1.5 mg/L時(shí)，誘導(dǎo)率最大，為67%，誘導(dǎo)效果相對(duì)最好。

2.3 NAA和6-BA對(duì)白芨愈傷組織叢生芽增殖的影響

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑NAA和6-BA對(duì)白芨愈傷組織叢生芽增殖的影響情況見表3。從表3可見，添加不同濃度配比的NAA和6-BA對(duì)白芨愈傷組織叢生芽增殖有不同的影響，其中6-BA濃度為1.0 mg/L、NAA濃度為0.15 mg/L時(shí)，增殖效果最明顯，誘導(dǎo)率達(dá)96.7%。

2.4 GA3對(duì)白芨叢生單根芽生根的影響

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑GA3對(duì)白芨叢生單根芽生根的影響情況見表4。由表4可知，不添加任何植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑時(shí)，白芨叢生單根芽長(zhǎng)勢(shì)差，添加適當(dāng)?shù)蜐舛鹊腉A3可以促進(jìn)白芨叢生單根芽生根，其中0.5 mg/L GA3處理的生根效果最明顯，但GA3促進(jìn)白芨生根的機(jī)制尚不清楚。關(guān)于GA3促進(jìn)植物生根的情況也有報(bào)道，陳仕江等[14]發(fā)現(xiàn)適當(dāng)濃度的GA3能促進(jìn)金釵石斛（Dendrobium nobile Lindl.）的生根。劉世彪等[15]發(fā)現(xiàn)GA3可以提高火棘[Pyracantha fortuneana（Maxim.）Li]插條的生根率。

2.5 組培苗的移栽

用蛭石、珍珠巖、泥炭不同栽培基質(zhì)種植白芨組培生根苗，比較各栽培基質(zhì)對(duì)白芨組培生根苗存活和生長(zhǎng)的影響，結(jié)果見表5。從表5可知，以泥炭作為基質(zhì)移栽白芨組培生根苗的生長(zhǎng)狀況最好，存活率最高，達(dá)到96.7%，其原因可能是泥炭中富含豐富的有機(jī)質(zhì)、有助于白芨組培生根苗的生長(zhǎng)所致。

3 小結(jié)

試驗(yàn)選取從種子→無菌苗→愈傷組織→叢生芽誘導(dǎo)→單根芽誘導(dǎo)生根→煉苗移栽這一技術(shù)流程，建立了白芨快速繁殖體系，實(shí)現(xiàn)了白芨組織培養(yǎng)苗的快速大量繁殖。結(jié)果顯示，白芨種子萌發(fā)的最佳培養(yǎng)基為MS+1.6 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA；愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+1.5 mg/L 2，4-D；叢生芽的增殖效果最明顯培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.15 mg/L NAA；0.5 mg/L的GA3對(duì)促進(jìn)白芨叢生單根芽生根的作用最明顯，白芨組培苗移栽的基質(zhì)以泥炭最佳。

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