馬曉波，徐和平，房麗麗，時(shí)藝，朱波，鄭燕青

(廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，福建廈門 361003)

·調(diào)查研究·

12例慢性化膿性中耳炎分離西弗射盾子囊霉的鑒定特征分析*

馬曉波，徐和平，房麗麗，時(shí)藝，朱波，鄭燕青

(廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，福建廈門 361003)

目的分析自慢性化膿性中耳炎患者中耳分泌物分離的西弗射盾子囊霉的實(shí)驗(yàn)室檢查特征，為少見真菌的診治提供依據(jù)。方法納入西弗射盾子囊霉相關(guān)慢性化膿性中耳炎患者12例。培養(yǎng)其中耳分泌物，觀察真菌的菌落特征和鏡下特征，采用Vitek 2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)進(jìn)行菌種鑒定。結(jié)果西弗射盾子囊霉在血平板、巧克力平板和沙氏平板等臨床常用培養(yǎng)基上均可生長，且在28 ℃和35 ℃均生長較好。培養(yǎng)1周后菌落呈奶油色、鑲嵌生長，質(zhì)地硬，周邊呈花邊樣。該菌在科瑪嘉念珠菌顯色培養(yǎng)基上為中央藍(lán)色、邊緣白色的凸起小菌落。鏡下特征為孢子和菌絲同時(shí)可見，小培養(yǎng)觀察時(shí)可見菌絲有分隔，真菌孢子呈芽生型、形態(tài)卵圓、部分可沿菌絲排列。西弗射盾子囊霉可同化利用許多碳水化合物和常見氨基酸。用Vitek 2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)可鑒定該菌。結(jié)論西弗射盾子囊霉是一種非常少見的機(jī)會(huì)致病性真菌，臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)重視中耳分泌物中此真菌的培養(yǎng)鑒定。

西弗射盾子囊霉；慢性化膿性中耳炎；形態(tài)學(xué)檢查；鑒定

西弗射盾子囊霉(Stephanoascusciferrii)既往曾用名有西弗念珠菌(Candidaciferrii)、類西弗念珠菌(Candidaallociferrii)和西弗毛滴蟲(Trichomonascusciferrii)，是一種非常少見的機(jī)會(huì)致病性真菌。目前，已有報(bào)道顯示西弗射盾子囊霉可導(dǎo)致多種感染[1-7]。2012年6月至2017年6月期間我院共診治慢性化膿性中耳炎患者938例，其中，12例患者中耳分泌物培養(yǎng)分離到西弗射盾子囊霉。本文總結(jié)分析12例西弗射盾子囊霉的培養(yǎng)鑒定要點(diǎn)及慢性化膿性中耳炎患者的臨床特征，以期為少見真菌的診治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)及臨床經(jīng)驗(yàn)，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1研究對象 收集12例慢性化膿性中耳炎患者的中耳分泌物，標(biāo)本的采集和送檢遵循《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》(第3版)[8]。男性4例、女性8例，年齡(43.3±21.9)歲，職業(yè)包括公司職員、學(xué)生、公務(wù)員和無業(yè)人員等。

1.2試劑與儀器 哥倫比亞血平板、沙氏平板和巧克力平板(鄭州安圖生物公司)；科瑪嘉顯色平板(上?？片敿喂?。Vitek 2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)及配套的YST鑒定卡、ATB FUNGUS 3試條(法國生物梅里埃公司)。

1.3細(xì)菌培養(yǎng)及鑒定 標(biāo)本接種哥倫比亞血平板、巧克力平板、沙氏平板以及科瑪嘉顯色平板，分別置于35 ℃及28 ℃培養(yǎng)，24 h后連續(xù)觀察菌落形態(tài)。真菌小培養(yǎng)操作參照《醫(yī)學(xué)真菌學(xué)》[9]。經(jīng)革蘭染色、乳酸酚棉藍(lán)染色后觀察菌體形態(tài)及小培養(yǎng)的菌絲形態(tài)。用Vitek 2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)及配套的YST鑒定卡進(jìn)行細(xì)菌鑒定。

1.4分子生物學(xué)鑒定 用德國Qiagen試劑盒提取真菌DNA，采用ITS通用引物(ITS-1： 5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，ITS-4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物送北京睿博興科公司測序，結(jié)果經(jīng)https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed網(wǎng)站BALST比對。

1.5藥敏試驗(yàn) 用ATB FUNGUS 3試條進(jìn)行體外抗菌活性檢測，35 ℃溫育24 h觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1菌落特征 西弗射盾子囊霉在哥倫比亞血平板、巧克力平板、沙氏平板均能生長，且在28 ℃和35 ℃均生長良好。培養(yǎng)24 h后可見圓形光滑小菌落，呈乳白色；48 h菌落呈鑲嵌生長，質(zhì)地硬，不易刮起、研碎;1周后可見奶油色(或略呈淡黃色)、粗糙大菌落，表面可見細(xì)微絨毛狀氣生菌絲，凸出平板生長，菌落中心呈腦回樣或菜花狀、菌落邊緣皺折似花邊。西弗射盾子囊霉在科瑪嘉顯色培養(yǎng)基上生長良好，菌落鑲嵌平板，呈規(guī)則圓形，菌落中心藍(lán)色、邊緣白色，形似“小蘑菇”狀。見圖1。隨培養(yǎng)時(shí)間延長，菌落開始粗糙，有腦回狀溝槽，邊緣不整。

注：A, 血平板35 ℃培養(yǎng)10 d；B, 沙氏平板28 ℃培養(yǎng)1周；C, 科瑪嘉顯色平板35 ℃培養(yǎng)5 d。

圖1 西弗射盾子囊霉的菌落形態(tài)

2.2鏡下特征 真菌菌落直接革蘭染色鏡檢見革蘭陽性酵母樣真菌及細(xì)長菌絲，孢子為單細(xì)胞、卵圓形、沿菌絲周邊分布，見圖2。采用小培養(yǎng)法觀察，可見豐富的菌絲體，分枝分隔。分枝菌絲上，芽生出子囊孢子，孢子為單細(xì)胞、卵圓形狀，排列緊密、大小不一，另外部分孢子沿菌絲排列生長，見圖2。

注：A,血平板35 ℃培養(yǎng)10 d后革蘭染色，見酵母樣真菌及細(xì)長菌絲；B,小培養(yǎng)28 ℃培養(yǎng)1周后乳酸酚棉藍(lán)染色見分枝分隔菌絲；C,小培養(yǎng)28 ℃培養(yǎng)1周后乳酸酚棉藍(lán)染色見子囊孢子。

圖2 西弗射盾子囊霉的鏡下形態(tài)(×1 000)

2.3生化反應(yīng)特征 Vitek 2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)及配套YST鑒定卡可信度為99%，重復(fù)鑒定率為100%，生化反應(yīng)可同化利用大多數(shù)碳水化合物，包括半乳糖、木糖、蔗糖、D-葡萄糖、D-麥芽糖、D-山梨糖、D-海藻糖、D-棉子糖、D-甘露糖、L-阿拉伯糖。并可同化利用乳酸鹽、醋酸鹽、葡萄糖酸鹽、L-蘋果酸、丙三醇、木糖醇、D-山梨醇、亮氨酸、精氨酸、酪氨酸等。

2.4分子生物學(xué)特征 經(jīng)ITS測序，結(jié)果經(jīng)BALST比對，與基因庫注冊的Trichomonascusciferrii(序列號：KP132796)和Candidaallociferrii(序列號：KY101922)同源性均為99%。

2.5體外藥敏特征 所有菌株體外最低抑菌濃度(MIC)均為：5-氟胞嘧啶≤4 μg/mL、兩性霉素B≤0.125 μg/mL、氟康唑≤1 μg/mL、伊曲康唑≤0.125 μg/mL、伏立康唑≤0.06 μg/mL。

3 討論

子囊菌隸屬于真菌界(Fungi)、子囊菌門(Ascomycota)、酵母綱(Saccharomycetes)、酵母目(Saccharomycetales)、酵母菌科(saccharomycetales)、子囊菌屬(Stephanoascus)[10]。子囊菌有很多種，共同特征是有性生殖形成子囊孢子[11]。西弗射盾子囊霉是臨床上子囊菌病病原體中最主要的一個(gè)種。

據(jù)調(diào)查，西弗射盾子囊霉在耳道分泌物、腦脊液、腹膜透析液和血液中均有分離的報(bào)道[1-7]。2012年6月至2017年6月期間我院共診治慢性化膿性中耳炎患者938例，但僅不到1/4的患者送檢標(biāo)本進(jìn)行培養(yǎng)檢查，分離菌包括金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、卡他莫拉菌、β溶血鏈球菌以及曲霉和念珠菌等。西弗射盾子囊霉為臨床少見真菌，我們在12例慢性化膿性中耳乳突炎的中耳分泌物分離到該菌。患者的臨床病程長短不一，不僅累及老年患者，而且可在中青年患者發(fā)病，免疫力正常人群亦可發(fā)病。臨床上，西弗射盾子囊霉相關(guān)慢性化膿性中耳炎表現(xiàn)為耳道流膿，膿液呈黃色略帶臭味，多伴耳鳴，常會(huì)導(dǎo)致鼓膜穿孔引起聽力下降，因此會(huì)影響患者的生活質(zhì)量。炎癥發(fā)生部位多為乳突，治療上外科手術(shù)能得到比較理想的效果。

臨床采集中耳膿液進(jìn)行培養(yǎng)，對發(fā)現(xiàn)西弗射盾子囊霉有較高價(jià)值。而該菌在標(biāo)本直接涂片上形態(tài)無特異性、與酵母菌相似，不利于早期診斷。西弗射盾子囊霉在血平板、巧克力平板和沙氏平板等臨床常用培養(yǎng)基上均可生長，且在28 ℃和35 ℃均生長較好。值得注意的是，該菌在科瑪嘉念珠菌顯色培養(yǎng)基上為中心藍(lán)色、邊緣白色的腦回狀菌落，易于觀察。西弗射盾子囊霉的鏡下特征為孢子和菌絲同時(shí)可見，小培養(yǎng)觀察時(shí)可見菌絲有分隔，真菌孢子呈芽生型、形態(tài)卵圓、部分可沿菌絲排列。西弗射盾子囊霉可同化利用大多數(shù)碳水化合物和氨基酸等，這可與毛孢子菌區(qū)別，毛孢子菌缺乏利用碳水化合物的能力，鏡下可見關(guān)節(jié)樣孢子。

我們采用ATB Fungus 3 酵母菌藥敏測試條檢測抗真菌藥物對西弗射盾子囊霉的體外活性，顯示5-氟胞嘧啶的MIC為≤4 μg/mL、兩性霉素B≤0.125 μg/mL、氟康唑≤1 μg/mL、伊曲康唑≤0.125 μg/mL、伏立康唑≤0.06 μg/mL，與文獻(xiàn)報(bào)道[1]相同。由于ATB Fungus 3用于念珠菌和隱球菌藥敏測試，用于西弗射盾子囊霉還有待進(jìn)一步研究。 綜上，西弗射盾子囊霉是一種非常少見的機(jī)會(huì)致病性真菌，會(huì)導(dǎo)致慢性化膿性中耳乳突炎。西弗射盾子囊霉不難培養(yǎng)，臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)加強(qiáng)對該菌的認(rèn)識。

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2017-07-30)

(本文編輯：劉群)

IdentificationandfeatureanalysisofStephanoascusciferriiisolatedfrom12caseswithchronicsuppurativeotitismedia

MAXiao-bo,XUHe-ping,FANGLi-li,SHIYi，ZHUBo,ZHENGYan-qing

(DepartmentofClinicalLaboratoryMedicine,theFirstAffiliatedHospitalofXiamenUniversity,Xiamen361003,Fujian,China)

ObjectiveTo study the laboratory features ofStephanoascusciferriiisolated from middle ear excretion of the patients with chronic suppurative otitis media for providing the basis of diagnosis for the rare fungus infection.MethodsThe study was performed for 12 patients who were suffered from chronic suppurative otitis media associated withStephanoascusciferrii. The secretions of middle ear were cultured and the macroscopic features of colony and cells of the fungi were observed. The species of the fungi was identified by Vitek 2 Compact system.ResultsStephanoascusciferriimay grow on common media such as blood plate, chocolate plate and sabourauad plate, at 28 to 35 ℃. The form of the colonies displayed cream-colored, rough, hard and wrinkled quality after 1 week incubation. On CHROMagar medium the colonies looked like small mushroom with blue center and white edge. Under microscopy, abundant branched septate mycelium with small ramified chains of oval blastoconidia and the conidia were arranged along the side of hyphae. The fungi strain may assimilate lots of carbohydrates and common amino acid. Vitek 2 Compact automated system should be able to identifyStephanoascusciferrii.ConclusionStephanoascusciferriiis a rare opportunistic pathogenic fungus. In clinical laboratories special attentions should be paid to culture and identification of the fungus from middle ear excretion.

Stephanoascusciferrii; chronic suppurative otitis media; morphological examination; identification

10.13602/j.cnki.jcls.2017.10.11

福建省衛(wèi)生聯(lián)合資金面上項(xiàng)目(2016J01647)。

馬曉波，1980年生，男，副主任技師，碩士研究生，主要從事病原檢驗(yàn)及細(xì)菌耐藥研究。

鄭燕青，副主任技師，大學(xué)本科，E-mail:zheng_yan_qing@126.com。

R446.5

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