徐和平，黃江山

(廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，福建廈門 361003)

臨床常見曲霉形態(tài)學(xué)鑒定

徐和平，黃江山

(廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，福建廈門 361003)

曲霉感染發(fā)生率居系統(tǒng)性真菌感染的第二位，快速準(zhǔn)確檢測和鑒別曲霉具有重要的臨床意義。目前曲霉鑒定方法包括傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定、質(zhì)譜、DNA序列分析等技術(shù)。對于廣大的臨床微生物實(shí)驗(yàn)室而言，曲霉的形態(tài)學(xué)鑒別還是目前主要的鑒定手段。該文介紹當(dāng)前曲霉的分類進(jìn)展，用圖文結(jié)合的方式詳細(xì)描述標(biāo)本中曲霉的菌絲形態(tài)、培養(yǎng)條件、各屬形態(tài)學(xué)特點(diǎn)，對臨床微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室鑒定曲霉有參考和指導(dǎo)價值。

曲霉；分類；培養(yǎng)；形態(tài)學(xué)

曲霉(Aspergillus)在自然界廣泛存在，種類眾多(約180多種)。其中少數(shù)為機(jī)會致病菌，可引起人類的曲霉病，導(dǎo)致肺部(侵襲性曲霉病、肺曲霉球、超敏反應(yīng)等)、外耳道、皮膚、指甲、骨骼等部位感染。少數(shù)的菌株還可產(chǎn)生曲霉毒素(黃曲霉毒素等)，引起中毒、腫瘤發(fā)生。由曲霉導(dǎo)致的感染發(fā)生率在系統(tǒng)性真菌感染中居第二位，僅次于念珠菌，且發(fā)病隱匿，進(jìn)展迅速，臨床癥狀和影像學(xué)不夠典型和特異，缺乏安全有效的抗真菌治療手段，病死亡率高，故早期、快速、正確地鑒定出曲霉感染，對目標(biāo)治療具有重要的臨床意義。目前曲霉鑒定除傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定外，已經(jīng)開始應(yīng)用質(zhì)譜、DNA序列分析等技術(shù)。但質(zhì)譜、DNA序列分析目前存在儀器價格昂貴，標(biāo)本的培養(yǎng)與制備未標(biāo)準(zhǔn)化、參考數(shù)據(jù)菌庫的建立還需要完善，以及外送檢驗(yàn)時效性差等諸多因素限制了其在廣大基層醫(yī)院的應(yīng)用。對于廣大的臨床微生物實(shí)驗(yàn)室而言，曲霉的形態(tài)學(xué)鑒別還是目前主要的鑒定手段。本文將從曲霉的形態(tài)特點(diǎn)、培養(yǎng)條件等方面進(jìn)行闡述，以期對臨床微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室鑒定曲霉有參考和指導(dǎo)價值。

1 曲霉的分類

曲霉隸屬于真菌界(Fungi)、子囊菌門(Ascomycota)、子囊菌亞門(Pezizomycotina)、散囊菌綱(Eurotiomycetes)、散囊菌目(Eurotiales)、發(fā)菌科(Trichocomaceae)、曲霉屬(Aspergillus)。最近，通過多基因法的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，對核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)、β-微管蛋白(β-tubulin)、鈣調(diào)節(jié)蛋白(calmodulin)、肌動蛋白(ACT)、RNA聚合酶Ⅱ(RPB2)等基因位點(diǎn)分型，把曲霉分為5個亞屬(subgenera)：曲霉亞屬(Aspergillus)、煙曲亞屬(Fumigati)、環(huán)繞亞屬(Circumdati)、巢狀亞屬(Nidulantes)和華麗亞屬(Ornati)，這5個亞屬又分為16個組(section)：煙色組(Fumigati)、棒狀組(Clavati)、局限組(Restricti)、曲霉組(Aspergillus)、亮白組(Candidi)、黑色組(Nigri)、環(huán)繞組(Circumdati)、黃色組(Falvi)、黃柄組(Flavipedes)、土生組(Terrei)、焦色組(Usti)、雜色組(Versicolores)、構(gòu)巢組(Nidulantes)、鹿皮色組(Cervini)、稀疏組(Sparsi)、Cremei組(Cremei)[1]。過去使用的復(fù)合群(complex)的分類逐漸被更為準(zhǔn)確的組和分支(clade)所替代。

2 標(biāo)本直接鏡檢

組織標(biāo)本、痰、氣管抽吸物、肺泡灌洗液、耳道分泌物以及其他樣本，可以采用革蘭染色、KOH、熒光白染色、六胺銀染色(GMS)、HE染色、PAS染色等方法檢測曲霉菌絲，但直接鏡檢陽性率比較低。對于高度懷疑曲霉感染患者，可以使用10% KOH消化后離心濃縮鏡檢以提高陽性率。使用GMS、HE、PAS染色等病理染色技術(shù)時，注意避免標(biāo)本研磨，因?yàn)榛铙w的菌絲通常呈嗜堿性或雙染色性，而死亡或損害的菌絲因細(xì)胞壁損壞常為嗜酸性[2]。曲霉在組織中主要以菌絲形態(tài)表現(xiàn)，菌絲通常為透明、分隔、45°銳角分枝；在病理組織標(biāo)本中呈平行或放射狀擴(kuò)散于整個組織中，在肺曲霉球患者可見菌絲成團(tuán)；在與空氣直接接觸的耳道、氣道標(biāo)本中有時可見曲霉頭。見圖1。

3 曲霉培養(yǎng)

大部分曲霉生長要求不高，在血平板、巧克力平板、中國藍(lán)平板、沙氏培養(yǎng)基(SDA)、馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA)均可以生長，而大部分曲霉科瑪嘉顯色培養(yǎng)生長十分局限。不同培養(yǎng)基上曲霉生長成熟的速度相差較大，以SDA和PDA生長成熟最快。因此臨床上為準(zhǔn)確快速分離鑒定出曲霉，建議鏡檢陽性標(biāo)本常規(guī)接種SDA和PDA，而不應(yīng)使用科瑪嘉顯色培養(yǎng)基作為絲狀真菌初代培養(yǎng)基。曲霉在25～37 ℃ 均可生長，但同樣存在生長速度的快慢不一，因此建議同時放置25 ℃ 和35 ℃ 兩個溫度培養(yǎng)，見圖2、圖3。濕度對曲霉的生長影響較小，但為防止培養(yǎng)基長期培養(yǎng)干枯開裂而影響曲霉生長，故保持一定的濕度環(huán)境還是有必要。

部分曲霉需要提供高滲培養(yǎng)條件才能促進(jìn)其生長和產(chǎn)孢(如局限曲霉)，可以把SDA和PDA的含糖量(葡萄糖或蔗糖)從20 g/L提高到200 g/L，將明顯加快該類曲霉的生長速度。部分曲霉耐受高溫，可以相應(yīng)提高生長溫度(45 ℃)，以達(dá)到鑒別診斷目的。

注：A，痰標(biāo)本，KOH,×400；B，肺泡灌洗液，革蘭染色，×1 000；C，肺泡灌洗液，抗酸染色，×1 000；D，肺泡灌洗液，六胺銀染色，×1 000；E，耳道標(biāo)本，熒光白染色，×400；F，耳道標(biāo)本，革蘭染色，×400；G，肺組織，六胺銀染色，×400；H，肺組織，HE染色，×400；I，肺組織，PAS染色，×400。

圖1 組織及體液標(biāo)本中曲霉直接鏡檢

圖2 煙曲霉在不同培養(yǎng)基和溫度培養(yǎng)48 h生長對比

注：A，土曲霉科瑪嘉顯色培養(yǎng)基，35 ℃ 培養(yǎng)6 d；B，煙曲霉科瑪嘉顯色培養(yǎng)基，35 ℃ 培養(yǎng)6 d；C，煙曲霉科瑪嘉顯色培養(yǎng)基背面，35 ℃ 培養(yǎng)6 d；D，雜色曲霉,PDA，28 ℃ 培養(yǎng)6 d；E，雜色曲霉，PDA，35 ℃ 培養(yǎng)6 d；F，雜色曲霉, 科瑪嘉顯色培養(yǎng)基，35 ℃ 培養(yǎng)6 d。

圖3 不同培養(yǎng)條件下曲霉生長情況

4 曲霉的形態(tài)鑒定

曲霉可以從菌落和鏡下形態(tài)特征來鑒定。菌落可從生長速度、質(zhì)地、溝紋、高度、邊緣形態(tài)、正反面顏色、色素和滲出液等方面觀察。曲霉的生長速度較快，一般72 h內(nèi)成熟，但亦有部分菌株生長比較緩慢。菌落初期通常為白色，之后，因不同的菌種變成綠色、黃色、黑色或棕褐色，質(zhì)地粉狀，背面通常為白色或褐色。鏡下形態(tài)主要從菌絲形態(tài)、足細(xì)胞、分生孢子頭、分生孢子、殼細(xì)胞、菌核、閉囊殼等方面進(jìn)行辨別。曲霉菌絲有隔、無色透明或呈明亮的顏色，但不呈暗色。分生孢子梗莖以大體垂直的方向從足細(xì)胞生出，不分支，梗莖光滑或粗糙。其頂端膨大形成不同形狀的頂囊，從其表面形成產(chǎn)孢細(xì)胞。產(chǎn)孢細(xì)胞有單層和雙層之分，單層是自頂囊表面生出一層安瓿狀瓶梗(小梗)，再在其上形成分生孢子；雙層是自頂囊表面先生出一層上大下小的柱形細(xì)胞，成為梗基，由梗基上產(chǎn)生瓶梗，瓶梗上再形成分生孢子。分生孢子為單細(xì)胞，具有不同形狀和各種顏色，光滑或粗糙有棘，連接成不分支的鏈狀。由頂囊到分生孢子鏈構(gòu)成不同形狀的分生孢子頭，呈現(xiàn)不同顏色。有的種可形成厚壁的殼細(xì)胞，形狀因種而異；有的種則可以形成菌核或類菌核結(jié)構(gòu)；還有的種產(chǎn)生有性階段，形成閉囊殼。閉囊殼是一個體積較大、圓形、封閉的多細(xì)胞結(jié)構(gòu)的子實(shí)體，表面為緊密交織菌絲包裹，其內(nèi)含子囊和子囊孢子，子囊孢子大多透明或具有不同顏色、形狀和紋飾[3]。菌核是由菌絲緊密連接交織而成的休眠體，內(nèi)層是疏松組織，外層是擬薄壁組織，形成壁厚、色深、較堅硬菌絲體顆粒。菌核的功能主要是抵御不良環(huán)境，可耐高溫，低溫及干燥保存。當(dāng)環(huán)境適宜時，菌核能萌發(fā)產(chǎn)生新的營養(yǎng)菌絲或從上面形成新的繁殖體。臨床常見曲霉形態(tài)學(xué)特點(diǎn)[4-18]見表1，示意圖見圖4-13。

表1 常見曲霉鑒定索引表

注：A，PDA，28 ℃ 2 d；B，中國藍(lán)平板，28 ℃ 2 d；C，白色煙曲霉，PDA，28 ℃ 10 d；D、E，分生孢子頭，乳酸酚棉藍(lán)染色，×400；F，分生孢子頭，乳酸酚棉藍(lán)染色，×1 000。

圖4 煙曲霉

注：A，PDA, 28 ℃ 7 d; B，血平板,28 ℃ 5 d; C，菌核(箭頭所示黑色顆粒)，SDA,28 ℃ 21 d; D，分生孢子頭,單層小梗(箭頭所示)，乳酸酚棉藍(lán)染色，×100; E，分生孢子頭，雙層小梗(箭頭所示)，乳酸酚棉藍(lán)染色，×1 000；F，分生孢子頭，生理鹽水鏡檢，×1 000，箭頭所示為粗糙有刺的分生孢子梗莖。

圖5 黃曲霉

注：A，PDA，28 ℃ 4 d；B，中國藍(lán)平板，28 ℃ 4 d；C，血平板，28 ℃ 4 d；D，分生孢子頭，雙層小梗(箭頭所示)，乳酸酚棉藍(lán)染色，×400；E，曲霉頭，生理鹽水鏡檢，×1 000；F，分生孢子，乳酸酚棉藍(lán)染色，×1 000。

圖6 黑曲霉

注：A，PDA，28 ℃ 7 d；B，SDA，28 ℃ 7 d；C，SDA，28 ℃ 4 d，可見可溶性紅色色素；D、E，分生孢子頭，雙層小梗(箭頭所示)，乳酸酸酚棉藍(lán)染色，×400；F，粉孢子，乳酸酚棉藍(lán)染色，×1 000。

圖7 土曲霉

注：A，PDA，28 ℃ 7 d; B，菌核，PDA，28 ℃ 21 d；C，閉囊殼，乳酸酚棉藍(lán)染色，×1 000；D，分生孢子頭，雙層小梗(箭頭所示)，乳酸酚棉藍(lán)染色，×400；E，殼細(xì)胞，乳酸酚棉藍(lán)染色，×1 000；F，分生孢子頭，乳酸酚棉藍(lán)染色，×400。

圖8 構(gòu)巢曲霉

注：A, PDA,28 ℃ 7 d; B, SDA,28 ℃ 7 d; C, 察氏培養(yǎng)基，28 ℃ 7 d; D, PDA,28 ℃ 7 d, 鏡下形態(tài)，未染色，×100；E，分生孢子頭，未染色, ×1 000；F，分生孢子頭，乳酸酚棉藍(lán)染色，×1 000。

圖9 棒曲霉

注：A, SDA, 28 ℃ 7 d; B, PDA,28 ℃ 7 d; C, 察氏培養(yǎng)基,28 ℃ 7 d; D, 分生孢子頭，雙層小梗(箭頭所示)，乳酸酚棉藍(lán)染色，×400; E, 分生孢子頭，乳酸酚棉藍(lán)染色，×400；F, 殼細(xì)胞，未染色，×1 000。

圖10 焦曲霉

注：A, PDA, 28 ℃ 10 d; B, SDA, 28 ℃ 10 d; C, PDA, 28 ℃ 14 d; D,分生孢子頭, 雙層小梗(箭頭所示), 乳酸酚棉藍(lán)染色，×1 000; E、F, 分生孢子頭，青霉樣不完整頂囊，乳酸酚棉藍(lán)染色，×400。

圖11 聚多曲霉

注：A、B, PDA, 28 ℃ 10 d; C, SDA, 28 ℃ 10 d; D, 分生孢子頭，雙層小梗(箭頭所示)，乳酸酚棉藍(lán)染色，×1 000; E、F，分生孢子頭，青霉樣不完整頂囊，乳酸酚棉藍(lán)染色，×1 000。

圖12 雜色曲霉

注：A, 200 g/L葡萄糖的PDA,28 ℃ 7 d; B, 200 g/L葡萄糖的SDA,28 ℃ 14 d; C, 20 g/L葡萄糖的SDA,28 ℃ 7 d; D、E, 200 g/L葡萄糖的PDA, 分生孢子頭，乳酸酚棉藍(lán)染色，×400；F, 20 g/L葡萄糖的PDA,28 ℃ 7 d,分生孢子頭,乳酸酚棉藍(lán)染色，×400。

圖13 局限曲霉

5 形態(tài)學(xué)鑒定應(yīng)注意的問題

曲霉培養(yǎng)最好使用察氏培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)使其呈現(xiàn)其標(biāo)準(zhǔn)菌落形態(tài)，而在沙氏培養(yǎng)基、血平板、巧克力平板等分離培養(yǎng)基上，曲霉生長速度、菌落顏色、產(chǎn)孢速度等方面有比較大偏差，會誤導(dǎo)鑒定方向。菌落大小、正反面顏色、紋理、色素、是否分泌液滴對曲霉鑒定有指導(dǎo)意義。但多次傳代培養(yǎng)會引起菌落變異，菌落顏色消失逐漸變成白色，液滴和色素消失，影響菌種辨別。鏡下主要從分生孢子頭形態(tài)來辨別，但部分菌株由于藥物和宿主因素可導(dǎo)致變異而產(chǎn)孢缺乏，可以通過更換培養(yǎng)基(察氏培養(yǎng)基)、改變光照(如紫外照射)，提高培養(yǎng)溫度(45 ℃或48 ℃ )、切開培養(yǎng)基阻斷營養(yǎng)供給等方式促進(jìn)產(chǎn)孢，若仍然不產(chǎn)孢，需通過分子生物學(xué)方法鑒定[19]。未來可能還將運(yùn)用曲霉的蛋白質(zhì)組、代謝組、氣味等來鑒定。

臨床分離培養(yǎng)出曲霉后，一定要與患者臨床癥狀、影像學(xué)、曲霉相關(guān)的血清學(xué)檢查(GM試驗(yàn)、曲霉抗原等)相結(jié)合，尤其是來源于開放部位分離的曲霉，應(yīng)排除污染或定植。

致謝：本文部分圖片得到陳東科、陳會、占萍、錢雪琴、馮長海、王沖等同仁幫助，謹(jǐn)表謝意！

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2017-08-01)

(本文編輯：劉群)

10.13602/j.cnki.jcls.2017.10.09

徐和平，1972年生，男，副主任技師，從事微生物檢驗(yàn)工作。

黃江山，主任技師，E-mail:13600918159@163.com。

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