馮長(zhǎng)海

(寧波美康盛德醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司，浙江寧波 315100)

改良透明膠帶法在絲狀真菌形態(tài)觀察中的應(yīng)用

馮長(zhǎng)海

(寧波美康盛德醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司，浙江寧波 315100)

目的建立一種操作簡(jiǎn)單且顯微成像效果較佳的絲狀真菌制片技術(shù)。方法將玻片的非毛玻璃端粘貼一層透明膠帶，其上垂直平貼粘有真菌的透明膠帶，真菌剛好鄰近兩條膠帶的交叉線，然后在膠帶交叉處側(cè)面滴加微量乳酸酚棉藍(lán)，待染液浸染真菌后，鏡下觀察真菌的形態(tài)特征。結(jié)果改良透明膠帶法制片觀察可見(jiàn)，真菌孢子形態(tài)、特征及孢子間、菌絲間、孢子和菌絲間位置排列較清晰，鏡檢效果尚佳。結(jié)論改良透明膠帶法與傳統(tǒng)透明膠帶法相比，乳酸酚棉藍(lán)染色鏡檢背景清晰、絲狀真菌完整的典型結(jié)構(gòu)較易獲得，但存在絲狀真菌有時(shí)不在同一平面導(dǎo)致成像模糊的缺陷，仍需進(jìn)一步研究。

透明膠帶法；絲狀真菌；形態(tài)學(xué)；顯微成像

透明膠帶法是微生物實(shí)驗(yàn)室常用的形態(tài)學(xué)鑒定絲狀真菌方法，操作簡(jiǎn)單，快速有效，在真菌形態(tài)學(xué)鑒定中發(fā)揮非常重要的作用[1-3]。但使用透明膠帶法鏡檢時(shí)常會(huì)出現(xiàn)真菌孢子間、菌絲間、孢子和菌絲間位置排列關(guān)系混亂，不易出現(xiàn)真菌的典型結(jié)構(gòu)，造成真菌形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果不可靠。本文將透明膠帶法進(jìn)行改良，從乳酸酚棉藍(lán)作為浮載液，試用于曲霉、毛霉等12種真菌，取得較好的顯微鏡檢效果，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1試劑 乳酸酚棉藍(lán)，馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar，PDA)培養(yǎng)基。

1.2耗材 透明膠帶(寬18 mm)，載玻片(一端為毛玻璃)，一次性無(wú)菌加樣槍頭。

1.3菌種 構(gòu)巢曲霉、煙曲霉、毛霉、橫梗霉、根霉、多育賽多孢、申克孢子絲菌、白僵菌、明臍霉、彎孢霉、斷發(fā)毛癬菌、紅色毛癬菌，來(lái)源于美國(guó)病理學(xué)家協(xié)會(huì)(College of American Pathologists，CAP)的能力驗(yàn)證活動(dòng)(proficiency testing，PT)樣本，轉(zhuǎn)種PDA斜面、密封后室溫保存。

1.4方法 將實(shí)驗(yàn)菌株接種在PDA培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)，待菌株成熟后備用。取一張95%乙醇浸洗后的潔凈玻片，毛玻璃端可標(biāo)記菌種編號(hào)，另一端覆蓋透明膠帶，稱為膠帶端(見(jiàn)圖1A)；另取一段透明膠帶，用無(wú)菌鑷子夾住膠帶兩端，使膠帶呈氣球狀，用氣球狀膠帶的頂端粘取真菌菌落(見(jiàn)圖1B)；將粘取真菌菌落的膠帶的一端粘貼于玻片的膠帶端，緩慢松開(kāi)鑷子，使膠帶的另一端向玻片毛玻璃端平鋪(注意膠帶和玻片間盡量避免形成較大空隙)，而粘取的真菌剛好鄰近兩條膠帶垂直相交的交叉線(見(jiàn)圖1C)；用加樣槍取約5 μL乳酸酚棉藍(lán)(浮載液量可根據(jù)粘取菌量稍作調(diào)整)，沿膠帶交叉處側(cè)面緩慢加入(見(jiàn)圖1D)，待菌體充分浸染后鏡檢。

注：A，透明膠帶(箭頭所指)粘貼在玻片非毛玻璃端;B，透明膠帶粘取真菌菌落;C，粘有真菌的透明膠帶平鋪于玻片;D，兩條透明膠帶交叉處加入乳酸酚棉藍(lán)。1504為CAP2015年4號(hào)PT樣本分離的煙曲霉菌編號(hào)。

圖1 改良透明膠帶法制片流程

2 結(jié)果

改良后的透明膠帶法試用于曲霉、毛霉等菌株取得較好的顯微成像效果，實(shí)驗(yàn)菌株鏡下均出現(xiàn)完整的特征結(jié)構(gòu)。見(jiàn)圖2。

圖2 實(shí)驗(yàn)菌株乳酸酚棉藍(lán)染色后鏡檢效果

3 討論

傳統(tǒng)的透明膠帶法是將浮載液先滴加于玻片上，然后將粘有真菌的透明膠帶平貼于玻片上，真菌和浮載液接觸后再和玻片接觸。絲狀真菌的形態(tài)特征在接觸浮載液、平鋪固定于玻片的過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)改變：浮載液接觸真菌時(shí)的表面張力和液體的流動(dòng)力以及膠帶的平鋪力均可破壞真菌孢子排列方式，如曲霉鏡下孢子散亂，難見(jiàn)典型的曲霉頭完整結(jié)構(gòu)或曲霉頭結(jié)構(gòu)不清晰，很難獲得背景清晰，結(jié)構(gòu)典型完整的圖像。改良透明膠帶法是將粘有絲狀真菌的膠帶直接平鋪于玻片上，即將懸空的絲狀真菌固定于膠帶后再用浮載液浸染；2張膠帶間形成的微小空隙也限制了浸染真菌的浮載液量及染液擴(kuò)散速度。雖然這種固定真菌形態(tài)的方法也并不牢固，浮載液作用后也可見(jiàn)零亂的孢子，但采用此法后，顯微鏡下較易獲得背景清晰，結(jié)構(gòu)典型完整的圖像，說(shuō)明浮載液浸染對(duì)真菌形態(tài)破壞力較弱，真菌形態(tài)特征能夠較好維持。

同透明膠帶法一樣，改良方法也存在諸多缺點(diǎn)，如制片需在生物安全柜中處理，蠟樣菌落形態(tài)及難見(jiàn)氣生菌絲的真菌制片后顯微成像效果不佳，乳酸酚棉藍(lán)染色后的玻片放置過(guò)久會(huì)出現(xiàn)染液混濁、鏡下視野模糊不清現(xiàn)象，鏡下視野中也會(huì)出現(xiàn)氣泡，膠帶和玻片間若空隙較大會(huì)出現(xiàn)如文中明臍霉菌體不在一個(gè)水平面的現(xiàn)象等，推測(cè)是兩膠帶形成的空隙間喪失了鏡下對(duì)焦平面，大多數(shù)結(jié)構(gòu)可能不在一個(gè)對(duì)焦平面上，肉眼觀察影響不大，但拍照時(shí)有難度。由于改良方法使用的是浸染技術(shù)，真菌接觸的乳酸酚棉藍(lán)染液量較少，有些真菌可能會(huì)出現(xiàn)不著色或著色淺現(xiàn)象，如文中申克孢子絲菌和白僵菌；有些真菌可能會(huì)因?yàn)閮善徊婺z帶形成的微小斜面導(dǎo)致背景色深、圖像模糊，如文中斷發(fā)毛癬菌和紅色毛癬菌。以上缺點(diǎn)的解決還需繼續(xù)研究，改變膠帶的成分和/或優(yōu)化染液的質(zhì)量可能是研究的方向。

由于本法屬開(kāi)放式作業(yè)，操作時(shí)需在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行，待絲狀真菌浸染充分后，用乳酸酚棉藍(lán)浸潤(rùn)初始加染液端的對(duì)側(cè)，即粘有絲狀真菌膠帶兩側(cè)均浸有染液，可起到殺抑真菌，保護(hù)實(shí)驗(yàn)室工作人員的作用；不可直接在玻片兩端都加入染液，否則會(huì)導(dǎo)致膠帶中央出現(xiàn)較大氣泡，影響染色成像效果。

[1]Hughes AD，Lorusso GD，DL Greer. The ′double-layer tape prep′: an improvement to a standard technique[J]. J Med Microbiol, 2004, 53(Pt5):455.

[2]陳東科，孫長(zhǎng)貴. 實(shí)用臨床微生物學(xué)檢驗(yàn)與圖譜[M]. 北京：人民衛(wèi)生出版社, 2011:626-655.

[3]P.R.默里，E.J.巴倫，M.A.特諾維，等.臨床微生物手冊(cè)[M].北京：科學(xué)出版社, 2005：1827-1830.

2017-06-07)

(本文編輯：劉群)

10.13602/j.cnki.jcls.2017.10.07

馮長(zhǎng)海，1970年生，男，副主任技師，碩士，從事真菌的形態(tài)學(xué)鑒定，細(xì)菌耐藥機(jī)制研究。

R446.5

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