羅云鵬，高仰敏，金云，江情，李婕，樊心怡，占萍

(江西省皮膚病?？漆t(yī)院真菌科，南昌 330001)

·臨床檢驗技術(shù)研究·

特敏增強熒光染色法在淺部真菌病診斷中的應(yīng)用*

羅云鵬，高仰敏，金云，江情，李婕，樊心怡，占萍

(江西省皮膚病?？漆t(yī)院真菌科，南昌 330001)

目的評價特敏增強熒光染色法在淺部真菌病診斷中的應(yīng)用價值。方法對200例臨床高度懷疑真菌感染的標(biāo)本分別用特敏增強熒光染色法、鈣白熒光染色法和傳統(tǒng)的1.78 mol/L KOH濕片法對真菌進行鏡下形態(tài)學(xué)觀察，并比較真菌檢出率。結(jié)果特敏增強熒光染色法視野背景干凈，菌絲及孢子均為亮藍色，真菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰易辨。特敏增強熒光染色法檢出率高于鈣白熒光染色法和KOH濕片法(χ2=17.984，P<0.05；χ2=32.063，P<0.05)。結(jié)論熒光染色法是一種快速有效的真菌染色鏡檢技術(shù)，在臨床實驗室早期診斷真菌病中有推廣價值。

特敏增強熒光染色法；真菌鏡檢；KOH濕片法；鈣白熒光染色法

KOH濕片法是目前國內(nèi)最常用的真菌鏡檢方法，KOH方法簡單方便，成本低廉，但主觀性強。該溶液對真菌成分無著色效果，而淺部標(biāo)本(特別是甲屑和毛發(fā)標(biāo)本)因含有各種雜質(zhì)(纖維、皮屑、細(xì)胞等)常導(dǎo)致背景雜亂，不易分辨真菌結(jié)構(gòu)，鏡檢陽性率普遍不高[1]。此外，該法對于特殊標(biāo)本(患者用藥后標(biāo)本和毛囊炎標(biāo)本)，極易造成漏診。鈣白熒光染色法(calcofluor white)是國外常用的鏡檢方法，但由于染色劑與真菌結(jié)構(gòu)為非特異性結(jié)合[2]，在熒光顯微鏡下觀察不僅真菌結(jié)構(gòu)呈亮藍色，背景也呈藍色，導(dǎo)致真菌結(jié)構(gòu)與之對比不夠明顯，觀察較為費力。本科室近期開展了一種新型特敏增強熒光染色法，通過熒光素標(biāo)記的重組幾丁質(zhì)酶與真菌細(xì)胞壁的多糖或幾丁質(zhì)結(jié)合，在熒光顯微鏡下觀察真菌結(jié)構(gòu)。本研究收集200例高度疑似淺部真菌感染病例，同時與常用的鈣白熒光染色法和傳統(tǒng)KOH濕片法進行對比，以探討此方法在早期診斷真菌感染中的優(yōu)勢，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來源 取自2017年4月10日至6月1日期間到本院門診就診、臨床擬診為真菌感染的淺部真菌病患者，共200例。根據(jù)標(biāo)本來源分為皮屑(包括毛囊炎)146例，甲屑38例，毛發(fā)16例。

1.2試劑與儀器 特敏增強熒光染液(一滴法，江蘇萊芙時代生物科技公司)；鈣白熒光染色劑(終濃度0.1 mg/L，Sigma公司)；1.78 mol/L KOH溶液自配。奧林巴斯CX31顯微鏡(增加熒光模塊，奧林巴斯公司)。

1.3方法

1.3.1取材 皮屑標(biāo)本：先用75%酒精消毒皮損部位，使用鈍頭刀片刮取皮損炎性活動性邊緣的鱗屑，將標(biāo)本置于載玻片上。甲屑標(biāo)本：75%酒精消毒壞甲部位，刮取甲下碎屑置于載玻片上。毛發(fā)標(biāo)本：使用鑷子拔取病發(fā)直接置于載玻片上。毛囊炎標(biāo)本：先用75%酒精擦拭皮損部位，再用無菌尖頭手術(shù)刀的尖端挑破膿皰頂端，向內(nèi)用力擠壓即可取出毛囊內(nèi)乳酪狀內(nèi)容物，將標(biāo)本置于載玻片上。將同一患者同一部位取出的標(biāo)本分為等量3份，分別用于特敏增強熒光染色法，鈣白熒光染色法和KOH濕片法檢測。

1.3.2染色及鏡檢 特敏增強熒光染色法：在載有標(biāo)本的載玻片上滴加1滴特敏熒光染液，蓋上并輕壓蓋玻片，在熒光顯微鏡下觀察、拍照。鈣白熒光染色法：在載有標(biāo)本的載玻片上滴加1滴鈣白熒光染液，然后再滴加1滴1.78 mol/L KOH，1 min后蓋上并輕壓蓋玻片，在熒光顯微鏡下觀察、拍照。KOH濕片法：在載有標(biāo)本的載玻片上滴加1滴1.78 mol/L KOH溶液，蓋上并輕壓蓋玻片，并在酒精燈火焰上方微微加熱，在光學(xué)顯微鏡下觀察、拍照。每張片子至少選取4個視野進行觀察(即每張片子有標(biāo)本覆蓋的地方全部會在顯微鏡視野中進行觀察)，若有菌絲或者較多孢子(毛囊炎標(biāo)本一般認(rèn)為每油鏡視野大于5個[3])就判定為陽性，否則判定為陰性。200例標(biāo)本所用試劑為同一廠家同一批次產(chǎn)品。另外，參與該課題的3位檢驗人員均為工齡超過5年以上且有豐富的臨床檢驗經(jīng)驗的一線實驗技術(shù)員，主觀誤差(人間誤差)在可控范圍內(nèi)。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析 用SPSS 23.0軟件進行。3種鏡檢方法的檢出率比較用卡方檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1鏡下形態(tài)學(xué)觀察 對200例標(biāo)本分別采用特敏增強熒光染色法、鈣白熒光染色法和KOH濕片法檢測，結(jié)果顯示特敏增強熒光染色法視野背景干凈，菌絲及孢子均為亮藍色，真菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)非常清晰，容易辨別，不易漏檢。癬菌標(biāo)本表現(xiàn)為細(xì)長規(guī)則分支分隔的柔滑菌絲，毛發(fā)標(biāo)本可見頭發(fā)內(nèi)外的規(guī)則分支菌絲和鏈狀排列的圓形小孢子，甲屑標(biāo)本常見分支分隔的菌絲、關(guān)節(jié)菌絲和孢子，花斑糠疹標(biāo)本為短棒狀弧形菌絲和出芽孢子，馬拉色菌毛囊炎標(biāo)本可見卵圓形、寬底的出芽孢子，念珠菌標(biāo)本為鏈狀、分支處縮窄的假菌絲、圓形或橢圓形出芽孢子。見圖1和圖2A。

注：A，皮屑標(biāo)本，皮膚癬菌細(xì)長菌絲；B，毛發(fā)標(biāo)本，發(fā)內(nèi)外菌絲及孢子；C，甲屑標(biāo)本，菌絲和關(guān)節(jié)孢子；D，皮屑標(biāo)本，馬拉色菌弧形菌絲和出芽孢子；E，皮屑標(biāo)本，馬拉色菌出芽孢子；F，皮屑標(biāo)本，念珠菌假菌絲和出芽孢子。

圖1 皮屑標(biāo)本、甲屑標(biāo)本和毛發(fā)標(biāo)本特敏增強熒光染色法真菌鏡檢染色(×400)

鈣白熒光染色法也可清晰檢測到亮藍色的菌絲及孢子，但背景很亮，干擾較強，與真菌結(jié)構(gòu)對比不甚清晰，見圖2B。而KOH濕片法背景雜亂，菌絲和孢子與背景對比不清晰，真菌形態(tài)不易辨別，見圖2C，特別是甲屑標(biāo)本，僅含少量孢子的標(biāo)本更難判斷。在相同時間內(nèi)，與KOH濕片法相比，熒光染色法更易觀察真菌結(jié)構(gòu)。

注：A，特敏增強熒光染色法；B，鈣白熒光染色法；C，KOH法。

圖2 3種方法直接鏡檢形態(tài)學(xué)結(jié)果對比(×400)

2.23種鏡檢方法的檢出率比較 統(tǒng)計結(jié)果顯示，200例臨床可疑感染患者中，特敏增強熒光染色法檢出192例陽性標(biāo)本(96%)，鈣白熒光染色法檢出166例陽性標(biāo)本(83%)，而KOH濕片法檢出153例陽性標(biāo)本(76.5%)，特敏增強熒光染色法陽性檢出率明顯高于KOH濕片法(χ2=32.063，P<0.05)，也高于鈣白熒光染色法(χ2=17.984，P<0.05)，鈣白熒光染色法和KOH濕片法檢出率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 3種真菌鏡檢方法檢出率比較[n(%)]

3 討論

特敏增強熒光染色液是一種含有高純度熒光素和特定比例的背景光壓制溶液的復(fù)合溶液，一方面通過熒光素標(biāo)記的幾丁質(zhì)重組酶與真菌細(xì)胞壁中的幾丁質(zhì)特異性結(jié)合，形成強熒光復(fù)合物，借助熒光顯微鏡，在紫外光(波長340～380 nm)或者藍紫光(波長420～490 nm)激發(fā)下，僅真菌結(jié)構(gòu)發(fā)出亮藍色的熒光；另一方面，該溶液中有KOH成分，能溶解皮屑及甲屑標(biāo)本中的角質(zhì)細(xì)胞及去除背景中的干擾熒光，使真菌菌絲及孢子染色更為突出，與視野中的背景形成強烈的反差，便于辨別。另外，該方法新手容易掌握，其操作方法與KOH濕片法一致，只需要一滴法，簡單，耗時短，結(jié)果直觀，同時也彌補了KOH濕片法對疑難標(biāo)本(兒童頸部念珠菌感染標(biāo)本，色減型花斑糠疹皮損、菌載量少的標(biāo)本，材質(zhì)比較厚的甲屑標(biāo)本，外涂藥膏的標(biāo)本等)易出現(xiàn)假陰性的缺憾。根據(jù)我們臨床實驗室的數(shù)據(jù)統(tǒng)計和經(jīng)驗，與KOH濕片法相比，特敏增強液染色法顯著提高了標(biāo)本的鏡檢陽性率。

本實驗室收集的標(biāo)本主要為淺部真菌標(biāo)本，證實特敏增強熒光染色法為一種簡單快速有效的真菌檢測方法。已有文獻報道熒光染色法在甲真菌病檢測中的應(yīng)用價值[4]。此外，熒光染色法也可用于新鮮或者冰凍組織切片中的真菌檢出[5]以及深部標(biāo)本的診斷[6]。因此，需要開展針對深部標(biāo)本的應(yīng)用，以了解該染料對其他類型標(biāo)本的檢測效果。

[1]費實, 肖常青, 李振潔,等. 1999～2007年皮膚科門診淺部真菌發(fā)病及鏡檢情況分析[J]. 中國真菌學(xué)雜志, 2009, 4(2):93-96.

[2]Roncero C, Valdivieso MH, Ribas JC,etal. Effect of calcofluor white on chitin synthases fromSaccharomycescerevisiae[J]. J Bacteriol, 1988, 170(4):1945-1949.

[3]李智華, 耿承芳, 江清,等. 花斑糠疹和馬拉色菌毛囊炎菌種分布特點分析[J]. 中國皮膚性病學(xué)雜志, 2010, 24(5):429-430.

[4]Idriss MH, Khalil A, Elston D. The diagnostic value of fungal fluorescence in onychomycosis[J]. J Cutan Pathol, 2013, 40(4):385-390.

[5]楊通, 何煉圖, 陳濤,等. 熒光染色劑Calcofluor White在活檢組織中真菌染色的應(yīng)用[J]. 分子診斷與治療雜志, 2014, 6(5):307-311.

[6]韓德忞, 劉原志, 朱均昊,等. 熒光染色法與KOH濕片法在真菌直接鏡檢中的應(yīng)用比較[J]. 中國真菌學(xué)雜志, 2016, 11(4): 240-242.

2017-07-12)

(本文編輯：劉群)

Fluorescentstainingwithhypersensitivityandenhancementforearlydiagnosisofsuperficialfungalinfection

LUOYun-peng,GAOYang-min,JINYun,JIANGQing,LIJie,FANXin-yi,ZHANPing

(DepartmentofFungiSection,DermatologyHospitalofJiangxiProvince,Nanchang330001,Jiangxi,China)

ObjectiveTo evaluate the application of novel fluorescent staining method with hypersensitivity and enhancement for microscopic examination of superficial fungal.MethodsA total of 200 cases with clinically suspected superficial fungal infection were screened by the hypersensitive, enhanced fluorescent staining, calcofluor white staining and microscopic examination with 1.78 mol/L potassium hydroxide (KOH) based smear assay, respectively. The positive percentages of the different methods were calculated and compared.ResultsIn the developed fluorescent staining examination, clean background was shown in the view field. The hyphae and spores displayed in bright blue, thus fungal morphology was so distinct that they were easy to be distinguished. Compared with calcofluor white staining and KOH based smear, the fluorescent staining showed high positive rate with significant difference respectively (χ2=17.984,P<0.05;χ2=32.063,P<0.05).ConclusionThe novel fluorescent staining should be a rapid, accurate method for microscopic examination of fungi, which is worthy to be widely used in clinical laboratories for early diagnosis of fungal infection.

hypersensitive, enhanced fluorescent staining; fungal direct microcopic examination; potassium hydroxide based smear assay; calcofluor white staining

10.13602/j.cnki.jcls.2017.10.04

國家自然科學(xué)基金青年基金項目(13008316)。

羅云鵬，1989年生，男，技師，大學(xué)本科，從事真菌檢驗工作；高仰敏，1989年生，女，研究實習(xí)員，碩士，從事真菌藥物敏感性和致病分子機制研究。兩位作者同為第一作者。

占萍，主治醫(yī)師，博士，E-mail:zhanping1980@163.com。

R446.5

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