王偉 ，高偉峰 ，張賽賽 ,2，董安然 ，姜欣彤

（1.大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116023；2.天津現(xiàn)代晨輝科技集團(tuán)有限公司，天津 301800）

大瀧六線魚6個(gè)野生群體遺傳多樣性的12S rRNA基因分析

王偉1，高偉峰1，張賽賽1,2，董安然1，姜欣彤1

（1.大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116023；2.天津現(xiàn)代晨輝科技集團(tuán)有限公司，天津 301800）

本文利用PCR技術(shù)擴(kuò)增了6個(gè)野生群體大瀧六線魚線粒體12SrRNA基因的部分序列。在獲得的582bp堿基序列中，共檢測(cè)到314個(gè)變異位點(diǎn)，占總位點(diǎn)數(shù)的53.95%。34尾個(gè)體共定義了16種單倍型，6個(gè)群體的單倍型多樣性指數(shù)為0.40～1.00，核苷酸多樣性指數(shù)為0.00071～0.10441。中性檢驗(yàn)Fu's Fs值為1.19782（P＜0.01）。分子變異分析表明：Fst=0.88326（P＜0.01），群體間和群體內(nèi)變異分別為88.33%和11.67%。不同個(gè)體間的遺傳距離構(gòu)建的NJ和MP系統(tǒng)樹表明，東港和旅順群體親緣關(guān)系較近，構(gòu)成一個(gè)分支，其他群體構(gòu)成另一分支。

大瀧六線魚；野生群體；線粒體DNA；12SrRNA部分序列

大瀧六線魚Hexagrammos otakii Jordan&Starks也被稱為歐氏六線魚、六線魚等[1,2]，屬鲉形目Scorpaeniformes、六線魚科Hexagrammidae、六線魚屬Hexagrammos[2]，俗稱黃魚，廣泛分布于我國東部沿海及日本、韓國、朝鮮等國的近海[3,4]，在我國主要分布于遼寧和山東等地近海的多巖礁海區(qū)。大瀧六線魚味道鮮美，營養(yǎng)豐富，深受人們的青睞，還可用于出口創(chuàng)匯，具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，在我國北方的海水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚類中占有重要地位。早在20世紀(jì)70年代，日本便對(duì)其開展人工繁殖研究，我國也從20世紀(jì)80年代開始大瀧六線魚的人工育苗[5-8]、營養(yǎng)成分分析[9,10]、生物學(xué)指標(biāo)[11,12]等研究。然而關(guān)于大瀧六線魚的遺傳多樣性的研究較少，目前國內(nèi)僅見劉奇[13]的遺傳多樣性研究。

魚類種群的種質(zhì)資源評(píng)估對(duì)漁業(yè)資源的合理開發(fā)和利用具有重要的導(dǎo)向作用。在魚類種質(zhì)資源的相關(guān)研究中，檢測(cè)線粒體DNA（mtDNA）多態(tài)性是一種較為普遍方式。線粒體DNA的核苷酸分子較小，易與核DNA分離和純化，進(jìn)化速率較快，是其他單拷貝DNA的5～10倍。同一合子來源的個(gè)體各組織器官內(nèi)的mtDNA結(jié)構(gòu)均一，每個(gè)魚類個(gè)體中所含的mtDNA具有高度的一致性[14]。遺傳中遵循嚴(yán)格的母系遺傳規(guī)律，通常不會(huì)發(fā)生重組，容易確定其種質(zhì)特征，反映群體遺傳特征、種群分化和種屬關(guān)系等特點(diǎn)。因此，作為一種較為常用的遺傳分子標(biāo)記，廣泛應(yīng)用于系統(tǒng)進(jìn)化和種群遺傳研究中[15,16]。12SrRNA基因位于線粒體基因組，具有較高的保守進(jìn)化性，多用于系統(tǒng)發(fā)生及分子進(jìn)化等研究[17,18]。但該基因較少應(yīng)用于研究魚類群體遺傳多樣性等。本試驗(yàn)分析6個(gè)群體大瀧六線魚線粒體DNA中12S rRNA序列的遺傳結(jié)構(gòu)、遺傳多樣性和遺傳分化等，有助于了解不同大瀧六線魚群體的遺傳多樣性及其遺傳背景，為合理利用漁業(yè)資源以及資源的保護(hù)和可持續(xù)開發(fā)，提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

試驗(yàn)用魚分別采自青島、丹東和大連等6個(gè)地區(qū)，為保證采樣群體的準(zhǔn)確性，樣品均采自各地的采樣點(diǎn)碼頭，樣品規(guī)格為（20±1.5）cm。樣本采集相關(guān)信息詳見圖1和表1。

圖1 大瀧六線魚采集地點(diǎn)Fig.1 Sampling sites of fat greenling Hexagrammos otakii

表1 大瀧六線魚樣品信息Tab.1 Sample information of fat greenling Hexagrammos otakii

1.2 基因組DNA提取

DNA提取采用本實(shí)驗(yàn)室常用的一種簡化方法進(jìn)行。從魚尾部取約50mg肌肉組織樣品，充分剪碎，加入蛋白酶K、勻漿液以及SDS，經(jīng)過大約2h的完全消化，使用C2H3KO2溶液進(jìn)行抽提，加入無水乙醇形成沉淀，用75%酒精洗滌沉淀物，再用適量TE溶解，于-20℃下保存?zhèn)溆肹19]。

1.3 12S rRNA序列的PCR擴(kuò)增

從NCBI（National Center for Biotechnology Information）的GenBank中檢索大瀧六線魚12S rRNA基因同源序列，運(yùn)用Primer Primer 5軟件設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物、上游引物（5’-CAGAGCGTGGCTAAGATGGA-3’） 和 下 游 引 物（5’-CAGAGCGTGGCTAAGATGGA-3’）。使用約50ng基因組DNA作為PCR反應(yīng)的模板。反應(yīng)體系中包含：1.0mmol/LMgCl2、2μL基 因 組 DNA、0.2mmol/L dNTPs、2.5μL 10 ×PCR Buffer、引物各 0.4μmol/L、1U Taq 酶，PCR 反應(yīng)的總體積為25μL。將擴(kuò)增體系于95℃下3min預(yù)變性，然 后 94℃ 變 性 30s，56℃ 退 火 45s，72℃ 延 伸1min，35個(gè)循環(huán)結(jié)束后，72℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠試劑盒進(jìn)行回收純化。PCR產(chǎn)物委托上海鼎安生物科技有限公司采用雙向測(cè)序法進(jìn)行測(cè)序，依據(jù)峰圖對(duì)測(cè)序的結(jié)果進(jìn)行確認(rèn)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用ClustalX1.83軟件對(duì)所得的序列進(jìn)行對(duì)位排列，并結(jié)合人工校正；采用Mega4.10軟件核對(duì)堿基組成及相關(guān)的變異位點(diǎn)，計(jì)算遺傳距離，構(gòu)建NJ和MP分子系統(tǒng)樹[20]；采用DNASP4.10軟件計(jì)算核苷酸多樣性指數(shù)（π）、單倍型多樣性指數(shù)（Hd）及單倍型數(shù)（h）；采用Arlequin3.11軟件進(jìn)行中性檢驗(yàn)，計(jì)算Fu's Fs值推斷大瀧六線魚各個(gè)群體在歷史上發(fā)生種群擴(kuò)張的情況[21]；最后結(jié)合分子變異分析方法（AMOVA）分析種群間的遺傳分化指數(shù)Fst，通過排列測(cè)驗(yàn)法（permutation test）檢測(cè)Fst的顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列特征

PCR擴(kuò)增所得到的堿基序列長度約為700bp，比對(duì)得出34尾大瀧六線魚mtRNA中高度一致的12SrRNA序列，長度約為 582bp。A、T、G、C堿基的平均含量各為30.0%、27.0%、21.0%和22.0%。A+T含量（59.0%）高于G+C含量（41.0%）。旅順群體T+A含量最高（57.4%），長?？h群體最低（56.5%）。G+C含量則相反，長海縣群體最高（43.5%），旅順群體最低（42.6%）。

在34尾大瀧六線魚12S rRNA序列中，共檢測(cè)到314個(gè)變異位點(diǎn)，多態(tài)位點(diǎn)百分率為53.95%。其中單態(tài)位點(diǎn)53個(gè)，簡約信息位點(diǎn)261個(gè)，插入/缺失位點(diǎn)32個(gè)。共有轉(zhuǎn)換位點(diǎn)54個(gè)，其中C-T有28個(gè)位點(diǎn)，A-G有26個(gè)位點(diǎn)。顛換位點(diǎn)62個(gè)，四種形式均有，其中A-C有19個(gè)位點(diǎn)，T-G有12個(gè)位點(diǎn)，A-T有17個(gè)位點(diǎn)，G-C有14個(gè)位點(diǎn)。平均轉(zhuǎn)換與顛換之比為0.87。由表2可知，6個(gè)群體的34尾大瀧六線魚共定義16種單倍型。2個(gè)單倍型為不同群體所共享，僅占單倍型總數(shù)的12.5%，14種單倍型均為單個(gè)群體所特有，在單倍型總數(shù)中占87.5%，僅有1個(gè)為4個(gè)種群的共有單倍型，1個(gè)為2個(gè)種群的共有單倍型。

表2 16種單倍型在大瀧六線魚群體中的分布Tab.2 The distribution of the 16 haplotypes in fat greenling Hexagrammos otakii populations

2.2 遺傳多樣性

群體遺傳多樣性參數(shù)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果（表3）：表明各種群遺傳多樣性差異明顯。長?？h群體的核苷酸多樣性指數(shù)（0.10441）和單倍型多樣性指數(shù)（1.00）最高，而東港和大連群體的單倍型多樣性指數(shù)最低（0.40），大連群體的核苷酸多樣性指數(shù)最低（0.00071）。旅順群體序列Fu's Fs值的計(jì)算結(jié)果為負(fù)值，統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算的結(jié)果具有顯著的差異性，可將此群體的檢驗(yàn)結(jié)果定義為偏離中性模式。

2.3 遺傳結(jié)構(gòu)

Kimura 2-paramter遺傳分化指數(shù)Fst和遺傳距離的計(jì)算結(jié)果（表4）表明，6個(gè)群體間的平均遺傳距離為0.00097～0.76765，其中瓦房店群體與東港群體的群體間遺傳距離最高，瓦房店群體與大連群體的群體間遺傳距離最低。6個(gè)群體間的遺傳分化指數(shù)Fst為0～0.99832，其中大連群體與旅順群體之間的遺傳分化指數(shù)最高，東港與旅順群體之間以及青島、瓦房店和大連群體之間的分化可以忽略不計(jì)。

由表5可知：分子變異分析（AMOVA）的結(jié)果為Fst=0.88326（P＜0.01）。群體間變異占變異總量的88.33%，群體內(nèi)變異僅占11.67%，由此推斷，6個(gè)大瀧六線魚群體間發(fā)生了顯著的遺傳分化。

2.4 分子系統(tǒng)樹的構(gòu)建

外群選用斑頭魚Agrammus agrammus的同源序列（登錄號(hào)：AB290791.1）進(jìn)行比對(duì)分析，基于Kimura－雙參數(shù)計(jì)算群體間的遺傳距離，構(gòu)建NJ和MP分子系統(tǒng)進(jìn)化樹，通過1 000次bootstrap檢驗(yàn)對(duì)其節(jié)點(diǎn)的支持率進(jìn)行檢驗(yàn)。由圖2可知，NJ和MP分子系統(tǒng)進(jìn)化樹具有極高的相似度，6個(gè)群體的34尾大瀧六線魚大致呈現(xiàn)出兩個(gè)分支。其中旅順和東港群體的親緣關(guān)系較為接近，為一條分支，其他群體皆位于另一條分支。

3 討論

遺傳多樣性是物種延續(xù)和發(fā)展的基礎(chǔ)[22]，其豐富的種群在復(fù)雜多變的自然環(huán)境中表現(xiàn)出更強(qiáng)的適應(yīng)性。近年來，隨著漁業(yè)資源的開發(fā)利用力度加大，魚類種群遺傳多樣性減少，對(duì)各個(gè)魚類種群的延續(xù)能力產(chǎn)生不良影響，嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)?dǎo)致瀕危物種的滅絕速度加快[23]。在本研究中，共測(cè)序得出16種單倍型，各個(gè)群體的單倍型多樣性指數(shù)范圍為0.40～1.00，核苷酸多樣性指數(shù)范圍為0.00089～0.10441，各群體具有較為顯著的遺傳多樣性差異。本研究中，旅順群體的變異位點(diǎn)數(shù)最高，達(dá)到244個(gè)，核苷酸多樣性指數(shù)（0.10441）最高，說明旅順群體的遺傳多樣性非常豐富。分析旅順的地理位置及其結(jié)果發(fā)現(xiàn)，旅順東臨黃海，西瀕渤海，南與山東半島隔海相望，中間有水道可與外海相通，對(duì)基因的交流提供了極大的便利。而大連群體（0.40，0.00071）與東港群體（0.40，0.00089）的遺傳多樣性相對(duì)貧乏，其原因可能與其所處的地理環(huán)境有關(guān)。Fu[24]認(rèn)為，F(xiàn)s中性檢驗(yàn)的結(jié)果顯著偏離中性，P值具有顯著差異且Fs值呈負(fù)值，表明該種群在其進(jìn)化歷程中，可能發(fā)生過快速的種群擴(kuò)張。在本試驗(yàn)的1 000次的模擬檢測(cè)中，旅順群體的Fs值為負(fù)值（P＜0.05），推斷旅順的大瀧六線魚群體可能在歷史上發(fā)生過短時(shí)間、大規(guī)模的種群擴(kuò)張，使該地區(qū)大瀧六線魚群體的遺傳多樣性較高。

表3 6個(gè)大瀧六線魚群體單倍型參數(shù)及遺傳多樣性比較Tab.3 The comparison of haplotype diversity and genetic diversity among the 6 populations of fat greening Hexagrammos otakii

表4 各種群之間的遺傳距離（左下角）及其遺傳分化指數(shù)Fst（右上角）Tab.4 Genetic distance（below diagonal)and Fst（above diagonal)among different populations of fat greening Hexagrammos otakii

表5 大瀧六線魚群體的AMOVA分析Tab.5 The AMOVA analysis of the populations of fat greening Hexagrammos otakii

圖2 基于DNA 12S rRNA的16個(gè)單倍型構(gòu)建的NJ和MP分子系統(tǒng)樹Fig.2 Neighbor-joining and Maximum Parsimony tree of fat greening Hexagrammos otakii based on the 16 haplotypes in mtDNA 12S rRNA sequences

群體間的遺傳距離以及遺傳分化指數(shù)是衡量群體分化程度的重要指標(biāo)，二者的數(shù)值與群體分化程度為線性關(guān)系。東港群體以及旅順群體與其他群體間Fst值都大于0.8，接近1；長?？h群體與青島、瓦房店和大連群體之間的值也大于0.3，其他三個(gè)群體間的遺傳多樣性分化程度可忽略不計(jì)。由于各種群間的親緣關(guān)系與其相對(duì)遺傳距離呈明顯的正相關(guān)[25]，因此，青島及旅順群體與其他群體之間的遺傳距離（0.68805～0.76765）明顯高于旅順與東港群體之間的遺傳距離（0.00209）及其他三個(gè)群體之間的遺傳距離（0.00097～0.09305），表明青島及旅順群體的親緣關(guān)系較為接近。AMOVA分析結(jié)果表明，群體間變異占變異總量的88.33%，6個(gè)樣點(diǎn)的大瀧六線魚群體間差異遺傳較大，這與程起群等（2007）[26]、李瑩（2012）等[19]研究結(jié)果一致。NJ和MP分子系統(tǒng)樹的結(jié)果與遺傳分化指數(shù)的結(jié)果一致，這與張?jiān)凑娴妊芯拷Y(jié)果一致[27]。東港群體和旅順群體為一個(gè)分支，長?？h、瓦房店、大連和青島群體共同組成另一大分支。mtDNA屬母系遺傳，由此可推斷，這6個(gè)大瀧六線魚群體在進(jìn)化過程中，曾由共同祖先分化為兩個(gè)進(jìn)化分支，繼而分別展開進(jìn)一步的分化。

本研究基于線粒體控制區(qū)的對(duì)比發(fā)現(xiàn)，大瀧六線魚的分布與其基因多樣性的地理位置分布存在一定差異。青島群體與大連群體間的親緣關(guān)系反而較為接近，這可能基因交流所形成，青島群體形成的時(shí)間較短，分化速度較快，而12S rRNA序列比較保守，在短時(shí)間內(nèi)無法形成足夠的有效信息含量[28]。同時(shí)也可能是進(jìn)化樹的構(gòu)建過程中，受多方面因素影響的結(jié)果，例如分析軟件的不同，所選擇的分子標(biāo)記、物種差異以及計(jì)算方法的不同等，目前由于上述因素缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，都有可能影響分析結(jié)果。但是通過本試驗(yàn)，可以發(fā)現(xiàn)除東港群體與旅順群體外，其他群體間依然具有較大的遺傳分化，這種分化的結(jié)果與其地理位置的分布具有較高的一致性。因此結(jié)合本次針對(duì)兩種分子標(biāo)記方法的研究結(jié)果，建議按照不同的地理區(qū)域?qū)Υ鬄{六線魚種群資源展開劃區(qū)域、多層次的保護(hù)，使?jié)O業(yè)資源能夠得到更加合理的開發(fā)，達(dá)到可持續(xù)利用的目標(biāo)。

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Genetic Diversity Analysis of Six Wild Populations of Fat Greenling Hexagrammos otakii by Mitochondrial DNA 12S rRNA Partial Sequence

WANG Wei1,GAO Wei-feng1,ZHANG Sai-sai1,2,DONG An-ran1,JIANG Xin-tong1
（1.Key Laboratory of Mariculture&Stock Enhancement in North China's Sea,Ministry of Agriculture,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China;2.Tianjin Chen Hui Modern Technology Group Co.,Ltd.,Tianjin 301800,China)

Nucleotide sequences of mitochondrial DNA 12S rRNA partial sequence were amplified in six wild populations of fat greenling Hexagrammos otakii using PCR techniques.A total of 314 variable sites were detected among the aligned sequences of 582 bp with mutation rate of 53.95%.Sixteen haplotypes were identified from 34 individuals according to the determined sequences,and the six populations had haplotype diversity of 0.40～1.00,nucleotide diversity of 0.00071～0.10441 and Fu's Fs of 1.19782 in neutrality tests（P＜0.01).AMOVA analysis demonstrated that:there were Fst=0.88326（P＜0.01),variance of 88.33%among six populations and variance of 11.67%within the six populations.The NJ and MP molecular phylogenetic trees constructed by the distances among different individuals revealed that the phylogenetic trees were all divided into two branches,one in Donggang and Lvshun populations and the others in the other populations.

Hexagrammos otakii;wild population;mitochondrial DNA;12S rRNA partial sequence

S917

A

1005-3832（2017）05-0007-06

2017-04-18

大連市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2015B11NC072）；大連市科技之星計(jì)劃項(xiàng)目（2015R081）.

王偉（1978-），男，理學(xué)博士，研究方向?yàn)轸~類群體遺傳學(xué).E-mail：wangwei@dlou.edu.cn