郝 瑩，孫 軍*，曾金金，趙 晗

（濰坊出入境檢驗檢疫局，山東 濰坊 261041）

降解多種抗生素殘留的乳酸菌的篩選鑒定及特性研究

郝 瑩，孫 軍*，曾金金，趙 晗

（濰坊出入境檢驗檢疫局，山東 濰坊 261041）

為研究和篩選高效降解抗生素殘留的乳酸菌，采用高效液相色譜法與微生物學(xué)方法相結(jié)合的方式進行初步篩選，從土壤中分離獲得一株乳酸菌菌株P(guān)3-4，結(jié)合菌落及菌體形態(tài)、通過Biolog自動微生物鑒定系統(tǒng)鑒定和16S rDNA基因序列相似性分析，鑒定菌株P(guān)3-4為乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）。乳酸菌P3-4在MRS培養(yǎng)基中具有抗生素殘留降解能力，對紅霉素、羅紅霉素與螺旋霉素的降解率分別能達到92.1%、68.9%和82.8%。為菌株P(guān)3-4的進一步開發(fā)利用提供了理論支持。

抗生素；降解；乳酸菌；鑒定；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

乳酸菌并不是分類學(xué)上的名詞，是指能利用可發(fā)酵碳水化合物并產(chǎn)生以乳酸為主要代謝產(chǎn)物的革蘭氏陽性菌的統(tǒng)稱[1]。乳酸菌主要分布于礦物質(zhì)和有機營養(yǎng)物豐富的微酸環(huán)境中，在食品工業(yè)、環(huán)境保護、畜牧業(yè)等很多領(lǐng)域具有很高的應(yīng)用價值。乳酸菌對動物的營養(yǎng)和健康有重要作用，具有抑菌消炎、抗氧化、抗腫瘤、降低膽固醇、提高免疫力、延緩衰老等功效[2-3]。

抗生素是由微生物在生活過程中產(chǎn)生的能夠預(yù)防和治療細菌感染疾病的一類次級代謝產(chǎn)物。近年來，抗生素廣泛被用于畜牧養(yǎng)殖業(yè)的疾病預(yù)防和治療以及動植物病蟲害防治等領(lǐng)域[4]。抗生素的使用方法不當(dāng)或非法超量添加，可造成其在動物體內(nèi)的殘留[5-6]。高殘留會使人體正常菌群紊亂，產(chǎn)生耐藥性，對人體造成致敏性以及毒性反應(yīng)。研究報道[7]在不同環(huán)境介質(zhì)中檢測出不同濃度水平的抗生素，能夠通過水和食物等多種途徑危害人體健康?？股貧埩魡栴}已引起國際社會的廣泛關(guān)注和高度重視[5-6]。微生物的降解作用是食品與環(huán)境中抗生素殘留分解與轉(zhuǎn)化的重要途徑，利用微生物治理藥物污染是一種行之有效的方法，已顯示出良好的應(yīng)用前景[4]。毛菲菲等[7]分離出一株能夠降解紅霉素的惡臭假單胞菌，能夠以紅霉素為唯一碳源生長，培養(yǎng)5 d后對紅霉素的降解率可達76.6%。孫瑞珠等[8]從土壤中分離獲得一株越南伯克霍爾德氏菌，對泰樂菌素具有良好的降解特性，降解率可達到99%。胡秀虹等[9]對獲得的一株不動桿菌進行研究，該菌培養(yǎng)至6 d時，對阿維菌素的降解率可達到76%，研究發(fā)現(xiàn)加入較低濃度的碳氮源，能夠促進該菌對阿維菌素的降解。而乳酸菌對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的降解功能鮮有報道。

本研究通過采用微生物方法與高效液相色譜法相結(jié)合的方式建立了篩選乳酸菌的新方法，通過抗生素選擇培養(yǎng)基初篩以及復(fù)篩，建立合理、有效的紅霉素、羅紅霉素、螺旋霉素降解菌株的篩選方法。結(jié)合Biolog自動微生物鑒定系統(tǒng)結(jié)果和16S rDNA基因序列相似性分析，對菌株進行鑒定。為微生物治理復(fù)雜環(huán)境的抗生素污染提供更多選擇。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品來源

從濰坊、煙臺等地區(qū)采集不同地點的土樣。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS肉湯培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g/L，牛肉粉5.0 g/L，酵母粉4.0g/L，葡萄糖20.0g/L，吐溫-801.0mL，K2HPO4·7H2O 2.0 g/L，醋酸鈉5.0 g/L，檸檬酸三銨2.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，MnSO4·4H2O0.05g/L，pH6.2。121℃高壓滅菌15min。

MRS瓊脂培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g/L，牛肉粉5.0 g/L，酵母粉4.0g/L，葡萄糖 20.0g/L，吐溫-801.0mL，K2HPO4·7H2O 2.0 g/L，醋酸鈉 5.0 g/L，檸檬酸三銨 2.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，MnSO4·4H2O0.05g/L，瓊脂粉15.0g/L，pH6.2。121℃高壓滅菌15 min。

BUG+B培養(yǎng)基：稱取57 g BUG粉末于950 mL蒸餾水中，加熱煮沸至完全溶解，冷卻至25℃調(diào)整pH值至7.3±0.1，121℃滅菌15 min，冷卻至45～50℃，加入50 mL脫纖維羊血混勻。

1.2 儀器與設(shè)備

1260高效液相色譜儀、1260-6430超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）：美國Aglient公司；Incucell111型恒溫培養(yǎng)箱：德國MMM公司；5417R型臺式高速離心機：德國Eppendorf公司；5500QTrap高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀：美國Waters公司；Gradient梯度聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：德國Biometra公司；Biolog自動微生物鑒定系統(tǒng)、Turbidimeter濁度計：美國Biolog公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的篩選

準確稱量土樣25 g，加入225 mL MRS肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)48 h，將培養(yǎng)液振蕩混勻，吸取1 mL用生理鹽水稀釋10-1～10-6六個梯度，取10-4、10-5、10-6三個稀釋度的培養(yǎng)液各0.1 mL涂布MRS瓊脂平板，每個稀釋度做兩個平行，置于37℃培養(yǎng)24 h，挑取單菌落進一步使用MRS瓊脂平板純化[3，10-13]。

將純化后的菌落在MRS肉湯培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)48 h，取發(fā)酵液5 mL，5 900×g離心10 min，取上清液加入5 mL 0.01 mol/L的硫酸水溶液，5 900×g離心10 min，采用0.22 μm的濾膜過濾，稀釋10倍后采用反相高效液相色譜（reversedphase-high performance liquid chromatography，RT-HPLC）法測定乳酸含量[14-16]。

反相高效液相色譜條件：Aglient ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：0.1%磷酸水溶液（pH 2.0）：乙腈為5∶95（V/V）；流速：0.3 mL/min；進樣量10 μL。

將獲得菌株進行革蘭氏染色與過氧化氫酶實驗[10-12]。

1.3.2 降解抗生素菌株的篩選及復(fù)篩

取1 mL富集培養(yǎng)液分別接種于含2 mg/L不同抗生素的新鮮MRS液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)，待抗生素選擇培養(yǎng)基渾濁后，從中取1 mL培養(yǎng)液接種于含3 mg/L抗生素的液體培養(yǎng)基中，逐級類推提高抗生素質(zhì)量濃度。取測定降解率后最高耐受濃度培養(yǎng)物劃線接種于含相應(yīng)抗生素的固體平板上，37℃培養(yǎng)24～72 h。挑取單菌落再接種至液體抗生素選擇培養(yǎng)基進行驗證，循環(huán)3次，以獲得抗生素降解能力較好的純菌株[13，17-20]。

1.3.3 菌體對抗生素降解能力的檢測

將篩選獲得的單菌落分別接種于相應(yīng)的適當(dāng)質(zhì)量濃度的液體抗生素選擇培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)1～7 d。13 300×g離心5 min，取上清稀釋過濾后UPLC-MS/MS儀測定相應(yīng)的抗生素質(zhì)量濃度[21-24]。

超高效液相色譜條件：Agilent Eclipse Plus C18色譜柱（3.0 mm×100 mm，1.8 μm）；流動相A：0.1%甲酸水溶液，流動相B：乙腈；梯度洗脫程序：0～4 min，85%～50%A；4～12min，50%～10%A；12～13.5min，10%A；13.5～14.0min，10%～85%A；流速：0.3 mL/min。

質(zhì)譜條件：電噴霧電壓5 500 V；霧化氣壓力：55 Psi；氣簾氣壓力：35Psi；輔助氣壓力：55 Psi；離子源溫度550 ℃。離子對、去簇電壓、碰撞氣能量等見表1。

表1 紅霉素、羅紅霉素、螺旋霉素的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometry parameters of erythromycin,roxithromycin and spiramycin

1.3.4 菌株鑒定

將篩選獲得的單菌落接種于MRS平板中，挑取菌體進行16S rDNA測序[1-2，10-12]。同時，挑取單菌落，于BUG+B培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)24 h，CO2含量為6.5%，轉(zhuǎn)接1～2代。將菌落挑取至IF-C液中，制備為菌懸液，濁度為62%～68%。將菌懸液加入微孔板的所有孔中，37℃恒溫培養(yǎng)16～48 h，使用Biolog自動微生物鑒定系統(tǒng)進行鑒定[10，18]。測序結(jié)果用基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）軟件與GenBank數(shù)據(jù)庫中已收錄的基因序列進行同源性比較[25-26]。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的篩選

將經(jīng)過分離純化所獲得的菌株進行培養(yǎng)后，根據(jù)前期實驗確定的色譜條件，采用高效液相色譜法對稀釋后的菌株發(fā)酵液中的乳酸進行檢測，獲得的典型RT-HPLC色譜圖見圖1。

圖1 乳酸標(biāo)準品與檢測樣品的反相高效液相色譜圖Fig.1 RT-HPLC chromatograms of lactic acid standard solution and sample

由圖1可知，乳酸的保留時間為12.5 min，根據(jù)乳酸標(biāo)準品的出峰時間及峰面積，獲得產(chǎn)乳酸的菌株，并對篩選所得菌株進行革蘭氏染色和過氧化氫實驗，將革蘭氏染色陽性，過氧化氫酶實驗陰性的菌株初步確定為乳酸菌。

2.2 降解抗生素菌株的篩選及復(fù)篩

在前期確定的最優(yōu)色譜條件下，將乳酸菌發(fā)酵液離心后，取上清液稀釋并過濾后進行色譜分析，采用UPLC-MS/MS對抗生素質(zhì)量濃度進行測定。取質(zhì)量濃度為8 mg/L的培養(yǎng)物劃線接種于含相應(yīng)抗生素的固體平板上進行培養(yǎng)后，獲得降解多種抗生素殘留（包括紅霉素、羅紅霉素、螺旋霉素等）效果較好的乳酸菌株P(guān)3-4，其對不同質(zhì)量濃度抗生素的降解能力見圖2。

由圖2可知，與對照相比，在紅霉素質(zhì)量濃度為3 mg/L、羅紅霉素及螺旋霉素質(zhì)量濃度為9 mg/L時，菌株P(guān)3-4降解能力開始下降。

圖2 菌株P(guān)3-4對不同濃度的紅霉素(a)、羅紅霉素(b)及螺旋霉素(c)的降解能力Fig.2 Degradation ability of strain P3-4 to different concentrations of erythromycin(a),roxithromycin(b)and spiramycin(c)

2.3 菌體對抗生素降解能力的檢測

根據(jù)UPLC-MS/MS對菌株P(guān)3-4發(fā)酵液中抗生素濃度的測定結(jié)果，菌株P(guān)3-4對紅霉素、羅紅霉素、螺旋霉素的降解曲線如圖3所示。

圖3 菌株P(guān)3-4的紅霉素(a)、羅紅霉素(b)、螺旋霉素(c)降解曲線Fig.3 Degradation curves of erythromycin(a),roxithromycin(b)and spiramycin(c)of strain P3-4

由圖3可知，隨著培養(yǎng)時間的延長，菌株P(guān)3-4對紅霉素的降解效果顯著提高，在第1天即達到92.1%；對羅紅霉素的降解能力逐漸提高，培養(yǎng)至第5天可達到68.9%。菌株對螺旋霉素的降解能力逐漸提高，培養(yǎng)至第5天可達到82.8%。結(jié)果表明，菌株對紅霉素、羅紅霉素、螺旋霉素均具有一定的降解作用，對紅霉素、螺旋霉素降解作用較強，強于對羅紅霉素的降解作用。

2.4 菌株鑒定

圖4 菌株P(guān)3-4的鏡檢結(jié)果Fig.4 Microscopy results of strain P3-4

由圖4可知，菌株P(guān)3-4鏡檢形態(tài)為革蘭氏陽性球菌。提取菌株P(guān)3-4基因組DNA，擴增其16S rDNA基因序列，進行測序。與GenBank數(shù)據(jù)庫中已收錄的基因序列進行同源性比較分析，使用MEGA 5.10軟件計算序列相似性并作系統(tǒng)發(fā)育分析，構(gòu)建菌株P(guān)3-4的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖5。

圖5 基于16S rDNA序列建立的菌株P(guān)3-4的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of strain P3-4 based on 16S rDNA sequences

由圖5可知，菌株P(guān)3-4與乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）處于同一進化分支上，兩者核苷酸序列具有最高的同源性，達到99%以上，初步確定為乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）。

根據(jù)Biolog自動微生物鑒定系統(tǒng)對菌株P(guān)3-4的鑒定，得出四個最可能的鑒定結(jié)果。每個結(jié)果均顯示三種重要的參數(shù)，即可能性，相似度指數(shù)和位距。相似度指數(shù)值表示了測試結(jié)果與數(shù)據(jù)庫相應(yīng)的數(shù)據(jù)條的匹配程度。只有當(dāng)相似度指數(shù)＞0.50時，鑒定結(jié)果才能被接受。鑒定結(jié)果顯示與乳酸片球菌相似度指數(shù)為0.631＞0.50。結(jié)合16S rDNA基因序列結(jié)果確定菌株P(guān)3-4為乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici），結(jié)果見表2。保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏編號為：CGMCC No.10574。

表2 菌株P(guān)3-4的Biolog鑒定結(jié)果Table 2 Identification results of P3-4 using Biolog

3 結(jié)論

通過采用微生物方法與化學(xué)方法相結(jié)合的方式建立了篩選乳酸菌的新方法，通過乳酸菌的分離純化以及篩選，抗生素選擇培養(yǎng)基初篩以及復(fù)篩，通過UPLC-MS/MS法對菌株發(fā)酵液的分析，從土壤中篩選出一株乳酸菌P3-4，鑒定為乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）。乳酸菌P3-4在MRS培養(yǎng)基中對抗生素具有分解能力，對紅霉素、羅紅霉素與螺旋霉素的降解率分別能達到92.1%、68.9%和82.8%。本研究建立了合理、有效的多種抗生素殘留降解菌株的篩選方法，得到適合需要的乳酸菌株。應(yīng)用于紅霉素、羅紅霉素以及螺旋霉素污染的治理，可對所添加藥物殘留進行有效降解，具有處理效率高、適應(yīng)范圍廣、成本低的優(yōu)點。為微生物治理復(fù)雜環(huán)境的抗生素污染提供更多選擇。

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Screening and identification of multi-antibiotics-degrading lactic acid bacteria and study on its characteristics

HAO Ying,SUN Jun*,ZENG Jinjin,ZHAO Han
(Weifang Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Weifang 261041,China)

To study and screen the hight effective antibiotics-degrading lactic acid bacteria,a lactic acid bacteria strain P3-4 was isolated from soil by HPLC and microbiology methods.According to the colonies,cells morphology,the results of the Biolog automated microbial analysis system and 16S rDNA gene sequence similarity analysis,the isolated strain P3-4 was identified asPediococcus acidilactici.The strain P3-4 had the antibiotics degradation ability in MRS medium,and could degrade erythromycin,roxithromycin and spiramycin.The degradation rate of erythromycin,roxithromycin and spiramycin were 92.1%,68.9%,and 82.8%,respectively.These results had theoretical support for the further development and use of strain P3-4.

antibiotics;degradation;lactic acid bacteria;identification;UPLC-MS/MS

TS201.3

0254-5071（2017）10-0104-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.10.022

2017-08-03

山東檢驗檢疫局科研項目計劃（SK201217）

郝 瑩（1983-），女，工程師，碩士，研究方向為微生物學(xué)。

*通訊作者：孫 軍（1970-），男，研究員，本科，研究方向為食品科學(xué)。