阮東+郭麗蕊+王芳+袁凡恩+陳謙學(xué)+劉寶輝

[摘要] 目的 探討銅離子代謝結(jié)構(gòu)域包含體1（COMMD1）在膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87中的作用及機(jī)制。 方法 使用siRNA敲低U87細(xì)胞內(nèi)COMMD1的表達(dá)量，使用CCK8檢測細(xì)胞增殖能力，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率，免疫印跡技術(shù)檢測p65、cleaveage-caspase3及BAD蛋白表達(dá)量。 結(jié)果 CCK-8結(jié)果顯示，0、1、2、3 d時siNC組U87細(xì)胞活力為（0.401±0.001）、（0.452±0.002）、（0.621±0.002）、（0.823±0.003），siCOMMD1組為（0.402±0.000）、（0.510±0.001）、（1.021±0.002）、（1.612±0.002），兩組相比，在2、3 d時細(xì)胞活力差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，兩組細(xì)胞凋亡率為（7.121±0.520）%和（2.214±0.325）%，siNC組高于siCOMMD1組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。Western blot結(jié)果顯示，下調(diào)COMMD1后，p65蛋白表達(dá)增加40.132%，BAD表達(dá)量增加90.157%，cleaveage-caspase3表達(dá)減少56.169%。 結(jié)論 COMMD1可以調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87的凋亡與增殖。

[關(guān)鍵詞] 銅離子代謝結(jié)構(gòu)域包含體1；增殖；凋亡

[中圖分類號] R739.4 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）10（b）-0004-04

The effect of copper metabolism domain containing 1 in U87 cells proliferation and apoptosis and mechanism study

RUAN Dong1 GUO Lirui2 WANG Fang2 YUAN Fan′en2 CHEN Qianxue2▲ LIU Baohui2▲

1.Department of Neurological Surgery， the First Affiliated Hospital of Hubei University of Science and Technology Xianning Central Hospital， Hubei Province， Xianning 437100， China； 2.Department of Neurological Surgery， Renmin Hospital of Wuhan University， Hubei Province， Wuhan 430060， China

[Abstract] Objective To study the biological function of copper metabolism domain containing 1（COMMD1） in glioma cells U87 and its mechanism. Methods siRNA transfection was applied to knock down COMMD1 expression in U87 cells. CCK-8 and flow cytometry analysis were employed to examine glioma cells proliferation and apoptosis after COMMD1 was knocked down. Western blot was used to detect the expression of p65， cleaveage-caspase3 and BAD levels. Results Data showed that when COMMD1 was knocked down by siCOMMD1， the CCK8 results of siCOMMD1 were （0.402±0.000）， （0.510±0.001）， （1.021±0.002）， （1.612±0.002）， while the CCK8 results of siNC were （0.401±0.001）， （0.452±0.002）， （0.621±0.002）， （0.823±0.003） at 0， 1， 2， 3 d； there were significantly differences in cell viabilities between the two group at 2 d and 3 d （P < 0.05）. Flow cytometry analysis results showed that the apoptosis rate of cells in siCOMMD1 group and siNC group was （2.214±0.325）% and （7.121±0.520）%， there was significantly difference between the two group （P < 0.05）. Western blot results showed that the expression of p65 and BAD increased 40.132% and 90.157%， cleaveage-caspase3 decreased 56.169% when COMMD1 was knocked down. Conclusion COMMD1 can regulate U87 cells apoptosis and proliferation.

[Key words] Copper metabolism domain containing 1； Proliferation； Apoptosisendprint

膠質(zhì)瘤是成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見最致命的原發(fā)性惡性腫瘤，具有高發(fā)病率、高死亡率和預(yù)后差的特點(diǎn)[1- 2]，尤其是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，其中位生存時間不足1年，主要是因?yàn)槟z質(zhì)瘤具有異常增殖、侵襲和抗凋亡的特點(diǎn)[3-5]，而機(jī)制尚不清楚。目前認(rèn)為，膠質(zhì)瘤治療效果的提高依賴于對其分子機(jī)制的進(jìn)一步研究[6-7]。本研究通過siRNA轉(zhuǎn)染人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87來敲低COMMD1的表達(dá)，研究膠質(zhì)瘤異常增殖與凋亡的機(jī)制，對于探討膠質(zhì)瘤發(fā)生機(jī)制，進(jìn)而提高膠質(zhì)瘤治療效果有重要意義。

1 資料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)及siRNA轉(zhuǎn)染

人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U87購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。本實(shí)驗(yàn)所使用的靶向COMMD1 siRNA及對照（si Negative control，siNC）均購自上海吉瑪基因。詳細(xì)細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染方法參考文獻(xiàn)[8-9]。

1.2 熒光定量PCR及免疫印跡實(shí)驗(yàn)

anti-COMMD1、anti-p65、anti-cleaveage-caspase3、anti-BAD及anti-GAPDH均購自Santa Cruze。具體實(shí)驗(yàn)方法參考文獻(xiàn)[10]。熒光定量PCR結(jié)果使用公式2-ΔΔCt進(jìn)行計算。

1.3 Cell Counting Kit-8（CCK8）及流式細(xì)胞術(shù)

具體實(shí)驗(yàn)方法參考文獻(xiàn)[11]。CCK8結(jié)果計算方法為測試組CCK8值-空白組CCK8值，空白組為無腫瘤細(xì)胞，只加入培養(yǎng)基。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染siCOMMD1對U87細(xì)胞COMMD1 mRNA表達(dá)量的影響

熒光定量PCR結(jié)果顯示，siNC組與siCOMMD1組U87細(xì)胞COMMD1 mRNA相對表達(dá)量分別為1、0.271±0.022，兩組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見圖1。

2.2 下調(diào)COMMD1對膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87增殖的影響

CCK-8結(jié)果顯示，在0、1、2、3 d時siNC組的U87細(xì)胞活力為（0.401±0.001）、（0.452±0.002）、（0.621±0.002）、（0.823±0.003）；siCOMMD1組的U87細(xì)胞活力為（0.402±0.000）、（0.510±0.001）、（1.021±0.002）、（1.612±0.002），兩組相比，在2、3 d時細(xì)胞活力差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見圖2。

2.3 下調(diào)COMMD1對膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，siNC組的U87細(xì)胞凋亡率為（7.121±0.520）%，siCOMMD1組細(xì)胞凋亡率為（2.214±0.325）%，兩組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見圖3。

2.4 下調(diào)COMMD1對凋亡相關(guān)蛋白及p65表達(dá)量的影響

免疫印跡結(jié)果顯示，下調(diào)COMMD1后，siCOMMD1組p65蛋白表達(dá)增加40.132%，BAD表達(dá)量增加 90.157%，cleaveage-caspase3表達(dá)減少56.169%。見圖4。

3 討論

COMMD家族蛋白作為體內(nèi)許多生理功能的調(diào)控因子，對于維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)有著重要的作用，其與人體的生物學(xué)特性有著密切聯(lián)系[12-14]。COMMD1是COMMD家族的一個重要成員，可以通過參與泛素-蛋白酶體通路調(diào)節(jié)銅代謝、NF-κb通路活性、細(xì)胞周期等，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[15]。有研究表明，上調(diào)核內(nèi)COMMD1表達(dá)可以增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞對順鉑的敏感性[7]，但其在膠質(zhì)瘤中的作用尚不清楚。本研究結(jié)果顯示，U87細(xì)胞中敲低COMMD1，細(xì)胞增殖能力在2、3 d時明顯增強(qiáng)，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），提示敲低COMMD1可以提高細(xì)胞增殖能力。而流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，敲低COMMD1后，細(xì)胞凋亡率明顯降低，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），提示在膠質(zhì)瘤中COMMD1可能為抑癌基因，表達(dá)降低可以促進(jìn)細(xì)胞增殖，抵抗細(xì)胞凋亡。雖然目前尚無COMMD1在膠質(zhì)瘤中是抑癌基因的報道，但已經(jīng)有文獻(xiàn)報道，在B淋巴細(xì)胞中，COMMD1低表達(dá)是預(yù)后差的重要原因[16]。在肝癌中，COMMD1與腫瘤分化程度及發(fā)展有關(guān)，可為判斷病理分級及臨床分期提供參考[17]。在成神經(jīng)細(xì)胞瘤，COMMD1可以抑制細(xì)胞的生長[18]，卵巢癌中可以提高對順鉑的敏感性[19]。雖然不能從COMMD1在肝癌、成神經(jīng)細(xì)胞瘤及卵巢癌中是抑癌基因推斷出其在膠質(zhì)瘤中也是抑癌基因，但以上結(jié)果，至少從側(cè)面支持本研究觀點(diǎn)。

COMMD1在膠質(zhì)瘤中調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡的機(jī)制尚未見相關(guān)報道，但已有文獻(xiàn)報道COMMD1可以通過泛素化途徑調(diào)節(jié)p65的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)NF-κB信號通路[15]。在成神經(jīng)細(xì)胞瘤中，其可以通過促進(jìn)NF-κB信號通路的p65降解，從而抑制NF-κB信號通路[18]。本研究結(jié)果顯示：在膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87中，敲低COMMD1，NF-κB信號通路的重要蛋白p65表達(dá)量明顯升高，提示COMMD1可以激活NF-κB信號通路。而NF-κB信號通路在膠質(zhì)瘤中發(fā)揮重要作用，抑制NF-κB信號通路活性可以促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡，抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖[20-22]。據(jù)此推測，COMMD1可能是通過抑制NF-κB信號通路抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)，敲低COMMD1，膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87的增殖能力增強(qiáng)，凋亡能力降低，其在膠質(zhì)瘤中可能為抑癌基因，機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)NF-κB信號通路實(shí)現(xiàn)的。

[參考文獻(xiàn)]endprint

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（收稿日期：2017-07-03 本文編輯：程 銘）endprint