王靜涵 肖向紅柴龍會(huì) 王伯駒 徐美瑤 曲俐俐

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)稿件運(yùn)行過程

三種林蛙油內(nèi)重金屬的含量測(cè)定及食用安全性評(píng)價(jià)

王靜涵 肖向紅*柴龍會(huì) 王伯駒 徐美瑤 曲俐俐

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)稿件運(yùn)行過程

林蛙油；東北林蛙；黑龍江林蛙；中國(guó)林蛙；重金屬；安全性評(píng)價(jià)

為初步了解林蛙油重金屬的污染現(xiàn)狀，采集東北林蛙、黑龍江林蛙和中國(guó)林蛙的林蛙油，以濕法消化法消化，利用熒光比色法測(cè)定錫含量、原子吸收法分別檢測(cè)鎘、鉻、銅和鉛的含量，并采用單因子污染指數(shù)及每周可耐受攝入量分別評(píng)價(jià)5種重金屬在3種林蛙油中的污染程度并對(duì)其食用安全進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，該批次樣品中東北林蛙蛙油重金屬含量分別為錫10～20、鎘50～90、鉻670～720、銅100～250和鉛60～90 μg/kg；黑龍江林蛙蛙油重金屬含量分別為錫12～22、鎘80～110、鉻700～820、銅150～250和鉛80～100 μg/kg；中國(guó)林蛙蛙油重金屬含量分別為錫2～10、鎘30～60、鉻590～700、銅800～130和鉛30～60 μg/kg，5種金屬分別在3種林蛙油內(nèi)的含量差異顯著。單因子污染指數(shù)結(jié)果顯示3種林蛙油中錫、鉛的含量均未超過輕度污染指數(shù)；鉻、鎘的含量，除中國(guó)林蛙蛙油中鉻為輕度污染，其余皆為中度污染，根據(jù)樣本數(shù)據(jù)可知僅黑龍江林蛙油鎘超標(biāo)40%，其余皆在食品污染物限量國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)范圍之內(nèi)。根據(jù)每周可耐受攝入量評(píng)定，其結(jié)果顯示3種林蛙油的食用風(fēng)險(xiǎn)依次是鉻>鎘>銅>鉛>錫。因此本批次所檢測(cè)的林蛙油可食性良好，但仍有必要監(jiān)測(cè)林蛙油中鎘、鉻的含量。

林蛙油(Oviductus ranae)，又稱哈士蟆油，是雌性林蛙輸卵管干制而成的淡黃色固體，其形態(tài)主要有兩種，塊狀(由傳統(tǒng)工藝制得)和線狀(由現(xiàn)代工藝制得)。林蛙油的主要成分為蛙醇，是我國(guó)一種名貴的中藥藥材，據(jù)中國(guó)藥典記載，林蛙油可用于體虛體弱、疲憊乏力、心悸失眠、盜汗、咳血等癥狀的治療，亦具有補(bǔ)腎潤(rùn)肺的功效[1]。林蛙油具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，富含豐富的蛋白質(zhì)(占蛙油總量的56.3%)、氨基酸和維生素[2-3]，受到國(guó)內(nèi)外消費(fèi)者的廣泛歡迎，資源極為稀缺。自20世紀(jì)70年代初期，我國(guó)東北地區(qū)開始發(fā)展林蛙養(yǎng)殖業(yè)，于90年代逐漸興起，現(xiàn)已遍布東北各地，并開始嘗試向南部發(fā)展[4]。隨著林蛙養(yǎng)殖業(yè)的興起，其相關(guān)產(chǎn)品食用安全越來越受到人們的重視。

重金屬污染是我國(guó)重要的環(huán)境污染問題之一，其通過食物鏈的傳遞作用逐漸富集于各生物體中，重金屬不易被機(jī)體吸收及排除掉，且含量過高會(huì)引起機(jī)體的損傷，然而重金屬引起的損傷要在重金屬積累到一定程度上才開始顯現(xiàn)，不能在積累早期對(duì)其預(yù)防，因此其危害性十分嚴(yán)重[5-6]。重金屬根據(jù)機(jī)體對(duì)其的需要分為兩種，一種為不可被吸收的有毒元素，如錫、鎘、鉻、鉛等；另一種是被機(jī)體需要，但過量依然會(huì)對(duì)機(jī)體造成損傷的生命必須元素，如銅等[7]。林蛙在生活過程中從水和食物中吸收并積累這種重金屬元素，人類通過食用林蛙油使一部分重金屬轉(zhuǎn)移到體內(nèi)，林蛙油內(nèi)重金屬含量過高，可能會(huì)引起人們的健康傷害，因此監(jiān)測(cè)林蛙油內(nèi)重金屬的含量，研究林蛙油的食用安全性具有十分重要的作用。

本研究選取東北林蛙(Ranadybowskii)、黑龍江林蛙(Ranaamurensis)、中國(guó)林蛙(Ranachensinensis)的林蛙油產(chǎn)品。采用熒光比色法、原子吸收光譜法分別測(cè)定林蛙油中錫、鎘、鉻、銅和鉛的含量，并采用單因子污染指數(shù)及每周可耐受攝入量對(duì)林蛙油的食用安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)，為林蛙油的安全食用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

從哈爾濱市場(chǎng)上隨機(jī)采集野生的3齡的東北林蛙、中國(guó)林蛙和黑龍江林蛙，每種蛙50只，將林蛙油從林蛙體內(nèi)取出，用干凈的蒸餾水清洗掛在干凈的細(xì)線上，置于烘箱內(nèi)37℃烘24 h。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品選取及初步制備

隨機(jī)抽取3種林蛙油各10個(gè)，將選取的蛙油置于研缽中研磨，放置于EP管中-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 儀器及試劑

紫外可見分光光度計(jì)(安瑪西亞UV2100)、電熱干燥箱(南京實(shí)驗(yàn)儀器廠)、石墨爐原子吸收儀AA240Z(美國(guó)瓦里安中國(guó)有限公司)、電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)、電加熱爐(寧波凱迪科教儀器有限公司)。

酒石酸、酚酞指示劑、抗壞血酸、動(dòng)物膠、苯芴酮、濃硝酸(優(yōu)級(jí)純)、硫酸(優(yōu)級(jí)純)、氨水、去離子水、錫標(biāo)準(zhǔn)液、鎘標(biāo)準(zhǔn)液、鉻標(biāo)準(zhǔn)液、銅標(biāo)準(zhǔn)液、鉛標(biāo)準(zhǔn)液。

1.2.3 樣品消化

稱取上述樣品1 g(精確到0.001 g)，置于錐形瓶中，加入15 mL硫酸、45 mL硝酸，加蓋浸泡過夜，放置于電爐上加熱蒸餾消解，至溶液澄清透明后停止加熱，濾于100 mL容量瓶中，用去離子水定容至刻度，混勻備用；同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組。

1.2.4 重金屬測(cè)定方法

重金屬含量按相關(guān)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定，具體方法見表1。

表1 重金屬檢測(cè)方法

Tab.1 Detection method of heavy metals

1.2.4.1 錫含量測(cè)定方法

取 0.00、0.20、0.40、0.60、0.80，1.00 mL錫的標(biāo)準(zhǔn)液制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取10 mL待測(cè)液體于錐形瓶中，加100 g /L的酒石酸0.5 mL，滴入1滴酚酞指示劑，用氨水將混合液中和至淡紅色，加90%的硫酸3 mL，加5 g/L動(dòng)物膠1 mL，加10 g/L 抗壞血酸2.5 mL，用加去離子水定容至25 mL，向混合液中0.1 g/L苯芴酮2 mL做指示劑，吹打均勻，放置室溫下1 h，490 nm測(cè)吸光值。

1.2.4.2 鉻、鎘、銅、鉛含量測(cè)定方法

分別取 0.00、0.20、0.40、0.60、0.80，1.00 mL鉻、鎘、銅和鉛的標(biāo)準(zhǔn)液制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。實(shí)驗(yàn)條件見表2。

表2 儀器參數(shù)

Tab.2 Instrument parameters

續(xù)表2

注：背景校正為氘燈或塞曼效應(yīng)

Note：The background is corrected for deuterium or Zeeman effect

1.3 重金屬污染程度評(píng)價(jià)方法

采用單因子污染指數(shù)對(duì)不同林蛙油中重金屬的污染狀況進(jìn)行評(píng)價(jià)，計(jì)算公式如下：

Pi=Ci/Si

式中：Pi為第i種重金屬的污染指數(shù)；Ci為第i種重金屬在樣品中測(cè)量的平均值(mg/kg)；Si為第i種重金屬在國(guó)家規(guī)范中的限量標(biāo)準(zhǔn)值(mg/kg)，在本實(shí)驗(yàn)中錫、鎘、鉻和鉛用國(guó)家級(jí)限量標(biāo)準(zhǔn)中的限量值[13](表4)。

具體評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)為：當(dāng)Pi<0.2時(shí)重金屬含量在正常背景范圍內(nèi)；當(dāng)0.2≤Pi<0.6時(shí)重金屬含量為輕度污染水平；當(dāng)0.6≤Pi<1時(shí)重金屬含量為中度污染水平；當(dāng)Pi≥1時(shí)重金屬含量為重度污染水平，將重度污染水平作為超標(biāo)指標(biāo)。

1.4 數(shù)據(jù)處理方式

通過SPSS軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式表示。各個(gè)組分間比較采用Tukey檢驗(yàn)法，對(duì)差異進(jìn)行多重比較，P<0.05時(shí)為差異顯著。

2 結(jié)果及分析

2.1 重金屬在3種林蛙油內(nèi)的含量平均值及差異顯著性(μg/kg)

表3 重金屬在3種林蛙油內(nèi)的含量及差異比較

Tab.3 Contents and comparison of heavy metals in three species of oviductus ranae

注：同行不同字母表示差異顯著(P<0.05)

Note：Different letters on the same line indicate significant differences(P<0.05)

通過SPSS軟件對(duì)3種林蛙油內(nèi)各金屬含量差異性進(jìn)行分析，結(jié)果如表3所示，各金屬在3種林蛙油中差異顯著性各不相同，錫在中國(guó)林蛙蛙油內(nèi)含量<東北林蛙蛙油和黑龍江林蛙蛙油內(nèi)的(P<0.05)；鎘在中國(guó)林蛙蛙油內(nèi)含量<東北林蛙蛙油內(nèi)的<黑龍江林蛙蛙油內(nèi)的(P<0.05)；鉻在東北林蛙蛙油和中國(guó)林蛙蛙油內(nèi)含量<黑龍江林蛙蛙油內(nèi)的(P<0.05)；銅在中國(guó)林蛙蛙油內(nèi)含量<黑龍江林蛙蛙油內(nèi)的(P<0.05)；鉛在中國(guó)林蛙蛙油內(nèi)含量<東北林蛙蛙油和黑龍江林蛙蛙油內(nèi)的(P<0.05)。雖然3種蛙油內(nèi)各金屬差異顯著性不同，但每種金屬在3種蛙油內(nèi)的含量均在一定范圍內(nèi)。

2.2 林蛙油內(nèi)重金屬污染程度

采用單因子污染指數(shù)對(duì)林蛙油內(nèi)4種重金屬的污染程度進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果如表4所示，3種林蛙油中錫、鉛的污染指數(shù)值均小于0.2，表明3種林蛙油內(nèi)錫、鉛含量均處于正常背景范圍內(nèi)，3種林蛙油內(nèi)鉻、鎘的污染指數(shù)，除中國(guó)林蛙蛙油內(nèi)鉻的污染指數(shù)范圍在0.2≤Pi<0.6之間為輕度污染水平，其余污染指數(shù)值范圍均在0.6≤Pi<1之間為中度污染水平，在3種林蛙油中并未出現(xiàn)重度污染水平，平均值水平無超標(biāo)現(xiàn)象，均表現(xiàn)為良好的安全食用性。

表4 3種林蛙油內(nèi)重金屬污染指數(shù)值

Tab.4 Pollution index of heavy metals in three species of oviductus ranae

注：根據(jù)2011年第3號(hào)中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)公告，廢止銅限量標(biāo)準(zhǔn)，銅不做此分析用“—”表示

Note：According to the 2011 China National Standard Notice，copper limit standards were abolished，so the copper does not analyze，use “—” to display

2.3 重金屬含量范圍及超標(biāo)率

表5 3種林蛙油內(nèi)重金屬含量范圍及超標(biāo)率

Tab.5 Content range and excessive rate of heavy metals in three species of oviductus ranae

注：銅不做此分析用“—”表示

Note：The copper does not analyze，use “-” to display

根據(jù)超標(biāo)率對(duì)3種林蛙油的食用安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)(表5)，除黑龍江蛙油內(nèi)鎘含量超標(biāo)40%外，其余均無超標(biāo)現(xiàn)象。根據(jù)各重金屬含量范圍及樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，3種林蛙油污染程度都很低。雖僅黑龍江林蛙蛙油內(nèi)出現(xiàn)鎘超標(biāo)現(xiàn)象，但是東北林蛙蛙油中的一部分鎘金屬含量亦接近限量值，值得關(guān)注。根據(jù)超標(biāo)率對(duì)其評(píng)價(jià)表現(xiàn)為本批次樣品中黑龍江林蛙蛙油的食用安全性較低，而東北林蛙蛙油和中國(guó)林蛙蛙油表現(xiàn)出較高的食用安全性。

2.4 林蛙油食用風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)

根據(jù)文獻(xiàn)[14]已知飲食中錫的攝入量為不超過2 500 μg/d，根據(jù)“世界衛(wèi)生組織/聯(lián)合國(guó)糧食和農(nóng)業(yè)組織的食品添加劑聯(lián)合專家委員會(huì)(JECFA)推薦的暫定每周耐受攝入量”[15]鎘的攝入量每周不超過體重的7 μg/kg，參考《中國(guó)居民膳食營(yíng)養(yǎng)素參考攝入量》可知[16]鉻攝入量(18～80歲之間)不超過30 μg/d，銅攝入量(18～80歲之間)不超過800 μg/d，根據(jù)文獻(xiàn)[17]鉛每日攝入量不超過體重的19.3 μg/kg；本實(shí)驗(yàn)記成人體重為60 kg。相當(dāng)于成人每周攝入不超過17 500 μg的錫、210 μg的鉻、420 μg的鎘、5 600 μg的銅以及8 106 μg的鉛。以重金屬污染平均含量(表3)計(jì)算，以錫、鎘、鉻、銅和鉛為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，成人每周允許最大攝入量(表6)，以每年52周計(jì)算其每年允許最大攝入量(表7)，以允許最大攝入量越少為食用越危險(xiǎn)，結(jié)果顯示，3種林蛙油的重金屬食用超標(biāo)風(fēng)險(xiǎn)依次是鉻>鎘>銅>鉛>錫。

表6 每周允許3種林蛙油攝入量(kg)

Tab.6 Three species of oviductus ranae allowable intake per week

表7 每年允許3種林蛙油攝入量(kg)

Tab.7 Three species of oviductus ranae allowable intake per year

3 討論

根據(jù)中華人民共和國(guó)食品安全法第三章第二十條，由于重金屬對(duì)人體健康存在危害性，其在各物質(zhì)中的含量需要限制在一定范圍內(nèi)。重金屬一般以化合態(tài)的形式存在[18]，因此，檢測(cè)元素需轉(zhuǎn)變?yōu)殡x子狀態(tài)才能對(duì)重金屬的含量進(jìn)行準(zhǔn)確客觀地分析。黑龍江林蛙、東北林蛙和中國(guó)林蛙蛙油內(nèi)5種重金屬含量差異均不相同，從5種重金屬(銅限量被廢止)含量數(shù)據(jù)可知，所有重金屬的元素均值均小于國(guó)家食品污染物限量標(biāo)準(zhǔn)，分析單因子污染指數(shù)結(jié)果，鉻、鎘在3種林蛙油中除中國(guó)林蛙蛙油中鉻污染為輕度污染外，其余均為中度污染，并且在黑龍江蛙油內(nèi)出現(xiàn)鎘超標(biāo)40%現(xiàn)象，東北林蛙蛙油中亦有一部分鎘含量接近限量值。本實(shí)驗(yàn)所用林蛙隨機(jī)采集于市場(chǎng)內(nèi)且全部來自于黑龍江境內(nèi)的野生產(chǎn)品，根據(jù)文獻(xiàn)知東北林蛙主要棲息在林木繁密茂盛、雜草叢生、地面比較潮濕的山上[19]；黑龍江林蛙主要棲息在平原或開闊地帶的水塘、沼澤、水溝等水域中[20]；中國(guó)林蛙棲息在林內(nèi)繁密茂盛、枯枝落葉較多、空氣濕潤(rùn)，且有溪流溝谷的山上[21]，其棲息環(huán)境中水源、食物等因素均會(huì)引起這些重金屬富集的差異，林蛙個(gè)體形態(tài)大小的差異及冬眠時(shí)間的長(zhǎng)短等因素也可能是引起重金屬富集差異的因素[22]。本實(shí)驗(yàn)中東北林蛙可能是由于棲息地附近水源及其環(huán)境有一定的鎘污染或鎘含量較高，造成其體內(nèi)富集較多，其次3種林蛙對(duì)食物及水分的攝取存在一定的差異，攝取食物及水分的多少直接影響攝取物內(nèi)重金屬的亦可能是造成這一結(jié)果的原因。

對(duì)林蛙油食用風(fēng)險(xiǎn)做出評(píng)價(jià)，可以看出食用 3種林蛙油的重金屬超標(biāo)風(fēng)險(xiǎn)依次是鉻>鎘>銅>鉛>錫，3種林蛙油內(nèi)對(duì)于鉻、鎘的富集程度要遠(yuǎn)強(qiáng)于其他金屬，由于目前并沒有人對(duì)國(guó)內(nèi)外蛙油產(chǎn)品消費(fèi)市場(chǎng)及人均消費(fèi)蛙油量進(jìn)行具體研究，無法得出人均基于消費(fèi)習(xí)慣的食用風(fēng)險(xiǎn)研究。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)對(duì)象選擇的是3齡的林蛙，但市場(chǎng)上還有一部分林蛙油是產(chǎn)自于4齡或5齡的林蛙，由于其對(duì)重金屬的富集程度強(qiáng)于3齡的林蛙，因此可能出現(xiàn)鎘和鉻金屬含量超標(biāo)的情況，需要進(jìn)一步進(jìn)行研究及分析。

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Oviductus ranae；Ranadybowskii；Ranaamurensis；Ranachensinensis；Heavy metals；Safety evaluation

Heavy Metals in Oviductus Ranae and Its Safety as a Food Product

Wang Jinghan Xiao Xianghong*Chai Longhui Wang Boju Xu Meiyao Qu Lili

(Northeast Forestry University，Harbin，150040，China)

To understand the heavy metals pollution in oviductus ranae(dried fatty tissues of true frogs)ofRanadybowskii，RanaamurensisandRanachensinensis，oviductus ranae was collected and digested by a wet digestion method.The Sn content was assayed by the fluorescence colorimetric method.Cd、Cr、Cu and Pb contents were determined by the atomic absorption method.The single-factor pollution index and weekly tolerable intake were used to evaluate the pollution degree of the five heavy metals in three species of oviductus ranae and its safety as a food product.The content of heavy metals in samples fromRanadybowskiiwere Sn 10-20 μg/kg，Cd 50-90 μg/kg，Cr 670-720 μg/kg，Cu 100-250 μg/kg and Pb 60-90 μg/kg.The content of heavy metals in samples fromRanaamurensiswere Sn 12-22 μg/kg，Cd 80-110 μg/kg，Cr 700-820 μg/kg，Cu 150-250 μg/kg and Pb 80-100 μg/kg.The content of heavy metals in samples fromRanaamurensiswere Sn 2-10 μg/kg，Cd 30-60 μg/kg，Cr 590-700 μg/kg，Cu 800-130 μg/kg，and Pb 30-60 μg/kg.Metal contents differed by frog species.The results of single factor pollution index showed that the content of Sn and Pb in the three species of oviductus ranae did not exceed the mild pollution index.The contents of Cr and Cd classified the samples as mildly polluted.Only Cd in oviductus ranae ofRanaamurensisexceeded the nationa standard of 40%.The other samples did not exceed the national standard.According to the weekly tolerable intake assessment，the results showed that the three species of oviductus ranae consumption ranked in descending order as Cr >Cd>Cu>Pb>Sn.Thus，the edible oviductus ranae was considered edible，but it remains necessary to monitor the content of Cd and Cr.

2017-03-15

修回日期：2017-05-20

發(fā)表日期：2017-11-10

Q959.5

A

2310-1490(2017)04-648-06

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31672309)，國(guó)家林業(yè)局珍稀瀕危物種野外救護(hù)與繁育專項(xiàng)(東北林蛙產(chǎn)品質(zhì)量技術(shù)規(guī)程)

王靜涵，女，27歲，碩士研究生；主要從事野生動(dòng)物生理學(xué)研究。

*通訊作者：肖向紅，E-mail：xiaoxh2010@sina.com